专利名称：一种菌酶联合修复土壤ddt污染的方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤DDT污染的生物修复方法，特别是一种利用白腐菌一游离漆 酶联合修复土壤中DDT污染的方法。
背景技术：
有机氯农药DDT (双对氯苯基三氯乙烷)作为一种高效的杀虫剂曾被广泛使用， 但由于其具有高毒和高残留性，因此，DDT已在2001年联合国环境规划署(UNEP)通过的 《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》中要求全球统一行动优先控制和消除的12种 持久性有机污染物(POPs)之一。尽管中国早在1983年就停用DDT，但由于DDT仍被用作 疟疾防治药剂或农药三氯杀螨醇的原料，导致环境中不断有新的DDT输入，所以土壤中仍 有大量的DDT残留。一些地区土壤中残留的DDT浓度远远超出国家土壤质量标准(GB/T 18407-2001)。DDT可通过食物链在脂肪中积累，严重干扰人体内分泌系统，引发生殖障碍，甚至 导致“三致”(致癌、致畸、致突变)作用。鉴于DDT可通过食物链给农产品安全和人体健康 带来的潜在危害，开发有效修复土壤DDT污染的修复方法是十分紧迫的。近年来，一些物理的、化学的和生物的修复方法已被应用于土壤DDT污染的清除。 与传统的物理、化学方法相比，生物修复技术是利用特定的生物(植物、微生物或原生动物 等)吸收、转化、清除或降解农药污染物，从而实现土壤净化、生态效应恢复的生物技术，是 一种公认的有效、安全、廉价和无二次污染的方法而日益受到重视。上述不同生物修复技术 本身也还存在各种缺陷亟待进一步研究解决，如植物修复需要的时间可能过长、微生物修 复存在接种微生物与土著微生物的竞争问题、接种微生物更多地是利用土壤本源有机物而 不是污染物作为底物问题、在DDT浓度较低时修复效果欠佳问题等；本申请人在专利号为 200710032998. 3的发明中公开了一种修复土壤DDT污染的方法，将漆酶投加到DDT污染的 土壤中直接催化降解残留在土壤中的DDT，降解效率高，是一种有效的土壤DDT污染的治理 方法，对解决当今土壤DDT污染做出了重要贡献，但是酶修复也存在不足，包括酶纯化和提 取耗时长、花费高和易失活等缺陷，影响了其实际推广应用。鉴于土壤DDT污染的微生物修复技术和酶修复技术两者各自存在一些优点和一 些不足，需要对二者进行取长补短，发挥其协同作用。但是具体如何寻找微生物和酶的合适 的调配机制，包括合适的调配对象以及调配比例等，使微生物修复技术和酶修复技术能有 效发挥协同作用，这一直是本领域的技术难题，缺少具体可行的技术方案。
发明内容
本发明的目的是弥补现有DDT污染土壤的修复技术的不足，提供一种被DDT污染 土壤的微生物联合修复方法，采用本发明方法可以实现低成本、高效、安全的土壤修复。本发明的目的通过以下技术方案予以实现
提供一种利用白腐菌一游离漆酶联合修复土壤DDT污染的方法，包括以下步骤
3(1)将白腐菌液与DDT污染土壤混合均勻；所述白腐菌液投加量为每15g 土壤投加 5mL 15mL白腐菌液，白腐菌菌落数为3 X IO9 CFU/mL ；
(2)往步骤(1)混合了白腐菌液的土壤中投加游离漆酶。如果土壤的DDT污染浓度为5 mg/kg，那么步骤(2)所述游离漆酶最佳投加量为每 克土壤6 U，其它污染水平的DDT污染土壤也适合。步骤(2)是在白腐菌液与DDT污染土壤混合均勻14天后投加游离漆酶。本发明可采用气相色谱仪方法，每隔7天对经上述处理的土壤中的DDT残留量进 行分析检测。所述白腐菌为市售品，为木材腐生菌，引起木材白色腐朽或褐色腐朽，菌肉白色或 污白色，稍厚，菌柄侧生或偏生，有微细绒毛，后变光滑。白腐菌的培养和游离漆酶的制备可参照本技术领域常规，本发明提供优选的白腐 菌培养和游离漆酶的制备方法如下
本发明以土豆作为培养基的主要成分，然后加入一些营养物，在往复式频率为130 rpm、温度为的恒温培养振荡器中培养白腐菌，最佳培养时间为9天左右；上述培养基 的组成主要为土豆 200g、水 1000mL、葡萄糖 20 g、KH2P04 3 g、MgS04 1.5 g、VBl 0. 01 g 及5 g酵母膏。所述游离漆酶的制备方法包括以下步骤
(A)将培养好的白腐菌培养液离心，然后取上清液为粗酶液；
(B)往步骤(A)制备得到的粗酶液中加入硫酸铵粉末使溶液中硫酸铵饱和度达到20%，
常温静置；
(C)将步骤(B)静置后的体系在4！下冷冻离心，取上清液，在上清液中加入固体硫酸 铵至其饱和度达到80%，静置后冷冻离心，收集沉淀，用pH4. 6的0. 02 mol/L醋酸盐缓冲溶 液溶解所得到的沉淀蛋白，除去不溶性蛋白，即制得游离漆酶。步骤(B)所述静置时间优选为2小时。步骤(C)所述静置时间优选为8小时。相对于现有技术，本发明具有以下的有益效果
(1)本发明采用白腐菌一游离漆酶直接联合修复土壤DDT污染是有效的、可行的，白腐 菌和游离漆酶发挥了联合增效作用，对土壤中DDT的降解率均达到了 50%以上，是一种高 效、安全、无二次污染的修复土壤DDT污染的方法。(2)白腐菌对浓度较高的污染物的降解效果比较好，而对于浓度小的污染物的降 解效果不很理想；游离漆酶对于低浓度的污染物的降解效果比较理想，但游离漆酶存在纯 化和提取耗时长、花费高等缺陷，本发明将白腐菌一游离漆酶联合使用，有效解决DDT污染 土壤修复难题。(3)本发明所用的白腐菌与游离漆酶制备方法简单，施用操作简便，与现有物理化 学修复方法相比修复成本低。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。下述实施例中所采用的材料、试 剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1游离漆酶的制备 (1)白腐菌的培养
液态培养基的组成以200g 土豆作为培养基，然后加入葡萄糖20g、KH2P04 3g、MgS04 1. 5g、VBl 0. Olg 及 5g 酵母膏和 IOOOmL 水。将白腐菌菌种(购自中国科学院广州化学有限公司，其他公司出品的常规白腐菌 菌种也可适用)直径为10 mm的菌片2片接种量接入上述100 mL培养基中，在往复式频率 为130 rpm、温度为的恒温培养振荡器中培养白腐菌。(2)游离漆酶的分离纯化
将部分培养好(培养至9天的程度为最佳的)的白腐菌培养液倒入塑料离心杯，置于 4000 rpm的冷冻离心机中4 °C下离心15 min，取其上清液即为漆酶粗酶液；然后在得到的 每100 mL粗酶液中，在搅拌时缓缓加入研细的硫酸铵粉末11. 3 g，使溶液中硫酸铵饱和度 达到20%，25 °C静置2 h，在4 ！下冷冻离心后弃去沉淀，取上清液进一步纯化；每100 mL 上清液中再加入固体硫酸铵42. 4 g至饱和度达到80%，静置8 h后在同样条件下冷冻离心 收集沉淀，用PH4. 6的0. 02 mol/L醋酸盐缓冲溶液溶解所得到的沉淀蛋白，并除去不溶性 蛋白，即可制得游离漆酶，此漆酶为黄色的液体状；利用ABTS测定漆酶的活性。实施例2
研究白腐菌加菌量对白腐菌一游离漆酶联合修复土壤DDT污染的影响。供试土壤为赤红壤，取自广州华南农业大学树木园。土壤室内风干后过2 mm筛备 用。该土壤均未检测出DDT。将DDT溶液与供试土壤在室温下均勻混合制备出5 mg/kg的 DDT污染赤红壤，放置4周后进行修复试验。试验中保持土壤的含水率为15%左右。实验设 置对照(不加菌、不加漆酶)、加菌量1 (白腐菌投加量为5 mL/15 g 土、漆酶投加量为6 U/g 土)、加菌量2 (白腐菌投加量为10 mL/15 g 土、漆酶投加量为6 U/g 土)、加菌量3 (白腐菌 投加量为15 mL/15 g 土、漆酶投加量为6 U/g 土)共4个处理。其中白腐菌是在第1天投 加，白腐菌的菌落数为3X IO9 CFU/mL左右；游离漆酶是在第15天投加，漆酶的投加量均为 6 U/g 土。试验每个处理用土 15 g，设3个重复，分别置于烧杯中试验处理观天。试验前测试供试土壤中的DDT初始浓度，其后分别在第7、14、21、观天进行取样分 析。称取10 g 土壤置于索式抽提器中，用体积比为1 : 1的石油醚和丙酮混合液100 mL 浸泡10 h后抽提6 h。同时做空白试验。将抽提液转移至分液漏斗中，加入10%的无水硫 酸钠溶液，摇荡1 min后静止分层，取上层石油醚层并加入相当于石油醚层体积1/10的浓 硫酸分配3 4次，直至上下层都呈无色为止。再加入剩余石油醚层体积一半的10%无水 硫酸钠溶液洗涤，直至石油醚层溶液至中性，过无水硫酸钠脱水，浓缩，定容至10 mL，待测。 最后利用气相色谱进行分析检测。气相色谱仪为HP5890 II，色谱柱为 HP-5，30 mXO. 320 mm (id)XO. 25 μ m ；载气 为99. 999%的高纯氮气，气化室温度220 °C，柱温195 °C，检测器(E⑶)温度为M5 °C，载 气流速2 mL*min-l。采用不分流进样，进样量为2 μ L0表1描述了加菌量对DDT降解率 的影响。由表1可知，对照处理中，DDT的降解率随时间缓慢增加，降解过程不显著；当加菌 量分别为5 mL、10 mL、15 mL时，28天后DDT的降解率均达到了 50%以上，这说明白腐菌与 游离漆酶能有效地降解土壤中的DDT，这为采用白腐菌一游离漆酶联合修复土壤DDT污染提供了保证。 表1加菌量对DDT降解率的影响结果
权利要求
1.一种菌酶联合修复土壤DDT污染的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将白腐菌液与DDT污染土壤混合均勻；所述白腐菌液投加量为每15g 土壤投加5 mL 15 mL白腐菌液，白腐菌菌落数为3 X IO9 CFU/mL ；(2)往步骤(1)混合了白腐菌液的土壤中投加游离漆酶；所述游离漆酶最佳投加量为 每克土壤6U。
2.根据权利要求1所述利用白腐菌一游离漆酶联合修复土壤DDT污染的方法，其特征 在于步骤(2)是在白腐菌液与DDT污染土壤混合均勻2周后投加游离漆酶。
3.根据权利要求1所述利用白腐菌一游离漆酶联合修复土壤DDT污染的方法，其特征 在于步骤(1)所述白腐菌是将白腐菌接种于培养基中并置于往复式频率为130 rpm、温度为的恒温培养振荡器中培养得到；所述培养基的组成主要为土豆200 g、水1000 mL、葡 萄糖 20 g、KH2P04 3 g、MgS04 1.5 g、VBl 0. 01 g 及 5 g 酵母膏。
4.根据权利要求1所述利用白腐菌一游离漆酶联合修复土壤DDT污染的方法，其特征 在于步骤(2)所述游离漆酶的制备方法包括以下步骤(A)将培养好的白腐菌培养液在离心，取上清液为粗酶液；(B)往步骤(A)制备得到的粗酶液中加入硫酸铵粉末使溶液中硫酸铵饱和度达到20%，常温静置；(C)将步骤(B)静置后的体系在4！下冷冻离心，取上清液，在上上清液中加入固体硫 酸铵至其饱和度达到80%，静置后冷冻离心，收集沉淀，用pH4. 6的0. 02 mol/L醋酸盐缓冲 溶液溶解所得到的沉淀蛋白，除去不溶性蛋白，即制得游离漆酶。
5.根据权利要求4所述利用白腐菌一游离漆酶联合修复土壤DDT污染的方法，其特征 在于步骤(B)所述静置时间为2小时。
6.根据权利要求4所述利用白腐菌一游离漆酶联合修复土壤DDT污染的方法，其特征 在于步骤(C)所述静置时间为8小时。
全文摘要
本发明公开了一种菌酶联合修复土壤DDT污染的方法。本发明将白腐菌和游离漆酶以先后次序与含有DDT的土壤在室温下均匀混合，利用白腐菌—游离漆酶联合对土壤DDT污染进行修复。本发明所述方法对土壤中DDT的降解率均达到了50%以上，是一种操作简便、成本低廉、无二次污染的修复土壤DDT污染的方法。
文档编号B09C1/10GK102091717SQ201110022829
公开日2011年6月15日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者赵月春, 马伟娟 申请人:华南农业大学