一种体外测定ACAT2活性的方法及其检测系统与流程

本发明涉及体外检测领域，具体地，涉及一种体外测定ACAT2活性的方法及其检测系统
背景技术：
：酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)是胆固醇代谢的关键酶，其是细胞内唯一以含3-β-OH的游离固醇类为底物而催化合成相应固醇酯的酶，在维持细胞内胆固醇、脂肪酸等脂质代谢平衡中起着极为重要的作用。目前为止的文献报道，存在两种ACAT家族基因，分别编码ACAT1和ACAT2。ACAT1存在于体内的所有组织细胞，其催化合成产物如胆固醇酯等进入细胞内脂滴(Lipiddroplet，LD)；而ACAT2在体内表达具有细胞、发育和种属特异性，对于人则仅在肠与胚胎肝细胞中高表达、巨噬细胞中低表达(ChangCC等，ImmunologicalquantitationandlocalizationofACAT-1andACAT-2inhumanliverandsmallintestine.JBiolChem，2000，275:28083-92)。肝肠细胞中ACAT2催化合成产物如胆固醇酯等主要进入脂蛋白(Lipoprotein，LP)，包括乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)或类低密度脂蛋白(类LDL)分泌到细胞外(BuhmanKK等，NatMed，2000，6:1341-1347；Repaetal.，Hepatology，2004，40:1088-1097；Leeetal.，JLipidRes，2005，46:1205-1212)。至今，不管在无细胞体系、还是在完整细胞体系，ACAT1和ACAT2活性的测定方法均无差别，并且一般使用同位素标记胆固醇或连接荧光基团固醇作为酶的底物。并且目前，在测定ACAT2的活性时，往往会受到ACAT1的干扰，因此在大规模应用时会有结果不精确以及检测时间过长的问题。因此，本领域迫切需要开发一种能够快速、特异性的检测ACAT2活性的方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能够快速、特异性的检测ACAT2活性的方法。本发明第一方面提供一种非治疗非诊断性的体外测定ACAT2活性的方法，所述方法包括步骤：(1)在培养体系中，在带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类的存在下，培养表达ACAT2的细胞一段时间T1；(2)检测所述培养体系中位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的信号值S1；和(3)基于上一步骤所检测的所述信号值S1，从而定性和/或定量确定ACAT2的活性。在另一优选例中，在步骤(3)中，将所检测的所述信号值S1与标准值和/或对照值进行比较，从而确定ACAT2的活性。在另一优选例中，所述的标准值包括标准数值或标准曲线。在另一优选例中，所述的对照值是来自对照组的可检测标记物的信号值S0c。在另一优选例中，所述的标准值是来自同一培养体系的背景信号值S0b。在另一优选例中，所述的比较是计算信号值的差值ΔS：ΔS＝S1-S0c或ΔS＝S1-S0b并基于所述差值ΔS定性和/或定量确定ACAT2的活性。在另一优选例中，所述的比较是计算信号值的比值RS：RS＝S1/S0c×100％或RS＝S1/S0b×100％并基于所述比值RS定性和/或定量确定ACAT2的活性。在另一优选例中，所述方法中还包括设置对照组，其中：步骤(1)包括：在测试组中，培养表达ACAT2的细胞，以带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类处理细胞；在对照组中，以带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类处理不含有细胞的培养液；步骤(2)包括：经保温培养后，测定测试组和对照组的可检测标记物的信号值(如荧光强度)，从而确定ACAT2的活性，若测试组的信号值S1显著高于对照组的信号值S0c，则表明ACAT2活性显著高于对照组。在另一优选例中，所述“显著高于”是指测试组的信号值S1与对照组的信号值S0c的比值Rs≥2，较佳地≥5，更佳地≥10。在另一优选例中，所述“显著高于”是指测试组的信号值S1与对照组的信号值S0c的差值(×105OD)≥2，较佳地≥5，更佳地≥10。在另一优选例中，所述的背景信号值S0b是在添加了所述带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类之后的0-30分钟(较佳地1-20分钟，更佳地3-15分钟)内所测定的位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的信号值。在另一优选例中，所述的对照组中，所培养的对照细胞是不表达ACAT2的细胞。在另一优选例中，所述的对照组中，所培养的对照细胞是表达ACAT2的细胞(优选地，所述对照细胞是与测试组中相同的细胞)。在另一优选例中，所述可检测标记物选自下组：发光团、荧光团、生色团、或其组合。在另一优选例中，所述的可检测标记物包括荧光标记，更佳地为NBD。在另一优选例中，在步骤(1)中，所述培养体系中，还存在不带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类。在另一优选例中，所述含3-β-OH的固醇类选自下组：胆固醇，氧化胆固醇、固醇类激素及其前体、胆固醇前体、胆汁酸类、或其组合。在另一优选例中，步骤(1)中，所述的含3-β-OH的固醇类选自下组：27-羟基胆固醇、24s-羟基胆固醇和25-羟基胆固醇。在另一优选例中，所述的可检测标记物的含3-β-OH的固醇类选自下组：NBD荧光基团标记的含3-β-OH的固醇类(简称为NBD-固醇，其中NBD荧光基团可标记于固醇的不同位点上)。在另一优选例中，所述的可检测标记物的含3-β-OH的固醇类带有一种或多种不同的所述可检测标记物。在在另一优选例中，在步骤(1)中，将不带有可检测标记物的3-β-OH的固醇类和带有可检测标记物的3-β-OH的固醇类可按任意次序加入，包括同时或先后加入所述培养体系。在另一优选例中，所述的表达ACAT2的细胞选自下组：人和非人哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述的表达ACAT2的细胞选自下组：肝细胞、肠细胞、肿瘤细胞、永生化的细胞系、白细胞、基因工程改造的细胞。在另一优选例中，所述的表达ACAT2细胞选自下组：肝癌细胞、肠癌细胞(如结肠癌细胞)、血癌细胞。在另一优选例中，所述的表达ACAT2的细胞是来自血液样本、体液样本、尿液样本、唾液样本、肿瘤组织样本或癌旁样本的细胞。在另一优选例中，所述的肿瘤组织为肝癌组织或肠癌组织。在另一优选例中，所述的表达ACAT2细胞选自下组：分离自循环系统的肿瘤细胞。在另一优选例中，所述的含3-β-OH的固醇类是ACAT2特异识别的立体构型底物，经ACAT2特异识别固醇3-β-OH催化合成固醇酯；或所述的带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类是ACAT2特异识别的立体构型底物，经ACAT2特异识别固醇3-β-OH催化合成固醇酯，且其携带荧光标记。在另一优选例中，所述表达ACAT2的细胞具有分泌脂蛋白的功能。在另一优选例中，所述表达ACAT2的细胞表达载脂蛋白B和微粒体甘油三酯转移蛋白。在另一优选例中，所述的T1为0.1－24小时，较佳地为0.2-12小时，更佳地为0.5-6小时，最佳地为1-5小时，极佳地2-3小时。在另一优选例中，所述的培养体系的体积为1微升－100毫升，较佳地为5微升－10毫升，更佳地为10微升-1000微升，最佳地为20-500微升，极佳地50-200微升。在另一优选例中，所述方法包括：在n个独立的培养体系中进行所述步骤(1)和步骤(2)，其中n为1-10000的正整数，较佳地2-2000，更佳地5-1000，最佳地为48、96、192、384。在另一优选例中，所述的培养体系被置于多孔板(如48、96、192、384孔板)中各孔中。在另一优选例中，在步骤(2)中，所述的检测通过肉眼、仪器测定(如拍照、图像分析)进行。在另一优选例中，在步骤(1)和(2)之间，包括或不包括将所述细胞与所述 培养体系分离的步骤。在另一优选例中，在步骤(1)和(2)之间不包括将所述细胞与所述培养体系分离的步骤。本发明第二方面提供了一种用于检测ACAT2活性的检测系统，所述系统包括：(a)表达ACAT2的细胞；(b)带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类；(c)用于检测位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的信号值的检测仪器。在另一优选例中，所述的系统还包括用于对所述信号值进行分析的分析装置。在另一优选例中，所述的分析装置存贮有用于对所述信号值进行分析的标准数值或标准曲线。本发明第三方面提供了一种确定测试化合物是否是ACAT2抑制剂或促进剂的方法，包括步骤：(a)在测试组中，在培养体系中，在带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类和测试化合物的存在下，培养表达ACAT2的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的信号值S1’；并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的信号值S1”；(b)将上一步骤所检测的所述信号值S1’和S1”进行比较，从而确定所述测试化合物是否是ACAT2抑制剂或ACAT2促进剂，其中，如果信号值S1’显著高于S1”，则表示所述测试化合物是ACAT2促进剂；如果信号值S1’显著低于S1”，则表示所述测试化合物是ACAT2抑制剂。在另一优选例中，所述“显著高于”指S1’/S1”≥2,较佳地，≥3，更佳地≥4。在另一优选例中，所述“显著低于”指S1’/S1”≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。在另一优选例中，所述的信号值为荧光强度。在另一优选例中，所述的方法是非诊断和治疗性的。在另一优选例中，所述的方法包括步骤：将步骤(b)中所确定的ACAT2抑制剂或ACAT2促进剂，施用于动物，并测定其对ACAT2的影响或对脂类代谢的影响。本发明第四方面提供了一种分泌性脂蛋白复合物，所述复合物具有式I结构：LP-(Y)m(I)式中，LP表示脂蛋白；Y为带有可检测标记物的3-β-OH被酯化的固醇类酯；m≥2。在另一优选例中，所述的分泌性脂蛋白复合物是分离的或纯化的。在另一优选例中，m≥5，较佳地为m≥10，更佳地为m≥50，最佳地为100，极佳地为200。在另一优选例中，所述复合物分子量≥2500kDa。在另一优选例中，所述复合物具有位于外层的脂蛋白LP以及位于内部的Y。在另一优选例中，所述复合物具有位于外层的载脂蛋白-磷脂-游离胆固醇组成的LP以及位于内部的Y。在另一优选例中，所述带有可检测标记物的3-β-OH被酯化的固醇类酯包被于脂蛋白中。在另一优选例中，所述复合物为表达ACAT2的细胞分泌至细胞外的复合物。在另一优选例中，在所述复合物中，所述Y为聚集型。在另一优选例中，所述复合物中所述聚集型Y所产生的可检测标记物信号显著高于分散型Y所产生的可检测标记物信号。例如，m个Y所构成的聚集型Y所产生的总信号值Stotal强于单个分散型Y所产生的信号值Ssingle的m倍，即Stotal≥Ssingle×m。更佳地，R＝Stotal/(Ssingle×m)≥2，较佳地R≥5，更佳地R≥50。本发明第五方面提供了一种本发明第四方面所述的分泌性脂蛋白复合物的制备方法，所述方法包括步骤：(1)在培养体系中，在带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类的存在下，培养表达ACAT2的细胞一段时间T1，从而形成所述的分泌性脂蛋白复合物；(2)从所述培养体系中，分离出所述的分泌性脂蛋白复合物。本发明第六方面提供了一种本发明第四方面所述的分泌性脂蛋白复合物的用途，所述复合物用于制备(a)用于检测ACAT2活性的试剂或试剂盒；(b)用于检测或辅助检测癌症或癌症易感性的试剂盒；(c)用于检测或辅助检测癌症转移的试剂盒；和/或(d)用于制备血清检测或血液检测的试剂盒。在另一优选例中，在所述试剂盒中，含有所述的分离的分泌性脂蛋白复合物作为阳性对照。在另一优选例中，所述试剂盒包括：第一容器，所述容器含有所述分泌性脂蛋白复合物；标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于体外检测ACAT2活性。本发明第七方面提供了一种非治疗非诊断性的体外测定ACAT2活性的方法，所述方法包括步骤：(1)提供一待检测样本；(2)对所述样本进行处理，获得经处理的混合物，并检测所述混合物中本发明第四方面所述的分泌性脂蛋白复合物所产生的自所述可检测标记物的信号值S1；和(3)基于上一步骤所检测的所述信号值S1，从而定性和/或定量确定所述样本中的ACAT2的活性。在另一优选例中，所述的样本包括细胞样本、血液样本、体液样本。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了细胞培养后的荧光强度测定结果其中，图1A显示了L02、Huh7细胞和无细胞培养液(Nocell)在同样保温培养后的荧光强度测定结果，以无细胞培养液测定结果作为对照；**P<0.01。图1B显示了Huh7细胞培养液经超滤处理后超滤膜之上(top)及超滤膜之下 (bottom)的培养液中的相对荧光强度(％)测定结果。图2显示了ACAT2抑制剂对细胞培养后的荧光强度影响结果其中，PPPA为ACAT2的选择性特异抑制剂，5μM处理细胞能够完全抑制高表达的ACAT2的活性。图3显示了ACAT2抑制剂的IC50测定结果其中图3A利用Huh7、HepG2和Caco-2三株细胞，测定不同浓度的PPPA对细胞ACAT2活性的抑制作用。图3B对上述测定数据，使用GraphPadPrism软件作图，获得相应细胞ACAT2相对活性(％)对PPPA浓度对数[Log(PPPAμM)]的抑制曲线。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外的开发了一种检测ACAT2活性的方法，该方法能够特异性的定性和/或定量检测细胞中ACAT2的活性，并且具有很高的灵敏度。具体地，在表达ACAT2细胞中加入带有可检测标记物的固醇类(如NBD－固醇)，并检测进入分泌脂蛋白的带有可检测标记物的3-β-OH被酯化的固醇类酯的信号值(如荧光强度)，通过对信号值(如荧光强度)进行分析，从而能够很精确的确定ACAT2的活性。体外测定ACAT2活性的方法本发明提供了一种体外测定ACAT2活性的方法，包括步骤：(1)在培养体系中，在带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类的存在下，培养表达ACAT2的细胞一段时间T1；(2)检测所述培养体系中位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的信号值S1；和(3)基于上一步骤所检测的所述信号值S1，从而定性和/或定量确定ACAT2的活性。其中，在步骤(3)中，通过将所检测的所述信号值S1与标准值(S0b)和/或对照值(S0c)进行比较，从而确定ACAT2的活性。所述的比较是计算信号值的差值ΔS：ΔS＝S1-S0c或ΔS＝S1-S0b并基于所述差值ΔS定性和/或定量确定ACAT2的活性。或者，所述的比较是计算信号值的比值RS：RS＝S1/S0c×100％或RS＝S1/S0b×100％并基于所述比值RS定性和/或定量确定ACAT2的活性。利用本发明所述的方法检测细胞中ACAT2的活性，能够排除ACAT1对ACAT2活性测定的干扰，可以直接用于对内源性ACAT2、ACAT1均表达的细胞(如肝肠细胞)进行生理和病理功能效应及其相关抑制作用等研究。分泌性脂蛋白复合物本发明首次发现了一种分离的分泌性脂蛋白复合物，所述复合物具有式I结构：LP-(Y)m(I)式中，LP表示脂蛋白；Y为带有可检测标记物的3-β-OH被酯化的固醇类酯；m≥2，较佳地m≥5，更佳地为m≥50，最佳地为100，极佳地200。其中，所述复合物分子量≥2500kDa，且所述带有可检测标记物的3-β-OH被酯化的固醇类酯以聚集体的形式包被于脂蛋白中。在本发明中，复合物中聚集型Y所产生的可检测标记物信号显著高于分散型Y所产生的可检测标记物信号。例如，m个Y所构成的聚集型Y所产生的总信号值Stotal强于单个分散型Y所产生的信号值Ssingle的m倍，即Stotal≥Ssingle×m。更佳地，R＝Stotal/(Ssingle×m)≥2，较佳地R≥5，更佳地R≥50。本发明通过检测分泌性脂蛋白复合物的信号值(如荧光强度)，从而能够快速、精确的确定细胞中ACAT2的活性。试剂盒本发明提供了一种检测ACAT2活性的试剂盒，该试剂盒包括：第一容器，所述容器含有分泌性脂蛋白复合物，其中分泌性脂蛋白复合物作为阳性对照。标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于体外检测ACAT2活性。在本发明中，通过检测试剂盒中分泌性脂蛋白复合物的信号值(如荧光强度)，从而能够快速、精确的确定细胞中ACAT2的活性，能够用于大规模高效的筛选ACAT2选择性特异抑制剂，加速肝癌等疾病的临床诊治与药物研发。本发明的优点包括：(1)在分泌脂蛋白且内源性ACAT2、ACAT1均表达的细胞(如肝细胞、肠细胞、白细胞)中进行ACAT2活性测定，ACAT1对ACAT2活性测定无干扰作用；(2)本发明的测定ACAT2活性的方法可以直接用于对内源性ACAT2、ACAT1均表达的细胞(如肝细胞、肠细胞、白细胞)进行生理和病理功能效应及其相关抑制作用等研究；(3)本发明测定ACAT2活性的方法适宜于利用小体积、多孔板进行规模性高效筛选ACAT2选择性特异抑制剂及检测细胞对ACAT2抑制的毒性作用；(4)可成为规模性筛选ACAT2特异性抑制剂的关键性技术方法，不但促进高效筛选ACAT2选择性特异抑制剂，而且加速肝癌等疾病的临床诊治与药物研发；(5)首次公开了一种分泌性脂蛋白复合物，通过检测该复合物的信号值(如荧光强度)，能够快速、精确的确定细胞中ACAT2的活性。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。材料和方法1.材料和试剂细胞培养基Dulbecco’smodifiedEagle’smedium(DMEM)和胎牛血清购自LifeTechnologies公司(Rockville，USA)。3-β-OH的荧光标记固醇是由荧光基团NBD取代胆固醇的22位异丙基而合成的含3-β-OH的NBD-固醇(NBD-sterol)，结构式如下：含3-β-OH的固醇类包括胆固醇、27-hydroxycholesterol(27OH)、24s-hydroxycholesterol(24sOH)、25-hydroxycholesterol(25OH)分别购自Sigma、MedicalIsotope和EnzoLifeScience公司。ACAT2选择性特异抑制剂PPPA购自Enzolifescience公司。超滤柱AmiconUltra-15CentrifugalFilters(滤膜孔径10kDa)购自Millipore公司(Ireland)。荧光分析仪EnVisionMultilabelReader(PerkinElmer，USA)。2.细胞及培养条件人正常肝细胞株L02、人肝癌细胞株Huh7由中国科学院细胞库提供。人肝母细胞瘤细胞株HepG2、人结肠癌细胞株Caco-2，购自ATCC(AmericanTypeCultureCollection)。Caco-2细胞用20％胎牛血清的DMEM培养基培养；其余细胞都用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。细胞均在95％湿度、37℃、5％CO2条件下培养。所有培养基都加入100U/ml的氨苄青霉素和100μg/ml链霉素。3.细胞培养后的荧光测定分析L02和Huh7细胞在过夜培养后，加入含3-β-OH的固醇类和荧光标记固醇，同时以含3-β-OH的固醇类和荧光标记固醇处理不含有细胞的培养液作为对照，同样保温培养后再使用荧光分析仪(E488，A535)进行荧光强度测定。4.细胞培养液经超滤后的荧光测定分析将上述条件下的Huh7细胞培养液进行超滤处理，再使用荧光分析仪(E488，A535)分别测定滤膜上和滤膜下的液体的荧光强度，以未经超滤处理的Huh7细胞培养液的荧光强度为100％，计算相对荧光强度(％)。5.测定PPPA对ACAT2活性的抑制作用利用文献报道的可完全抑制高表达ACAT2活性的选择性特异抑制剂PPPA浓度(5μM)，同时处理上述条件下的L02、Huh7、HepG2和Caco-2细胞后，比较加与不加抑制剂之间荧光强度的差异。对PPPA抑制ACAT2活性的IC50测定，是利用PPPA梯度浓度处理上述条件下的Huh7、HepG2和Caco-2细胞后，将无PPPA处理细胞的ACAT2活性设定为100％，分别计算相应PPPA浓度处理的相对ACAT2活性(％)，使用GraphPadPrism软件作图，获得相应细胞ACAT2相对活性对PPPA浓度对数[Log(PPPAμM)]的抑制曲线和IC50。6.统计分析利用unpairedStudent’sttest进行实验差异的统计分析。实施例1细胞培养液的NBD-固醇酯主要分布在分泌脂蛋白中本发明人利用不具有分泌脂蛋白功能且ACAT2不表达的L02(正常肝细胞)和具有分泌脂蛋白功能且ACAT2高表达的Huh7细胞(肝癌细胞)，通过加入含3-β-OH的固醇类和荧光标记固醇，同时以含3-β-OH的固醇类和荧光标记固醇处理不含有细胞的培养液作为对照，同样保温培养后进行荧光强度测定。结果表明，如图1A所示，与不具有分泌脂蛋白功能的L02细胞相比，具有分泌脂蛋白功能的Huh7细胞培养后的荧光强度非常显著地提高。进一步，将以上Huh7细胞培养液经部分超滤处理后的结果(图1B)显示，荧光主要分布于超滤膜(Ultra-10)之上(top)的培养液，而超滤膜之下(bottom)的培养液荧光非常弱，表明存在于细胞培养液的荧光主要源自进入分泌脂蛋白(分子量＞10kDa)的聚集型NBD-固醇酯，而不是游离型NBD-固醇(约0.5kDa)。发明人将含聚集型NBD-固醇酯的分泌脂蛋白复合物(分子量＞10kDa)进行分离纯化，发现荧光信号来源于进入分泌脂蛋白的聚集型NBD-固醇酯。在 分泌性脂蛋白复合物中，NBD－固醇酯以聚集体的形式包被于脂蛋白中。分析后的结果表明，分泌性脂蛋白复合物的荧光强度比游离的NBD－固醇要高很多，至少高1倍，其由外层载脂蛋白-磷脂-游离胆固醇的脂蛋白和位于内部的NBD－固醇酯两部分组成，并且分泌性脂蛋白复合物的直径为15-22nm，形成脂蛋白复合物之前的脂蛋白的直径为22-80nm。实施例2分泌脂蛋白中的NBD-固醇酯由ACAT2催化合成本发明人在上述同样实验中，同时加入文献报道的可完全抑制高表达ACAT2活性的选择性特异抑制剂PPPA(5μM)处理。如图2结果显示，ACAT2高表达的Huh7细胞培养后的荧光强度有非常显著的降低，且与不具有分泌脂蛋白功能且ACAT2不表达的L02无显著差异，进而表明Huh7细胞培养后在分泌脂蛋白中聚集的NBD-固醇酯量依赖于ACAT2活性。实施例3选择性特异抑制剂PPPA对ACAT2活性的抑制作用本发明人深入的实验研究，在具有分泌脂蛋白功能且内源性ACAT2均高表达的另二株天然型细胞HepG2和Caco-2进行同样的5μMPPPA处理，图3A显示，HepG2和Caco-2的结果与Huh7的完全一致。进一步地，测定ACAT2选择性特异抑制剂PPPA的IC50，结果见图3B和表1。Huh7、HepG2和Caco-2三株细胞均是内源性ACAT2高表达，在0.008-5μM浓度范围，PPPA的抑制曲线无明显差异(图3B)；且特异抑制ACAT2活性的IC50也相近(表1)。表1PPPA特异抑制ACAT2活性的IC50细胞株IC50(μM)Huh70.167HepG20.177Caco-20.141结果表明，已成功构建了可用于ACAT2活性测定的新技术方法体系，可应用于规模性筛选调节ACAT2的活性或表达的待测定物质，还可应用于通过测定血液来源细胞的ACAT2活性进行免疫功能异常或炎症发生、肝癌或肠癌转移的分析。实施例4筛选促进或抑制ACAT2活性的测试化合物的方案利用前面所述所构建的新技术方法体系，进行规模性筛选促进或抑制ACAT2活性的测试化合物，通过将测试化合物测试组的荧光强度(S1’)和不存在测试化合物且其他条件相同的对照组的荧光强度(S1”)进行比较，从而确定测试化合物是否是ACAT2抑制剂或ACAT2促进剂。如果信号值S1’显著高于S1”，如高于2倍以上，则表示测试化合物是ACAT2促进剂；如果信号值S1’显著低于S1”，如低于50％以上，则表示测试化合物是ACAT2抑制剂，其潜在地可研发成为一种抑制肿瘤或抗动脉粥样硬化病变的药物。实施例5测定血液来源细胞的ACAT2活性进行免疫功能异常或炎症发生、肝癌或肠癌转移分析的方案利用前面所述所构建的新技术方法体系，通过测定健康者血液分离细胞培养后的荧光强度，获得具有统计学意义的测试标准；通过测定受试者血液分离细胞培养后的荧光强度，比较受试者和测试标准的荧光强度，用来分析受试体检者的健康水平和受试患者相关疾病的辅助诊断；若是受试者的荧光强度显著低于测试标准，则表明该受试者血液分离细胞的ACAT2活性偏低而免疫功能异常抑制，如感染性炎症；若是受试者的荧光强度显著高于测试标准，则表明该受试者血液分离细胞的ACAT2活性偏高而免疫功能异常激活，如过敏性炎症或非可控性炎症(nonresolvinginflammation)；若是受试者的荧光强度非常显著高于测试标准，则表明该受试者血液含有高表达ACAT2的转移癌细胞，如肝癌或肠癌细胞的转移。实施例6试剂盒制备本实施例提供了一种检测ACAT2活性的试剂盒及其制备，该试剂盒包括：第一容器，所述容器含有分泌性脂蛋白复合物，其中分泌性脂蛋白复合物作为阳性对照。标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于体外检测ACAT2活性。对比例1采用本发明相同的方法，对人神经瘤细胞(如SK-N-SH)进行ACAT2活性的测定。结果表明，人神经瘤细胞(如SK-N-SH)不表达ACAT2，也不分泌脂蛋白，荧光强度不增加，检测不到ACAT2的活性。对比例2采用本发明相同的方法，对人肝癌细胞(如Hep3B)进行ACAT2活性的测定，结果表明，人肝癌细胞(如Hep3B)不表达ACAT2，虽然能够分泌脂蛋白，但是荧光强度不增加，因此检测不到ACAT2的活性。讨论如表2所示，发明人对大量的细胞株进行研究后发现，不是所有能够分泌脂蛋白的细胞株均能够用本发明所述的方法检测ACAT2的活性，并且不分泌脂蛋白的细胞株也检测不到ACAT2的活性。因此，在分泌脂蛋白且内源性ACAT2、ACAT1均表达的细胞(如肝细胞、肠细胞、白细胞)中测定ACAT2的活性。结果发现，ACAT1对ACAT2活性的测定无明显干扰作用，而且该方法测定的是内源性ACAT2的活性，因此该方法可直接用于对内源性ACAT2、ACAT1均表达的细胞(如肝细胞、肠细胞、白细胞)进行生理和病理功能效应及其相关抑制作用等方面的研究。表2用本发明所述方法测定不同细胞株的ACAT2活性细胞株细胞类型脂蛋白分泌荧光强度增加ACAT2活性Huh7人肝癌细胞能非常显著高HepG2人肝癌细胞能非常显著高Caco-2人肠癌细胞能非常显著高THP-1人单核白细胞能显著低Hep3B人肝癌细胞能无无L02人正常肝细胞能无无SK-N-SH人神经瘤细胞否无无AC29仓鼠卵母细胞否无无在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 2 3