专利名称：一种耐盐沙雷氏菌及其在盐渍化石油污染土壤修复中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物应用技术与污染土壤生物修复领域，具体涉及一种沙雷氏菌株 (Serratia sp.)以及在石油污染盐渍化土壤修复中的应用。
背景技术：
在石油及其石油产品的生产使用过程中，不可避免的会带来土壤污染问题。土壤被石油污染后，生产力降低，石油中的有害组分还能够进入到水体、大气，甚至农产品中，严重影响环境质量和危害人体健康。各国专家一直在石油污染土壤修复技术领域的进行研发、攻关工作，但由于石油组分复杂，一旦其污染环境后，修复难度较大。生物修复是石油污染土壤治理的一非常有潜力的方法，是国内外普遍关注研究的热点。其主要包括植物修复、 微生物修复以及微生物-植物联合修复。微生物修复可以利用原位的土著微生物，但更多的是利用高效降解菌剂以及工程菌，在很大程度上，其修复效率的高低取决于微生物降解效率。因此，开展石油污染土壤的生物修复工作，首先要筛选高效石油降解微生物。随着经济的发展，人们对石油产品的需求量不断增加，石油开采也正在由内陆向海上转移，海洋、海岸带地区石油污染有加大趋势。海岸带地区生态环境脆弱，土壤盐渍化严重，表层土壤可溶性盐含量0. 5-3%，以氯化物为主，氯化物最高可占可溶性总盐量的 80%。盐度从0. 5%升高到洲时，会严重扰乱非耐盐微生物的代谢活动，因此，在内陆地区广泛应用的石油污染修复菌剂，在海岸带盐渍化污染土壤修复中可能无法利用。进行海岸带地区石油污染土壤的修复工作，关键是筛选出耐盐石油降解微生物，其能够在高盐环境中降解石油烃。目前，关于耐盐的降解石油微生物还鲜有报道。盐生微生物包括嗜盐型和耐盐型，前者指微生物在一定的盐浓度中可正常生长， 高盐度是正常生长的必须条件；后者是能耐受一定的盐浓度，但在无盐条件下也可以正常生长。开展盐渍化石油污染土壤的生物修复工作，修复生物必须要适应高盐的土壤环境。因此需要寻找能在高盐环境下能降解石油的微生物。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明基于传统的石油降解微生物筛选方法，在筛选过程中加入了 NaCl，筛选出了一株耐盐石油降解菌，并进行了菌种鉴定，认定为(Serratia sp. ) BF40，该菌株在盐浓度为0 7%的环境中能够降解石油，对石油污染的土壤进行修
Μ. ο本发明的沙雷氏菌株(Serratia sp. )BF40，该菌株于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO. 5236，该菌株在LB平板上培养Id的菌落直径1 2mm，菌落呈圆形，边缘规则，不透明，白色；
其细胞形态特征菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性； 其生理生化特征生长最适pH为7. 2 7. 7，NaCl耐受性在0 7%之间；柠檬酸盐利用、V-P实验、吲哚实验、油脂水解均为阳性，淀粉水解为阴性，能够利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖产酸，不能利用乳糖。上述的沙雷氏菌(Serratia sp. ) BF40菌株，在盐浓度为0 5%的液态环境中和盐浓度为0. 6 1. 3%的盐渍化土壤中降解石油。上述的沙雷氏菌(Serratia sp. )BF40菌株，在以粉碎的灭菌玉米秸秆作为载体的条件下，对石油污染的盐浓度为1. 3%的盐渍化土壤修复，71天对石油降解率达65%以上。沙雷氏菌(Serratia sp. ) BF40菌株能够在盐渍化环境中降解石油的一个重要机制是产生表面活性剂，提高了石油的生物可利用性。在分离筛选体系中加入适量NaCl，能够显著提高耐盐石油降解菌的筛选效率， NaCl添加浓度为0. 5 1. 0%。本发明的有益效果在于，本发明提供的保藏编号为CGMCC NO. 5236的沙雷氏菌株 (Serratia sp. ) BF40，在盐浓度为0 5%的液态环境中的盐浓度为0. 6 1. 3%的盐渍化土壤中能够降解石油；在以粉碎的玉米秸秆作为载体的条件下，对石油污染的盐浓度为盐渍化土壤修复，71天石油降解率达65%以上。
图1为本发明的沙雷氏菌株(Serratia sp. ) BF40在不同盐度下生长变化； 图2为实施例4BF40菌株在不同盐浓度液体培养基中的石油降解率；
图3为实施例6中不同处理土壤中石油降解率，图中同土壤中不同字母表示处理间差异显著(Ρ<0· 05)；
图4为实施例6 土壤中残留石油饱和脂肪烃和芳香烃(SAA)组分色谱图，Α、加入表面活性剂处理(BIOF) ；B、空白处理(CK)；
图5为实施例8沙雷氏菌(Serratia sp. ) BF40菌株石油降解率。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。实施例1
沙雷氏菌(Serratia sp. ) BF40菌株的分离筛选
取IOg石油污染滨海盐渍化土壤，该土壤中可溶性盐含量为1. 2%，将该土壤加入装有 IOOmL无菌水的三角瓶中，高速振荡20min后，取IOml接种到1. 0%NaCl无机盐液蜡培养基中，培养基组成Na2HPO4 1. 5 g/L; KH2PO4 3. 84 g/L; MgSO4 0. 7g/L; (MM)2SO4 4.0 g/L; 酵母粉O.Olg/L;液体石蜡2% (v/w)；置37°C摇床往复振荡培养5d，重复富集3次后，将富集培养液充分混勻，取100 μ L涂布在1. 0%NaCl的LB固体平板上，在37°C恒温培养箱中培养36h，观察生长出的菌落。将生长的单菌落接种到LB培养基中，培养至OD63tl为0. 8左右，作为种子液以10% (ν/ν)比例接入lOOmL，1. 0%NaCl无机盐液蜡培养基中，37°C摇床往复振荡培养5d。然后以此发酵液作为种子液，接种至新鲜的1. 0%NaCl无机盐液蜡培养基中，反复驯化3次。选取对液蜡乳化良好的菌种进行原油降解实验。将菌落接种到1. 0%NaCl液蜡培养基中培养3d左右，作为种子以10%(v/v)的比例接种到IOOmL的1. 0%NaCl原油培养基中， 振荡培养7d，测定原油降解率。石油测定方法采用红外测油仪进行测定，首先发酵液用四氯化碳进行萃取，测定剩余原油的量，降解率(％)= (1-剩余原油的量)/加入原油的量X 100， 最终得到盐渍化环境中降解石油的菌株(Serratia sp. )BF40。实施例2
沙雷氏菌(Serratia sp. ) BF40菌株的16S rDNA基因序列测定将菌株接种于LB培养基，在37°C恒温培养箱中培养20h，离心收集菌体，重新悬浮， 加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，进行测序，16S rDNA基因序列长度为 150;3bp，该序列与NCBI数据库中所给出的krratia属中不同种的16S rDNA序列具有大于 98%的相似性，其16S rDNA基因序列如序列表中所示。实施例3
沙雷氏菌(Serratia sp. ) BF40菌株的耐盐性
利用无机盐培养基，添加0. 1%酵母粉，设五个不同浓度梯度的NaCl处理0、0. 5%、 2. 5%、5. 0%、7. 5%，接种后，在37 °C恒温培养箱中培养48h，测定菌液吸光值，结果见图1。由图1可以看出，在0 2. 5%的盐度条件下，菌株能够正常生长，盐度增加至5. 0% 时，生长量约为最大生长量的一半，盐度继续增加，该株菌的生长显著受到抑制，但在盐浓度为7%的环境中仍然能生长。因此，沙雷氏菌属(Serratia sp. )BF40为耐盐菌，在液体培养基中其耐盐程度在0 7 %。实施例4
沙雷氏菌(Serratia sp. ) BF40菌株在不同盐度下降解石油效率将菌株分别接种在不同NaCl添加量，含1. 0%(v/w)石油的LB液体培养基中，在37°C振荡培养7d，红外测油仪测定剩余石油的量，计算石油降解率。以不接种处理作为对照(CK)， 结果见图2。由图2可以看出在含盐量0 5.0%的盐度条件下，与对照相比较，接种处理石油降解率大大提高，因而，BF40菌株能够显著促进石油降解，在高盐条件下仍具有较高的降解率。实施例5
沙雷氏菌(Serratia sp. ) BF40菌株发酵液在不同盐度条件下表面张力与乳化指数将菌株接种到不同NaCl添加量的牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养72h，测定不同处理的表面张力。取5mL离心后的去细胞发酵液，加入5mL 二甲苯摇动混勻30s，然后静止M h测定其在不同含盐量下的乳化指数(EI14)。发酵液表面张力和乳化指数见表1。表1沙雷氏菌(Serratia sp. ) BF40菌株在不同含盐量条件下的表面张力与乳化指数
权利要求
1.沙雷氏菌株(Serratiasp. ) BF40，该菌株于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO. 5236，该菌株在LB平板上培养 Id的菌落直径1 2mm，菌落呈圆形，边缘规则，不透明，白色；其细胞形态特征菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性；其生理生化特征生长最适pH为7. 2 7. 7，NaCl耐受性在0 7% ；柠檬酸盐利用、V-P实验、吲哚实验、油脂水解均为阳性，淀粉水解为阴性，能够利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖产酸，不能利用乳糖。
2.如权利要求1所述的沙雷氏菌(Serratiasp. )BF40菌株，其特征在于，该菌株在盐浓度为0 5%的液态环境中和盐浓度为0. 6 1. 3%的盐渍化土壤中降解石油。
3.如权利要求1所述沙雷氏菌(Serratiasp. ) BF40菌株，在以粉碎的灭菌玉米秸秆作为载体的条件下，对石油污染的盐浓度为1. 3%的盐渍化土壤修复，71天对石油降解率达 65%以上。
全文摘要
本发明属于微生物应用技术与污染土壤生物修复领域，具体涉及一种沙雷氏菌菌株(Serratiasp.)以及在石油污染盐渍化土壤修复中的应用。本发明公开的一种沙雷氏菌株(Serratiasp.)，该菌株于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.5236，该菌株能够在高盐的液态环境中和盐渍化土壤中能够高效降解石油。该菌株是在有盐胁迫条件下，自石油污染的盐渍化土壤中分离得到。该菌株菌落呈圆形，边缘规则，不透明，白色，菌体呈短杆状，较小，革兰氏染色阴性。本发明还公开了其核苷酸序列。该菌株能够在高盐的液态环境中降解石油，在盐渍化土壤中石油降解率达60%以上，在野外盐渍化土壤修复中应用效果显著。
文档编号B09C1/10GK102382784SQ20111031403
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者吴涛, 张丽燕, 李小彬, 王君, 谢文军, 郝雅丽 申请人:滨州学院