嗜盐古菌在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产pha的方法
【专利摘要】嗜盐古菌在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产PHA的方法，属于PHA的生产【技术领域】。包括以下步骤：Haloferax?mediterranei菌种活化、在种子培养基中进行培养、SBR反应器内以糖蜜酒精废水进行菌种放大培养、连续流反应器内以糖蜜废水进行连续PHA生产、回收排除的剩余污泥中的PHA。连续流工艺简单，相比较发酵工艺，无需反复更换发酵液，无需反复接种菌泥，连续进水连续出水，各工艺参数趋于恒定值，实现简单，便于自动控制，易于工程操作，PHA产量高，实现了PHA的连续生产，同时也做到了剩余污泥的资源化利用。
【专利说明】嗜盐古菌在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产PHA的 方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于PHA的生产【技术领域】，涉及一种利用嗜盐古菌Haloferax mediterranei在连续推流反应器中处理糖蜜酒精废水合成聚羟基脂肪酸酯（PHA)的技术 方法。该发明特别适用于糖蜜酒精废水的预处理进行资源回收，具有废物利用、能源生产和 资源回收的多重优势。
【背景技术】
[0002] 目前，全球范围内，PHA的工业化生产普遍采用单底物进行纯菌批次生物发酵的 方法。例如，美国Metabolix公司创造了基因重组的Escherichia coli K12菌株，以葡 萄糖为底物进行发酵，24h可获得90 %细胞干重的PHA产品生产。德国Biomer公司利用 Alcaligenes latus菌株，以蔗糖为底物发酵进行PHA的工业生产。中国清华大学与广东 江门生物技术开发中心有限公司、韩国科技院（韩国）和宝洁公司（USA)合作，已成功进行 了 Aeromonas hydrophila发酵合成PHA的工业生产。但是间歇发酵过程有明显的缺陷：① 发酵过程中要不断的向发酵罐中加入酸碱溶液控制pH，要配置专门的投加设备；每个周期 结束后发酵罐要进行清洗、消毒；每周期要重新更换发酵液等，使得人力、物力、动力消耗较 大；②生产周期较短，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长 期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；③生产效 率低，由于在整个发酵周期中包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间，实际有效发酵时间短，发 酵效率很低。为此，如果将间歇发酵改为连续生产将克服上述问题，提高PHA生产效率，降 低PHA生产成本。
[0003] 在连续流生物技术层面，利用工业废水作为底物在污水生物处理过程中收获PHA 是解决在这一问题很好的方式。利用废水尤其是某些工业废水中高含量的有机物作为碳 源，在进行废水处理的同时收获PHA，不仅解决了污水处理问题，也使合成PHA过程中底物 单一性得到改善，对PHA组分的多样性提供保证。这样的方式一方面突破了现在PHA生产 依赖纯菌发酵的现状，另一方面也使污水处理和资源回收有效的结合。因此可以有效地提 高生产效率，降低生产成本。
[0004] 糖蜜酒精产业是我国目前重要的工业产业。该行业产生的废水具有有机含量高、 挥发性有机成分高的特性。本发明方法针对糖蜜酒精废水利用嗜盐古菌H. mediterranei, 在连续推流反应器内中对有机物废物进行资源回收，实现在开放环境中PHA的连续生产。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种在连续推流反应器中回收糖蜜酒精废水合成PHA，实 现PHA连续生产的方法。该方法可以大大降低PHA工业生产成本，从而使PHA更具市场竞 争力，应用更广泛。
[0006] 嗜盐古菌在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产PHA的方法，其特征在于，采 用的装置为公知的污水处理领域连续推流工艺反应器、鼓风曝气装置、SBR反应器，利用上 述的装置驯化培养嗜盐古菌H. mediterranei，在开放条件下实现PHA的连续生产，主要包 括以下步骤：
[0007] 步骤1，将菌株H. mediterranei按照公知的菌种活化方法进行活化；
[0008] 步骤2,挑取活化后的纯菌株到灭菌后的液体种子培养基，摇床震荡培养，转速 150rpm，温度37°C，溶解氧浓度> 3mg/L，培养48h ;5000rpm转速下离心悬浊液收获菌体，然 后将收获的菌体再次放入灭菌后的种子培养基中，同样条件下培养24h ;再次以5000rpm转 速离心收获培养的菌体，然后将离心收获的菌体全部置于SBR反应器中；
[0009] 步骤3,向盛有放大菌体的SBR反应器中加入糖蜜酒精废水，运行SBR反应器，控制 反应条件为温度室温，溶解氧> 3mg/L，曝气时间20-23h，沉淀l-4h，然后排掉上清液；反复 重复操作10-20次，直至SBR内的菌体干重达到3000mg/L以上；
[0010] 步骤4,将沉淀收获的SBR反应器中的菌体全部转到连续流反应器中，启动连续流 工艺装置，连续处理盐度范围在40-100g/L的糖蜜酒精废水，连续流的工艺参数为：水力停 留时间12-20h，有机负荷为0. 86-1. 43kgC0DAkgMLSS d)，曝气池溶解氧浓度彡3mg/L，污 泥停留时间4-6d，污泥回流比为200-300%，运行温度为室温，二沉池沉淀时间3-5h ;
[0011] 步骤5，连续运行步骤4连续推流工艺20-30d后，对每日从二沉池排出的剩余污泥 进行PHA的提取和生产。
[0012] 连续运行步骤4连续推流工艺20-30d后，系统对糖蜜酒精废水的C0D去除率可以 达到80%，糖蜜酒精废水转化成PHA的转化率为0. 5-0.8g PHA/g C0D，连续运行生产的PHA 为共聚物PHBV。PHA的含量达到约菌体干重的40%以上。
[0013] 本发明具有以下优点：
[0014] (1)目前国内的PHA生产主要集中于单底物发酵工艺，使用单底物成本很高，并且 合成PHA的组分单一，PHA应用范围较窄。本发明利用工业废水的复杂底物，不仅改善了底 物的单一性，同时进行了废水的资源化；
[0015] (2)本发明中使用嗜盐菌，优点在于：①高盐环境限制了其他非嗜盐微生物的生 长，因此可以省略严格的灭菌程序；②嗜盐微生物胞内积累的PHA在淡水环境很容易通过 溶胞释放，便于下游回收PHA。③嗜盐微生物积累的产物PHA多为特殊的共聚物，其物理性 能更适合生产应用，因此应用前景更好。这些优势对进一步降低PHA生产成本，扩大PHA适 用范围具有重要的意义。
[0016] (3)连续流工艺简单，相比较发酵工艺，无需反复更换发酵液，无需反复接种菌泥， 连续进水连续出水，各工艺参数趋于恒定值，实现简单，便于自动控制，易于工程操作；
[0017] (4)该工艺无需发酵罐冲洗装置、pH调节装置等硬件设备，减少设备成本，同时节 约能耗；
[0018] (5)连续流工艺的污泥产量高，从二沉池排出的剩余污泥直接用于PHA的提取和 生产，PHA产量高，实现了 PHA的连续生产，同时也做到了剩余污泥的资源化利用。
【具体实施方式】
[0019] 以下结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不限于以下实 施例。
[0020] 实施例1
[0021] 在实施例中，所用菌种为Haloferax mediterranei，菌种编号ATCC 33500。
[0022] 该菌株的种子培养基配方为：每1L去离子水对应蛋白胨7. 5g、酵母提取物10g、柠 檬酸钠3g、硫酸镁20g、氯化钾2g、硫酸亚铁0. Olg、氯化钠200g所组成的培养基，调节pH 至 7. 2。
[0023] 具体实施步骤如下：
[0024] 步骤1，将购买到的菌株H. mediterranei按照公知的菌种活化方法进行活化。
[0025] 步骤2,挑取活化后的纯菌株到200ml灭菌后的液体种子培养基，摇床震荡培养， 温度37°C，转速150rpm，溶解氧浓度> 3mg/L，培养48h。5000rmp转速下离心菌悬液收获菌 体，然后将离心后的菌体全部转入到1L灭菌后的液体种子培养基中，37°C下摇床震荡培养 24h，转速150rpm，将1L菌悬液再次离心，再次以5000rpm转速离心收获培养的菌体。然后 将离心收获的菌体全部置于10L SBR反应器中。
[0026] 步骤3,向盛有放大菌体的SBR反应器中加入8L糖蜜酒精废水，运行SBR反应器。 控制反应条件为温度室温，溶解氧浓度> 3mg/L，曝气20h，沉淀4h，排掉4L上清液。然后加 入4L糖蜜酒精废水，按照上述步骤重复操作12次。SBR内菌体干重达到3500mg/L。
[0027] 步骤4,将沉淀收获的SBR反应器中的菌体转到连续流反应器中，开始进行连续流 驯化培养。糖蜜酒精废水C0D浓度为2500mg/L，进水C/N= 50,盐度=50g/L。水力停留时 间12h，有机负荷为1. 43kgC0DAkgMLSS d)，曝气池溶解氧浓度彡3mg/L，污泥停留时间5d， 污泥回流比为300%，运行温度为室温，二沉池沉淀时间4h。污泥主要在曝气区消耗废水 中的碳源合成PHA。
[0028] 步骤5,连续运行连续推流工艺25d后，系统对糖蜜酒精废水的C0D去除率可以达 到50%以上。糖蜜酒精废水转化成PHA的转化率为0. 588g PHA/g C0D。生产的PHA为共 聚物PHBV。PHA的含量达到约菌体干重的21 %。
[0029] 步骤6,对每日排出连续流系统的剩余污泥进行PHA回收。
[0030] 实施例2
[0031] 在实施例中，所用菌种为Haloferax mediterranei，菌种编号ATCC 33500。
[0032] 该菌株的种子培养基配方为：每1L去离子水对应蛋白胨7. 5g、酵母提取物10g、柠 檬酸钠3g、硫酸镁20g、氯化钾2g、硫酸亚铁0. 01g、氯化钠200g所组成的培养基，调节pH 至 7. 2。
[0033] 具体实施步骤如下：
[0034] 步骤1，将购买到的菌株H. mediterranei按照公知的菌种活化方法进行活化。
[0035] 步骤2,挑取活化后的纯菌株到200ml灭菌后的液体种子培养基，摇床震荡培养， 温度37°C，转速150rpm，溶解氧浓度> 3mg/L，培养48h。5000rmp转速下离心菌悬液收获菌 体，然后将离心后的菌体全部转入到1L灭菌后的液体种子培养基中，37°C下摇床震荡培养 24h，转速150rpm，将1L菌悬液再次离心，再次以5000rpm转速离心收获培养的菌体。然后 将离心收获的菌体全部置于10L SBR反应器中。
[0036] 步骤3,向盛有放大菌体的SBR反应器中加入8L糖蜜酒精废水，运行SBR反应器。 控制反应条件为温度室温，溶解氧浓度> 3mg/L，曝气20h，沉淀4h，排掉4L上清液。然后加 入4L糖蜜酒精废水，按照上述步骤重复操作12次。SBR内菌体干重达到3500mg/L。
[0037] 步骤4,将沉淀收获的SBR反应器中的菌体转到连续流反应器中，开始进行连续流 驯化培养。糖蜜酒精废水C0D浓度为2500mg/L，进水C/N= 50,盐度=50g/L。水力停留时 间16h，有机负荷为1. 07kgC0DAkgMLSS d)，曝气池溶解氧浓度彡3mg/L，污泥停留时间5d， 污泥回流比为300%，运行温度为室温，二沉池沉淀时间4h。污泥主要在曝气区消耗废水中 的碳源合成PHA。
[0038] 步骤5,连续运行连续推流工艺25d后，系统对糖蜜酒精废水的C0D去除率可以达 到80%以上。糖蜜酒精废水转化成PHA的转化率为0. 76g PHA/g C0D。生产的PHA为共聚 物PHBV。PHA的含量达到约菌体干重的43%。
[0039] 步骤6,对每日排出连续流系统的剩余污泥进行PHA回收。
[0040] 实施例3
[0041] 在实施例中，所用菌种为Haloferax mediterranei，菌种编号ATCC 33500。
[0042] 该菌株的种子培养基配方为：每1L去离子水对应蛋白胨7. 5g、酵母提取物10g、柠 檬酸钠3g、硫酸镁20g、氯化钾2g、硫酸亚铁0. 01g、氯化钠200g所组成的培养基，调节pH 至 7. 2。
[0043] 具体实施步骤如下：
[0044] 步骤1，将购买到的菌株H. mediterranei按照公知的菌种活化方法进行活化。
[0045] 步骤2,挑取活化后的纯菌株到200ml灭菌后的液体种子培养基，摇床震荡培养， 温度37°C，转速150rpm，溶解氧浓度> 3mg/L，培养48h。5000rmp转速下离心菌悬液收获菌 体，然后将离心后的菌体全部转入到1L灭菌后的液体种子培养基中，37°C下摇床震荡培养 24h，转速150rpm，将1L菌悬液再次离心，再次以5000rpm转速离心收获培养的菌体。然后 将离心收获的菌体全部置于10L SBR反应器中。
[0046] 步骤3,向盛有放大菌体的SBR反应器中加入8L糖蜜酒精废水，运行SBR反应器。 控制反应条件为温度室温，溶解氧浓度> 3mg/L，曝气20h，沉淀4h，排掉4L上清液。然后加 入4L糖蜜酒精废水，按照上述步骤重复操作12次。SBR内菌体干重达到3500mg/L。
[0047] 步骤4,将沉淀收获的SBR反应器中的菌体转到连续流反应器中，开始进行连续流 驯化培养。糖蜜酒精废水C0D浓度为2500mg/L，进水C/N = 50,盐度=50g/L。水力停留 时间20h，有机负荷为0. 857kgC0DAkgMLSS d)，曝气池溶解氧浓度彡3mg/L，污泥停留时间 5d，污泥回流比为300%，运行温度为室温，二沉池沉淀时间4h。污泥主要在曝气区消耗废 水中的碳源合成PHA。
[0048] 步骤5,连续运行连续推流工艺25d后，系统对糖蜜酒精废水的C0D去除率可以达 到70%以上。糖蜜酒精废水转化成PHA的转化率为0.680g PHA/g C0D。生产的PHA为共 聚物PHBV。PHA的含量达到约菌体干重的34%。
[0049] 步骤6,对每日排出连续流系统的剩余污泥进行PHA回收。
【权利要求】
1. 嗜盐古菌在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产PHA的方法，其特征在于，采用 的装置为污水处理领域连续推流工艺反应器、鼓风曝气装置、SBR反应器，利用上述的装置 驯化培养嗜盐古菌H. mediterranei，在开放条件下实现PHA的连续生产，主要包括以下步 骤： 步骤1，将菌株H. mediterranei进行活化； 步骤2,挑取活化后的纯菌株到灭菌后的液体种子培养基，摇床震荡培养，转速 150rpm，温度37°C，溶解氧浓度> 3mg/L，培养48h ;5000rpm转速下离心悬浊液收获菌体，然 后将收获的菌体再次放入灭菌后的种子培养基中，同样条件下培养24h ;再次以5000rpm转 速离心收获培养的菌体，然后将离心收获的菌体全部置于SBR反应器中； 步骤3,向盛有放大菌体的SBR反应器中加入糖蜜酒精废水，运行SBR反应器，控制反应 条件为温度室温，溶解氧> 3mg/L，曝气时间20-23h，沉淀l-4h，然后排掉上清液；反复重复 操作10-20次，直至SBR内的菌体干重达到3000mg/L以上； 步骤4,将沉淀收获的SBR反应器中的菌体全部转到连续流反应器中，启动连续流工艺 装置，连续处理盐度范围在40-100g/L的糖蜜酒精废水，连续流的工艺参数为：水力停留时 间12-20h，有机负荷为0. 86-1. 43kgCODAkgMLSS d)，曝气池溶解氧浓度彡3mg/L，污泥停 留时间4-6d，污泥回流比为200-300%，运行温度为室温，二沉池沉淀时间3-5h ; 步骤5,连续运行步骤4连续推流工艺20-30d后，对每日从二沉池排出的剩余污泥进行 PHA的提取和生产。
2. 按照权利要求1的方法，其特征在于，连续运行步骤4连续推流工艺20-30d后，系 统对糖蜜酒精废水的COD去除率达到80%，糖蜜酒精废水转化成PHA的转化率为0. 5-0. 8g PHA/g COD，PHA的含量达到约菌体干重的40%以上。
【文档编号】C02F3/12GK104195185SQ201410324698
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】崔有为, 冀思远, 张宏宇 申请人:北京工业大学