专利名称：极端嗜盐古菌NaSOD基因在提高水稻耐盐性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及极端嗜盐古菌NaSOD基因在提高水稻耐盐性中的应用。
背景技术：
随着生态环境的恶化、设施农业的发展和化肥使用的不当，土壤盐渍化已成为一个世界性的资源问题和生态问题，盐碱地的面积逐年增加(Mahajan S，Tuteja N. Cold, salinity and drought stresses :an overview [J] · Arch.)。据不完全统计，全世界盐喊地面积约9.讨亿111112尔40，2008)。我国盐渍土面积大，分布广泛，类型多样，各类盐碱地面积总计9913. 3万hm2，其中现代盐碱土面积为3693万hm2，残余盐碱土约4487万hm2，并且尚存在有约1733万hm2的潜在盐碱土(李彬等.中国盐碱地资源与可持续利用研究[J].干旱地区农业研究.2005，23 :巧4-158.)。盐胁迫已经成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要限制因素。解决土壤盐渍化一般采取以下两种措施，一是用排水和灌溉洗盐等物理方法或石膏和硫磺等化学方法改良土壤；二是通过常规育种或生物技术手段培育耐盐作物品种。前者投入成本高。目前生物改良措施(如种植耐盐植物)已成为治理盐碱地最积极主动而长期有效的途径，提高植物尤其是作物的耐盐性已是未来农业发展的重大课题之一。功能基因的发掘与利用是当今世界生物资源竞争的制高点。一旦谁拥有更多的功能基因资源，谁就会在生物经济竞争中掌握主动权。海底热液口和高山盐湖是地球上二个最为典型的极端环境。高山盐湖是古海洋的残留产物，与盐池同样具有太阳辐射强、多风少雨、蒸发量大等极端恶劣的环境条件，使得原本丰富的生物图消失了，而进化出了高山盐湖特有的生物种类-嗜盐微生物。这些具有高度耐盐能力的生物在长期进化的过程中不断完善了它们的代谢途径以适应由高盐引起的巨大渗透压。自上个世纪50年代，人们就开展了其适应机理的研究，但是高山盐湖耐高盐基因资源的开发利用到目前为止尚未有突破性的进展。生物学家和育种家通过传统的育种方法培育耐盐品种，提高植物的耐盐能力，从而减轻盐碱对农林业生产的影响，现已取得一定的进展，但发展缓慢。转基因技术打破了物种之间的生殖隔离障碍，拓宽植物资源的遗传背景，直接在基因水平上改造植物的遗传物质，定向改造植物的遗传性状或特性，从而有效地提高植物的耐盐性，弥补常规育种方法的不足。至今植物抗盐转基因工程的研究取得了长足的进展，展现出诱人的前景。如Ohta等 (2002)将液泡型Na+/H+反向转运蛋白(SOSl)基因转入水稻中，可显著提高转基因植株后代的耐盐性。将胞间囊泡转运蛋白在拟南芥中过表达，转基因植物降低了 ROS的积累，提高了耐盐能力(Alexander Μ, Yehoram L, Budhi ST, Alex L. Induction of salt and osmotic stress tolerance by overexpression of an intracellular vesicle trafficking protein AtRab7 (AtRabG3e) [J]. Plant Physiol，2004，134 :118-1 .)。P5CS(2_ 氢吡咯 5-羧酸合成酶)基因是合成脯氨酸必需的中间酶，将P5CS基因转入烟草、小麦、马铃薯和水稻，转基因植株的耐盐性均明显高于对照。植物体内ROS清除系统活性或含量的高低是植物耐盐性的重要指标之一。 SOD (superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)是抗氧化系统中的第一道防线，在酶保护系统中处于核心地位。许多研究发现，在盐分胁迫下，植物体内SOD等酶的活性与植物的抗氧化胁迫能力呈正相关。将SOD基因转入不同作物中，如水稻、烟草、白菜和辣椒，其转基因株系的耐盐性均显著增强。水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，是世界近一半人口、特别是亚洲居民的主粮。但由于大量盐渍化土壤的存在，使得相当大的一部分水稻，受不同程度盐害而产量大幅度降低。充分利用抗盐基因培育出新的抗盐新品种，是提高作物抗盐性经济、有效的方法。中国专利申请 200810163748. 8 公开了极端嗜盐菌(Natrinema altunense sp.) 高盐耐受相关蛋白及其编码基因与应用，该基因的序列为序列表SEQ. ID. NO. 1所示，序列全长为6(X3bp，编码的蛋白为嗜盐古菌的MnSOD。该基因在大肠杆菌中表达可提高大肠杆菌耐受高盐环境的能力。
发明内容
本发明提供了一种极端嗜盐古菌(Natrinema altunense sp. )NaSOD基因在提高水稻耐盐性中的应用。一种极端嗜盐古菌(Natrinema altunense sp. ) NaSOD基因在提高水稻耐盐性中的应用，所述的极端嗜盐古菌NaSOD基因的碱基序列如SEQ IDN0. 3所示。具体包括构建包含所述极端嗜盐古菌NaSOD基因的表达载体，通过农杆菌介导将极端嗜盐古菌(Natrinema altunense sp.)NaSOD基因转入水稻细胞，培养生成水稻耐盐植株。所述的表达载体包括原始载体和插入原始载体的启动子和终止子，所述的原始载体为 pCAMBIA1301。所述的启动子为CaMV 35S启动子。所述的终止子为NOS终止子。过表达NaSOD转基因水稻具有较高的ROS清除能力，能够减轻盐处理引起的膜脂过氧化，从而保证了较高的光合速率，本发明将极端嗜盐古菌(Natrinema altunense sp.) NaSOD基因转入水稻中，可显著提高水稻耐盐性能。
图1为植物表达载体pl301_NaS0D构建示意图；图 2 为 ρ 1301-NaSOD 转基因水稻 T0 代 PCR 检测，M :DL 2000 DNAladder ；NC 水； WT:野生型；1-14:转基因植株;图3为NaCl盐处理8d对水稻幼苗生长的影响；A =Ommol/L NaCl ；B =IOOmmol/L NaCl。WT 野生型水稻；L1、L2 转基因水稻；图4为SOD活性分析；A 盐胁迫对SOD酶活性的影响，0，3，6 =IOOmmol/L NaCl处理天数；Student' s t-test. (*，P ^ 0. 05 ；**，P ^ 0. 01) ；B :S0D 染色分析WT 野生型水稻；Li、L2 转基因水稻。TOTAL 总SOD活性；H2O2处理后染色的是MnSOD活性。Li、L2有两条条带，上面一条为水稻MnSOD，下面一条为NaSOD ；图5为盐胁迫对O2. _产生速率和H2O2含量的影响；A 0厂产生速率；B =H2O2含量；WT 野生型水稻；Li、L2 转基因水稻；0，3，6 盐处理天数；Student' s t_test. (*， P ≤ 0· 05)；图6为盐胁迫对水稻叶片相对电导率和MDA含量的影响；A 相对电导率；B :MDA含量；WT 野生型水稻；L1、L2 转基因水稻；0，3，6 盐处理天数；图7为盐胁迫对水稻幼苗光合速率和叶绿素荧光参数的影响；A 净光合速率 (Pn) ；B =PSII的最大光化学效率(Fv/Fm) ；C 有效光化学量子产量(Fv' /Fm’)；D 电子传递速率(ETR) ；WT 野生型水稻；Li、L2 转基因水稻；0，3，6 盐处理天数；Student' s t-test.(氺，P^O. 05)。
具体实施例方式实施例1表达载体pl301_NaS0D构建培养含质粒pGEX-SOD(专利申请200810163748. 8)的大肠杆菌，用嗜盐古菌NaSOD 基因的特异性引物(分别添加I3St I和Kpn I酶切位点)进行菌液PCR，将回收纯化的PCR 产物连接到中间载体PMD19-T上，转化大肠杆菌DH5ci。挑取阳性克隆，PCR及测序鉴定。 摇取正确的菌液提取质粒pMD19-NaS0D。Pst I和Kpn I双酶切质粒pMD19_NaS0D，然后插入pCAMBIA1301的多克隆位点中，并在目的基因前后分别插入CaMV35S启动子和NOS终止子，得植物表达载体pl301-NaS0D (如图1所示)。重组子经酶切鉴定后，冻融法导入农杆菌 EHA105 中。NaSOD特异性引物NaSOD-F :5’ -CGGGGTACCATGACTGATCACGAACTTCCAC-3’ (Kpn I)NaSOD-R :5，-AAACTGCAGTTACTCGAAGTGGTCGAG GCAG-3，(Pst I)实施例2农杆菌介导的水稻遗传转化分别采用水稻的成熟胚为外植体诱导、培养愈伤组织，挑选胚性愈伤组织作为转化受体°按照见6[等(Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T. Efficient transformation of rice(Oryza sativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J]. Plant. 1994，6 :271-82.)的遗传转化策略，通过携带植物表达载体pl301-NaMnS0D的根癌农杆菌EHA105转化到水稻愈伤组织中，经一系列筛选，分化得到转基因水稻。具体如下(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导及继代培养日本晴(Oryza sativa L. cv. Nipponbare)成熟种子去壳后以70%酒精消毒2min，20% (V/V)次氯酸钠溶液(加2 3 滴吐温-200)浸泡30min，用无菌蒸馏水清洗种子4 5遍后以无菌滤纸吸干表面水分，移至成熟胚诱导培养基中二8°C光照培养2周，诱导愈伤组织；用镊子将愈伤组织取出，转入继代培养基中，28°C光照培养，继代培养1周即可用于转化。(2)农杆菌的培养在感染前1周，活化农杆菌。感染前2 3d，在含50mg/L Kam(卡那霉素)和40mg/L Rif (利福平)的YM培养基上划线，28°C暗培养。收集菌体，将其悬浮于含有200 μ mol/L已酰丁香酮(As)的AAM液体悬浮培养基，调整菌体浓度至0D600为0.8 1.0，既可用于转化。(3)侵染将准备好的水稻愈伤组织转移到无菌三角瓶中，倒入适量农杆菌悬浮液，侵染15min。(4)共培养倾去菌液，将愈伤组织置于无菌滤纸上浙干30 40min。然后将愈伤组织置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基于25°C暗培养3d。(5)抗性愈伤组织的筛选及植株再生将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗后晾干，转入含500mg/L羧苄青霉素和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28 °C，暗培养14天；长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的选择培养基上进行第二轮选择，28°C，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；选择致密的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上，于25°C，1 光照/1 黑暗条件下培养；待再生小苗长成约1 2cm高时，将其移到生根培养基，25°C，光周期培养；(6)炼苗与移栽将苗根部和茎叶分化得较完好的挑出，打开封口膜，炼苗3d至1 周左右，洗去琼脂，培养箱水培1周，移栽到温室的土钵中种植。实施例3转基因植株的鉴定潮霉素筛选再生苗移栽到温室后，选取同位新叶，取2 3cm，浸泡于含50mg/L 潮霉素和1. Omg/L 6-BA的无菌水中。5d后非转基因水稻叶片变黄变褐，假阳性植株叶片也变黄，转化植株叶片保持绿色。转基因水稻的PCR检测SDS法提取水稻叶片总DNA，以NaSOD特异性引物扩增，14 株转基因样本均在621bp处有条带(如图2所示)。实施例4转基因水稻的耐盐性观察Tl代种子用潮霉素筛选，选择感/抗比为1 3的两个株系，继续繁殖。纯合株系及野生型以国际水稻所标准营养液(Yoshida et al. ,1976)进行水培，20d后以lOOmmol/L NaCl处理，处理3d后野生型植株下部老叶失水萎蔫，上部新叶叶尖变黄且发生卷曲，但转基因植株盐处理5d后才开始萎蔫和卷曲现象。8d后，野生型植株几乎整株萎蔫、枯萎，而转基因水稻只有下部老叶枯萎(如图3所示)。 实施例5转基因水稻的耐盐机理分析另选水培至35d的幼苗，以100mmol/L NaCl处理3d和6d，测定SOD活性、光合气
体交换参数、叶绿素荧光参数、丙二醛含量。Brennan (Brennan Τ, Rychter A, Frenkel C. Activity of enzymes involved in the turnover of hydrogen peroxide during senescence[J]. Bot Gaz. . 1979，140 :384-388.)的方法略作修改。待测样品0. Ig在预冷研钵中加液氮研磨成粉末状，以 2mL 预冷的提取缓冲液(50mmol/L PBS pH7. 0, lmmol/L EDTA,3mmol/L DTT 禾口 5% PVP-40)，冰浴研磨。勻浆物在4°C，15000Xg离心20min，上清液用于酶活性分析。SOD定量分析用NBT染色法。如图4 (A)所示，在正常条件下，转基因植株的SOD总酶活比非转基因水稻的SOD总酶活分别高出14. 3%和14. 5%，达到显著性差异。随着IOOmM NaCl的处理，转基因植株的SOD总酶活呈逐渐上升的趋势，非转基因水稻的SOD总酶活先上升后下降。盐处理第6天时，转基因植株的SOD总酶活远远高于非转基因水稻的SOD总酶活，达到极显著水平。SOD定性分析首先用非变性PAGE垂直平板凝胶电泳分离，每齿点样8_10 μ L上清液(约50 μ g蛋白)，电泳时上层2. 5%凝聚胶为15mA，下层10%分离胶为20mA，约2. 5h 可电泳完毕。电泳后凝胶用蒸馏水洗2遍，加入SOD活性染液1(2. 45mmol/L NBT)，黑暗下浸泡 30min，倒掉染液 I，加入 SOD活性染液 II (28mmol/L TEMED, 0. 028mmol/L核黄素，36mmol/ L PBS，pH 7. 8)黑暗浸泡20min，倒掉染液II，快速用蒸馏水洗2遍，倒入50mM PBS (pH 7.8， 10mmol/L EDTA)置于36W日光灯下显色，至青紫色背景中显出SOD透明亮带。可在SOD活性染液II加入5mmol/L H2O2抑制!^eSOD和Cu/ZnSOD的活性，从而分辨出水稻MnSOD和 NaSOD。如图4(B)所示，非转基因水稻显示六条带，转基因水稻电泳胶上多出一条新的带， 并且这条带经H2A处理后仍然存在。因为H2A会抑制i^eSOD和Cu/ZnSOD的活性，但MnSOD 对H2A不敏感，说明转基因水稻电泳胶上多出这一新的条带为来自嗜盐古菌的MnSOD，所以 NaMnSOD已成功地在转基因植株中功能性表达。0厂产生速率的测定取待测样品0. 2g加3mL磷酸钾缓冲液(50mmol/L，pH 7. 0)， 冰浴研磨，勻浆液IOOOOXg离心20min，取上清为0厂提取液。0. 5mL样品提取液中加入 0. 5mL磷酸钾缓冲液(50mmol/L，pH7. 8)和lmmol/L盐酸羟胺lmL，摇勻，于25°C中保温lh， 然后再加入17mmol/L对氨基苯磺酸ImL和7mmol/L α -萘胺lmL，混勻，于25°C中保温 20min,于波长530nm下测定OD值。用N02_作标准曲线，若要排除叶绿素干扰，可在样品与羟胺温浴后，加入等体积的乙醚萃取叶绿素，离心吸取下相，在530nm比色。结果以[nmol/ (min. gFff)]表示。H2O2含量的测定称取0. Ig叶片在液氮中研磨成粉末状，加入3mL预冷的提取缓冲液(50mmol/L PBS, ρΗ7· 0)冰浴研磨。勻浆物以6000X g，4°C离心25min，上清液为H2O2 提取液。3mL提取液加入ImL 0.1%氯化钛(含20%硫酸)，6000Xg离心15min，取上清液于410nm下测定OD值。消光系数0. 28 μ mol/L · cm。如图5㈧所示，随着盐胁迫时间的延长，转基因植株与非转基因水稻叶片内 0厂产生速率都有升高的趋势，但IOOmM NaCl处理6d后，转基因植株叶片内02__产生速率又有所下降，分别升高了 15.4%和16.2%，而非转基因水稻叶片内0厂产生速率升高了 49. 9%。如图5⑶所示，H2A含量的变化趋势和02__产生速率的变化趋势相似。盐处理3 天后非转基因水稻的H2O2含量增加了 62%，而转基因植株分别增加了和19%。胁迫 6天后，转基因植株含量只增加了 8. 75%和7. 3%，非转基因水稻却增加了 46. 7%。总之， IOOmM NaCl胁迫下，转基因植株H2A含量显著低于非转基因水稻的H2A含量，因此过表达 NaSOD转基因水稻具有较高的ROS清除能力。相对电导率的测定称取新鲜叶片0. lg，加20mL双蒸水，抽真空lOmin，室温浸泡过夜，用电导仪(H0RIBA.)测定溶液初电导率Re，之后将叶片连同浸泡液一起置于沸水浴中加热lOmin，冷却至室温后再次测定溶液终电导率Re’，最后计算相对电导率(Rec = Re/ Re，X 100% ) ο每样重复3次。丙二醛含量测定称取0. Ig水稻叶片在液氮中研磨成粉末状，以3mL预冷的提取缓冲液勻菜(50mmol/L PBS ρΗ7· 0，3mmol/L DTT，lmmol/L EDTA_Na2，5% PVP)。勻浆物以 4000Xg离心lOmin，上清液为样品提取液。取上清液Iml加入3mL 27%三氯乙酸和ImL 2%巴比妥酸，混合物沸水浴保温30min，冰浴上迅速冷却后，15000Xg离心lOmin，在分光光度计上分别于450nm、532nm、600nm处测定上清液的OD值。MDA的浓度按照如下公式计算MDA ( μ mol/L) = 6· 45 X (OD532-OD600) _0· 56 X OD450。如图6(A)所示，正常条件下，转基因水稻的相对电导率与对照没有显著差异。随着IOOmM NaCl处理时间的延长，两种水稻的相对电导率均不断增加，说明随着盐胁迫时间的延长，膜透性增加，对膜伤害越来越严重。但转基因水稻的相对电导率均小于对照组，且达到显著性差异，表明IOOmM NaCl胁迫下，转基因植株膜稳定性好，受到的伤害小，即转基因植株对盐胁迫耐性增强。如图6(B)所示，正常条件下，转基因水稻的MDA含量与对照没有显著差异。但盐处理3d后，非转基因水稻MDA含量增加达148. 3 %，而转基因植株只增加了 44%和18. 2%。 盐处理6d后膜脂过氧化程度有所下降，可能是由于此时它的膜泄露程度过大而膜脂过氧化程度有所降低。但转基因植株的MDA含量仍显著性低于非转基因水稻。说明转基因植株更能有效地清除R0S，降低盐胁迫诱导的活性氧对植物造成氧化损伤。光合气体交换参数与叶绿素荧光参数的测定选取长势一致的完全展开的第五叶片，用美国LI-COR公司生产的LI-6400便携式光合系统于处理后0、3、6d在8:00-11:00测定其光合速率(Pn)，每次测定重复三次，每处理测3株水稻。用LI-6400配套的荧光叶室， 测定相同叶位的叶绿素荧光。测定前植株要暗适应30min。暗适应30min的植株测R)，用 0. 8-s饱和的红蓝光8000 μ mol JiT2iT1照射，获取最大荧光(Fm)，然后，把植株置于持续的光化学活性光(PPFD = 1500 μ mol πΓ、—1)光平衡30min，得到稳态荧光(Fs)；接着，用饱和光 (PPFD = 6000 μ mol mH照射，得到光适应后的最大荧光(Fm’)；最后施加远红光以测量光适应最小荧光你’。其他的叶绿素荧光参数按下述公式计算PSII 的最大光化学活性(Fv/Fm) = (Fm-Fo)/Fm ；PSII 原初光能转化效率(Fv，/Rn，)= 0 ' -Fo' )/Fm'；PSII 的电子传递速率(ETR) = (Fm' -Fs)/Fm' 1X0.84X0.5。如图7(A)所示，盐胁迫导致转基因植株与非转基因水稻叶片净光合速率(Pn)持续下降，但转基因植株的下降程度较轻，从而维持在盐胁迫下有较高的光合效率。如图7 (B) 所示，盐胁迫导致转基因植株与非转基因水稻的Fv/Fm随着盐胁迫而持续下降，但转基因植株的Fv/Fm下降幅度很小，与非转基因水稻相比达到了显著性差异，说明较IOOmMNaCl盐胁迫导致非转基因水稻PSII的永久失活或破坏而言，转基因植株对PSII有较好的保护作用。如图7(C)和7(D)所示，Fv’ /Fm’和ETR的变化趋势与Fv/Fm相似，进一步说明转基因植株能降低ROS对叶绿体类囊体膜的损伤从而保证了较高的光合速率。
权利要求
1.一种极端嗜盐古菌(Natrinema altunense sp.) NaSOD基因在提高水稻耐盐性中的应用，所述的极端嗜盐古菌NaSOD基因的碱基序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括构建包含所述极端嗜盐古菌NaSOD基因的表达载体，通过农杆菌介导将极端嗜盐古菌 (Natrinema altunense sp.)NaSOD基因转入水稻细胞，培养生成水稻耐盐植株。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的表达载体包括原始载体和插入原始载体的启动子和终止子，所述的原始载体为PCAMBIA1301。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的启动子为CaMV35S启动子。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的终止子为NOS终止子。
全文摘要
本发明公开了一种极端嗜盐古菌(Natrinema altunense sp.)NaSOD基因在提高水稻耐盐性中的应用，所述的极端嗜盐古菌NaSOD基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。过表达NaSOD转基因水稻具有较高的ROS清除能力，能够减轻盐处理引起的膜脂过氧化，从而保证了较高的光合速率，本发明将极端嗜盐古菌NaSOD基因转入水稻中，可显著提高水稻耐盐性能。
文档编号C12N15/53GK102399816SQ20111036030
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者朱诚, 杨卫军, 潘艳会, 陈珍 申请人:中国计量学院, 台州学院, 浙江大学