一种石油污染土壤的微生物修复方法与流程

本发明属于对石油污染土壤修复及油泥处理的方法，具体涉及对西北干旱地区石油污染土壤的微生物修复方法。

背景技术：

我国是石油生产和消费大国，由于石油石化企业储油罐、石油集输管道和地下储油罐的破损渗漏以及钻采过程中突发事件的发生，使其周边土壤受到一定的污染。其特点具有污染面积大，污泥组成性质复杂，包括水、石油类、重金属、黏土、砂石等，其处理难度大、毒性高。目前国内外对污油泥处理的方法有：溶剂萃取法，热洗剂法，固化法，热解法，生物法(原位、异位)。其中溶剂萃取法和热洗涤法能耗大成本高，固化法容易造成二次污染，热接法可针对一些可回收原油的含油污泥。微生物技术以其独特的优势得到了国内外专家的广泛认同，是传统生物处理方法的延伸，具有治理面积大、不造成二次污染、费用低廉、形式多样灵活、不破坏土壤结构等优点。

基于此，本发明对现场产生的各种污油泥进行了微生物降解处理，并对降解的最佳条件进行了摸索，不仅经济可行，而且可操作性强，适合于大规模处理石油污染土壤及油泥。

技术实现要素：

本发明目的在于，提供一种石油污染土壤的微生物修复方法，该方法利用铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp以及生物表面活性剂联合修复石油污染土壤，该方法对石油污染土壤或油泥中石油烃具有显著的降解效果。受试石油污染土壤的起始含油量为20000mg/kg-130000mg/kg，降解效率可达到75-91％。该方法具有处理效率高，无二次污染等优点。

本发明所述的一种石油污染土壤的微生物修复方法，按下列步骤进行：

a.采集油井附近石油污染土壤，将其晒干碾碎，去除挥发性烃类和水份；

b.将步骤a的土壤中按体积比10-30％加入粒径为1-5mm的生物质粉末为棉杆粉末、锯末、稻壳、玉米杆粉末混合均匀，并调节含水率为20-30％，调节pH为7.5；

c.制备表面活性剂粗品：将无机盐培养基为NH₄Cl 0.776g，KH₂PO₄ 0.05g，K₂HPO₄0.05g，CaCl₂ 0.001g，MgSO₄ 0.01g，超纯水100mL，pH 7.5，放入250mL锥形瓶中，并加入4g正十六烷，温度121℃高温灭菌20min，待冷却后接入铜绿假单胞菌液Pseudomonas aeruginosa，并用透气膜封口，放入温度30℃恒温摇床中，120r/min培养96小时，得到表面活性剂粗品；

d.将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp按体积比0.9:1混合，将混合菌液接入步骤b所得土壤体系中，接菌量为1×10⁹～1.5×10⁹个/g土壤，同时加入200-500mL/kg的表面活性剂粗品，再加入NH₄Cl、KH₂PO₄和K₂HPO₄作为营养液氮源和磷源，其中氮∶磷质量比为10:1；

e.将步骤d中配好的反应体系堆成堆状，控制反应温度20-30℃，保持反应体系中水分含量为20-30％，定期搅拌通气，反应45天后取样检测。

本发明所述的一种石油污染土壤的微生物修复方法，该方法中涉及的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，无色杆菌Achromobacter sp是从新疆克拉玛依红山油田污染土壤中按常规方分离得到的，经过与美国国家生物技术信息中心核酸序列比对，鉴定出两种菌分别为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp。采集时间：2015年6月22日。

本发明所述的一种石油污染土壤的微生物修复方法，通过该方法其效果为：受试土壤的起始含油量为20000mg/kg-130000mg/kg土壤，降解效率为75-91％。

附图说明

图1为本发明不同含水率对复合菌降解石油污染土壤的影响图；

图2为本发明不同菌液量对降解石油污染土壤的影响图；

图3为本发明不同温度对复合菌降解石油污染土壤的影响图；

图4为本发明不同氮磷比的营养液对复合菌降解石油污染土壤的影响图；

图5为本发明不同pH值对复合菌降解石油污染土壤的影响。

具体实施方式

实施例1

a.采集油井附近石油污染土壤，将其晒干碾碎，去除挥发性烃类和水份；

b.将步骤a的土壤中按体积比10％加入粒径为1mm的生物质粉末为棉杆粉末混合均匀，并调节含水率为20％，调节pH为7.5；

c.制备表面活性剂粗品：将无机盐培养基为NH₄Cl 0.776g，KH₂PO₄ 0.05g，K₂HPO₄0.05g，CaCl₂ 0.001g，MgSO₄ 0.01g，超纯水100mL，pH 7.5，放入250mL锥形瓶中，并加入4g正十六烷，温度121℃高温灭菌20min，待冷却后接入铜绿假单胞菌液Pseudomonas aeruginosa，并用透气膜封口，放入温度30℃恒温摇床中，120r/min培养96小时，得到表面活性剂粗品，其溶液表面张力为26.68mN/m；

d.将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp按体积比0.9:1混合，将混合菌液接入步骤b所得土壤体系中，接菌量为1×10⁹个/g土壤，同时加入步骤c中得到的200mL/kg的表面活性剂粗品，再加入NH₄Cl、KH₂PO₄和K₂HPO₄作为营养液氮源和磷源，其中氮∶磷质量比为10:1；

e.将步骤d中配好的反应体系堆成堆状，控制反应温度20℃，保持反应体系中水分含量为20％，定期搅拌通气，反应45天后取样检测，土壤石油烃含量为2940mg/kg,降解率为85.3％。

实施例2

a.采集油井附近石油污染土壤，将其晒干碾碎，去除挥发性烃类和水份；

b.将步骤a的土壤中按体积比20％加入粒径为2mm的生物质粉末为锯末混合均匀，并调节含水率为25％，调节pH为7.5；

c.制备表面活性剂粗品：将无机盐培养基为NH₄Cl 0.776g，KH₂PO₄ 0.05g，K₂HPO₄0.05g，CaCl₂ 0.001g，MgSO₄ 0.01g，超纯水100mL，pH 7.5，放入250mL锥形瓶中，并加入4g正十六烷，温度121℃高温灭菌20min，待冷却后接入铜绿假单胞菌液Pseudomonas aeruginosa，并用透气膜封口，放入温度30℃恒温摇床中，120r/min培养96小时，得到表面活性剂粗品，其溶液表面张力为26.68mN/m；

d.将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp按体积比0.9:1混合，将混合菌液接入步骤b所得土壤体系中，接菌量为1.5×10⁹个/g土壤，同时加入步骤c得到的300mL/kg的表面活性剂粗品，再加入NH₄Cl、KH₂PO₄和K₂HPO₄作为营养液氮源和磷源，其中氮∶磷质量比为10:1；

e.将步骤d中配好的反应体系堆成堆状，控制反应温度25℃，保持反应体系中水分含量为25％，定期搅拌通气，反应45天后取样检测，土壤石油烃含量为6560mg/kg,降解率为86.9％。

实施例3

a.采集油井附近石油污染土壤，将其晒干碾碎，去除挥发性烃类和水份；

b.将步骤a的土壤中按体积比30％加入粒径为3mm的生物质粉末为稻壳混合均匀，并调节含水率为30％，调节pH为7.5；

c.制备表面活性剂粗品：将无机盐培养基为NH₄Cl 0.776g，KH₂PO₄ 0.05g，K₂HPO₄0.05g，CaCl₂ 0.001g，MgSO₄ 0.01g，超纯水100mL，pH 7.5，放入250mL锥形瓶中，并加入4g正十六烷，温度121℃高温灭菌20min，待冷却后接入铜绿假单胞菌液Pseudomonas aeruginosa，并用透气膜封口，放入温度30℃恒温摇床中，120r/min培养96小时，得到表面活性剂粗品，其溶液表面张力为26.68mN/m；

d.将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp按体积比0.9:1混合，将混合菌液接入步骤b所得土壤体系中，接菌量为1×10⁹个/g土壤，同时加入步骤c得到的400mL/kg的表面活性剂粗品，再加入NH₄Cl、KH₂PO₄和K₂HPO₄作为营养液氮源和磷源，其中氮∶磷质量比为10:1；

e.将步骤d中配好的反应体系堆成堆状，控制反应温度30℃，保持反应体系中水分含量为30％，定期搅拌通气，反应45天后取样检测，土壤石油烃含量为15000mg/kg,降解率为88.4％。

实施例4

a.采集油井附近石油污染土壤，将其晒干碾碎，去除挥发性烃类和水份；

b.将步骤a的土壤中按体积比30％加入粒径为4mm的生物质粉末为玉米杆粉末混合均匀，并调节含水率为20％，调节pH为7.5；

c.制备表面活性剂粗品：将无机盐培养基为NH₄Cl 0.776g，KH₂PO₄ 0.05g，K₂HPO₄0.05g，CaCl₂ 0.001g，MgSO₄ 0.01g，超纯水100mL，pH 7.5，放入250mL锥形瓶中，并加入4g正十六烷，温度121℃高温灭菌20min，待冷却后接入铜绿假单胞菌液Pseudomonas aeruginosa，并用透气膜封口，放入温度30℃恒温摇床中，120r/min培养96小时，得到表面活性剂粗品，其溶液表面张力为26.68mN/m；

d.将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp按体积比0.9:1混合，将混合菌液接入步骤b所得土壤体系中，接菌量为1.5×10⁹个/g土壤，同时加入步骤c得到的500mL/kg的表面活性剂粗品，再加入NH₄Cl、KH₂PO₄和K₂HPO₄作为营养液氮源和磷源，其中氮∶磷质量比为10:1；

e.将步骤d中配好的反应体系堆成堆状，控制反应温度20℃，保持反应体系中水分含量为20％，定期搅拌通气，反应45天后取样检测，土壤石油烃含量为2590mg/kg,降解率为90.4％。

实施例5

a.采集油井附近石油污染土壤，将其晒干碾碎，去除挥发性烃类和水份；

b.将步骤a的土壤中按体积比15％加入粒径为5mm的生物质粉末为棉杆粉末混合均匀，并调节含水率为30％，调节pH为7.5；

c.制备表面活性剂粗品：将无机盐培养基为NH₄Cl 0.776g，KH₂PO₄ 0.05g，K₂HPO₄0.05g，CaCl₂ 0.001g，MgSO₄ 0.01g，超纯水100mL，pH 7.5，放入250mL锥形瓶中，并加入4g正十六烷，温度121℃高温灭菌20min，待冷却后接入铜绿假单胞菌液Pseudomonas aeruginosa，并用透气膜封口，放入温度30℃恒温摇床中，120r/min培养96小时，得到表面活性剂粗品，其溶液表面张力为26.68mN/m；

d.将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp按体积比0.9:1混合，将混合菌液接入步骤b所得土壤体系中，接菌量为1.5×10⁹个/g土壤，同时加入步骤c得到的500mL/kg的表面活性剂粗品，再加入NH₄Cl、KH₂PO₄和K₂HPO₄作为营养液氮源和磷源，其中氮∶磷质量比为10:1；

e.将步骤d中配好的反应体系堆成堆状，控制反应温度30℃，保持反应体系中水分含量为30％，定期搅拌通气，反应45天后取样检测，土壤石油烃含量为2420mg/kg,降解率为91％。

实施例6

a.采集油井附近石油污染土壤，将其晒干碾碎，去除挥发性烃类和水份；

b.将步骤a的土壤中按体积比25％加入粒径为4mm的生物质粉末为锯末混合均匀，并调节含水率为25％，调节pH为7.5；

c.制备表面活性剂粗品：将无机盐培养基为NH₄Cl 0.776g，KH₂PO₄ 0.05g，K₂HPO₄0.05g，CaCl₂ 0.001g，MgSO₄ 0.01g，超纯水100mL，pH 7.5，放入250mL锥形瓶中，并加入4g正十六烷，温度121℃高温灭菌20min，待冷却后接入铜绿假单胞菌液Pseudomonas aeruginosa，并用透气膜封口，放入温度30℃恒温摇床中，120r/min培养96小时，得到表面活性剂粗品，其溶液表面张力为26.68mN/m；

d.将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp按体积比0.9:1混合，将混合菌液接入步骤b所得土壤体系中，接菌量为1×10⁹个/g土壤，同时加入步骤c得到的200mL/kg的表面活性剂粗品，再加入NH₄Cl、KH₂PO₄和K₂HPO₄作为营养液氮源和磷源，其中氮∶磷质量比为10:1；

e.将步骤d中配好的反应体系堆成堆状，控制反应温度25℃，保持反应体系中水分含量为25％，定期搅拌通气，反应45天后取样检测，土壤石油烃含量为2510mg/kg,降解率为90.7％。

实施例7

a.采集油井附近石油污染土壤，将其晒干碾碎，去除挥发性烃类和水份；

b.将步骤a的土壤中按体积比30％加入粒径为1mm的生物质粉末为稻壳，混合均匀，并调节含水率为30％，调节pH为7.5；

c.制备表面活性剂粗品：将无机盐培养基为NH₄Cl 0.776g，KH₂PO₄ 0.05g，K₂HPO₄0.05g，CaCl₂ 0.001g，MgSO₄ 0.01g，超纯水100mL，pH 7.5，放入250mL锥形瓶中，并加入4g正十六烷，温度121℃高温灭菌20min，待冷却后接入铜绿假单胞菌液Pseudomonas aeruginosa，并用透气膜封口，放入温度30℃恒温摇床中，120r/min培养96小时，得到表面活性剂粗品，其溶液表面张力为26.68mN/m；

d.将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp按体积比0.9:1混合，将混合菌液接入步骤b所得土壤体系中，接菌量为1×10⁹个/g土壤，同时加入步骤c得到的300mL/kg的表面活性剂粗品，再加入NH₄Cl、KH₂PO₄和K₂HPO₄作为营养液氮源和磷源，其中氮∶磷质量比为10:1；

e.将步骤d中配好的反应体系堆成堆状，控制反应温度30℃，保持反应体系中水分含量为30％，定期搅拌通气，反应45天后取样检测，土壤石油烃含量为6880mg/kg,降解率为86.2％。

实施例8

a.采集油井附近石油污染土壤，将其晒干碾碎，去除挥发性烃类和水份；

b.将步骤a的土壤中按体积比30％加入粒径为5mm的生物质粉末为棉杆粉末混合均匀，并调节含水率为30％，调节pH为7.5；

c.制备表面活性剂粗品：将无机盐培养基为NH₄Cl 0.776g，KH₂PO₄ 0.05g，K₂HPO₄0.05g，CaCl₂ 0.001g，MgSO₄ 0.01g，超纯水100mL，pH 7.5，放入250mL锥形瓶中，并加入4g正十六烷，温度121℃高温灭菌20min，待冷却后接入铜绿假单胞菌液Pseudomonas aeruginosa，并用透气膜封口，放入温度30℃恒温摇床中，120r/min培养96小时，得到表面活性剂粗品，其溶液表面张力为26.68mN/m；

d.将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp按体积比0.9:1混合，将混合菌液接入步骤b所得土壤体系中，接菌量为1.5×10⁹个/g土壤，同时加入步骤c得到的500mL/kg的表面活性剂粗品，再加入NH₄Cl、KH₂PO₄和K₂HPO₄作为营养液氮源和磷源，其中氮∶磷质量比为10:1；

e.将步骤d中配好的反应体系堆成堆状，控制反应温度30℃，保持反应体系中水分含量为20％，定期搅拌通气，反应45天后取样检测，土壤石油烃含量为6250mg/kg,降解率为88.6％。