本发明属于土壤生物修复
技术领域：
，特别涉及一种修复石油污染土壤的复合菌群、菌剂及培养、固定化方法和应用。
背景技术：
：石油及其加工品使用量逐年升高，导致了原油开采量增加，在此过程中原油泄露事故频繁发生，造成的污染已经引起了广泛关注。全球每年约开采40亿t石油，其中7％左右最终进入环境，仅我国每年就有近60万t。这些石油烃类污染物经过各种途径最终进入土壤，我国目前石油污染的土地面积已达5×106ha。石油烃类污染物进入土壤，改变了土壤养分组成，影响了土壤微生物群落结构，导致作物减产，还可以与土壤颗粒粘连，堵塞孔隙，影响土壤通透性，阻碍作物根系的呼吸作用，引起根系腐烂，造成作物死亡。其中以石油芳香烃毒害最为严重，芳香烃类化合物具有苯环共轭结构，在环境中很难被降解，可以通过食物链在生物体内富集，产生遗传毒性，而且绝大多数芳香烃及其衍生物具有致畸、致癌、致突变的作用。更严重的问题是这些石油污染物不仅仅污染土壤环境。由于土壤系统的开放性，石油污染物可以通过蒸发作用进入大气环境，通过径流和渗透等途径进入水环境，再从大气、土壤和水环境转移到植物、动物和人体，对人类健康造成持久性危害。石油污染土壤修复的方法主要有化学、物理和生物修复三种。传统的物理化学修复成本高，处理不当会引起二次污染，或者仅仅使污染物从一个环境体系转移到另一个体系。生物修复技术成本低、效果好、无二次污染，被认为是最有前景的修复手段，其中，微生物修复技术以其种类多、繁殖快、比表面积大、易变异等优点，应用最为广泛。目前，利用微生物修复石油烃类污染土壤的研究已有一些报道，汪杰等从山东、新疆和陕西油田分离获得3株以柴油为唯一碳源的石油烃降解菌，其降解效果10天内可达60％以上(高效石油降解菌的筛选鉴定及修复能力研究，环境科学学报，2010)。李宝明等从石油污染土壤中富集分离获得236株石油降解菌株，选择其中4株构建了石油降解菌群，该菌群能有效降解石油中饱和烃和芳香烃烃类化合物，在石油浓度为0.5％的无机盐培养液中，5天内对石油的降解率可达55.5％(石油降解菌的筛选、鉴定及菌群构建，中国土壤与肥料，2007)。相关专利文献如下：公开号cn101724582a(中国，巩宗强等，公开日2010-06-09)的一种修复pahs污染土壤的固定化菌剂及其制备方法；公开号cn101724566a(中国，台培东等，公开日2010-06-09)的一种多环芳烃污染土壤修复菌剂的制备和使用方法；公开号cn102021132a(中国，杨玉楠等，公开日2011-04-20)的一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法；公开号cn102250798a(中国，郭萍等，公开日2011-11-23)的一种假单胞菌属和微生物菌剂及它们的应用；公开号cn102250797a(中国，郭萍等，公开日2011-11-23)的一种友好戈登氏菌和微生物菌剂及它们的应用；公开号cn102250796a(中国，郭萍等，公开日2011-11-23)的一种赤红球菌和微生物菌剂及它们的应用；公开号cn102533709a(中国，高大文等，公开日2012-07-04)的原油污染土壤复合微生物修复菌剂及其使用方法；公开号cn103333823a(中国，王竞等，公开日2013-10-02)的一种修复多卤代烃污染土壤菌剂的制备方法及其应用；公开号cn104745511a(中国，宋佳宇等，公开日2015-07-01)的用于修复重油污染海岸线的复合菌剂及其制备方法与应用。在石油烃类污染土壤的微生物修复过程中，大多数具有石油降解能力的微生物只能代谢一种或几种石油烃，而且石油烃类污染物的生物降解是分多步进行的，因此石油的降解需要多种微生物及其代谢产物协同完成。但是上述文献中用于石油烃类污染土壤修复的微生物都是单菌株或几个菌株通过简单随机组合的菌群，其协同作用的机理尚不明确。传统的微生物筛选标准只注重菌株对石油烃类污染物的降解性能，忽略了其在修复体系中的生态效应，导致了筛选得到的微生物菌株虽然能很好的降解污染物，但在污染环境中定值较差，且对土著微生物的竞争作用以及环境因素敏感，造成其重新投入污染环境后难以生存和发挥修复作用。另一方面，石油通常以非水相液体污染土壤，使土壤颗粒表面有较强的疏水性，既减少了污染物与微生物的作用面，又不利于土壤中水溶性营养物质的运移和供给，影响了石油烃降解菌的生长代谢，制约着微生物修复技术的发展。因此筛选对石油烃类污染土壤具有高效、协同降解能力的微生物菌群，以及对该菌群进行固定化培养和应用仍然十分必要。技术实现要素：为了克服上述现有技术微生物在实际应用中定值差、效率低、与土著微生物竞争能力弱等缺点，本发明的目的在于提供一种修复石油污染土壤的复合菌群、菌剂及培养、固定化方法和应用，高效协同实现土壤修复。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种修复石油污染土壤的复合菌群，主要由假单胞菌属(pseudomonassp.)和产碱菌属(alcaligenaceaesp.)组成所述假单胞菌属相对丰度为94.14％，产碱菌属相对丰度为3.86％，其余物种包括无色杆菌属、杆菌属和短芽孢杆菌属，总相对丰度为2.00％。所述修复石油污染土壤的复合菌群的培养方法：采用继代连续培养法，以石油为唯一碳源，从石油污染土壤堆腐化修复体系中筛选分离获得。基于所述修复石油污染土壤的复合菌群的复合菌剂：由无菌麸皮与上述复合菌群的发酵液(即培养液)混匀，经吸附培养后制备获得。所述无菌麸皮与复合菌群的发酵液的质量体积比为1:1，30℃吸附培养24h。所述复合菌剂的固定化方法：将冷冻保存的所述复合菌群接种于50ml牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃180r/min过夜培养获得一级种子液，以5％的接种量将一级种子液接种于新鲜的牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃180r/min过夜培养获得二级种子液，以麸皮干重计，按体积质量比1:1的比例将二级种子液与灭菌麸皮混合均匀，30℃吸附培养24h，获得石油污染土壤修复的固定化复合菌剂。所述牛肉膏蛋白胨培养基的成分为：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，其ph值在7.2～7.4之间。本发明复合菌群可用于修复石油污染土壤，基于堆腐化修复技术，石油浓度10g/l，30℃180r/min培养15d，复合菌群对石油烃类污染物的降解率达到18％～20％。堆腐化修复技术是利用自然界广泛分布的微生物或接种外源高效降解菌，通过添加调理剂，有控制地促进有机物快速分解的固相反应过程，它结合传统堆肥和生物修复的优点，可以有效克服污染物生物降解率低等缺陷。在石油污染土壤的堆腐化修复过程中可以通过微生物强化(microbialaugmentation)技术提高微生物代谢活动以达到高效降解污染物目的，常用的强化技术包括添加高效降解菌株、营养物质、电子受体、(生物)表面活性剂和共代谢底物。与现有技术相比，本发明的有益效果是：经过实验证实，本发明石油污染土壤修复的固定化复合菌剂修复初始浓度为5000、10000和50000mg/kg的石油污染土壤，污染物降解率可达91.45％、91.83％和73.97％，半衰期分别为6.79、7.37和13.86d，土壤浸提液种子发芽指数分别提高18.26％、20.42％和36.41％。上述结果提示该复合菌剂是一种高效环保的土壤修复菌剂，具有广阔的应用前景。附图说明图1是本发明复合菌群在属水平上的物种相对丰度示意图。具体实施方式下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。土壤环境中的微生物极其丰富，受到石油污染后，微生物群落结构发生相应的变化，能适应污染环境的种群在石油的诱导下产生特异的酶系统，以石油烃为底物繁衍生存下来，形成具有协同作用的优势同生菌群；不能适应污染环境的种群则受到抑制，甚至被完全淘汰。本发明利用这一自然驯化过程，采用继代连续培养法，以石油为唯一碳源，从石油污染土壤堆腐化修复体系中分离获得具有良好协同作用的石油污染土壤修复的复合菌群。本发明的具体过程如下：1、石油污染土壤修复复合菌群的筛选5g石油污染土壤样品加入到50ml石油浓度为20g/l的无菌lb培养基中，30℃180r/min恒温震荡，富集培养7d。取富集培养液1ml接种于50ml相同石油-无机盐培养基中，30℃180r/min恒温震荡，进行驯化培养，5-7天为一个周期，连续培养10代，获得群落结构和降解功能稳定的复合菌群。2、石油降解复合菌群的组成分析2.1、石油降解菌群dna提取驯化培养后的混合培养液8000r离心5min，弃去上清液，收集菌体，用无菌蒸馏水洗涤两次，用fastdnaspinkitforsoil试剂盒(mpbiomedicals)提取菌群基因组总dna，详细操作步骤参考试剂盒说明书。将提取得到的石油降解菌群总dna溶解于30μl无菌te缓冲液(10mmol/ltris-hcl，1mmol/ledta，ph8.0)。通过酶标仪(biotekelx808)测定菌群总dna的浓度和纯度(od260/od280和od260/od230)。2.2、16srdna片段扩增扩增引物分别为27f和1492r27f：(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)1492r：(5′-ggttaccttgttacgactt-3′)pcr反应在thermocycler(biometra，tprofessional)中进行，反应程序如下：pcr反应体系为50μl，体系组成如下：其中dna模板的稀释度根据其浓度计算。2.3、pcr扩增产物检测pcr扩增产物在1％琼脂糖(0.005％goldview染色剂)凝胶电泳上进行检测，90v电泳20min后置于凝胶成像系统(bio-rad，geldoctmxr)上检测是否有非特异性扩增条带。pcr扩增产物保存于-20℃。2.4、高通量测序(illuminamiseq)数据分析菌群基因组高通量测序(16srdna)委托北京百迈客生物科技有限公司利用illuminamiseq平台完成。高通量测序得到的图像数据经碱基(bases)识别分析转化得到原始序列(sequencedreads)，除去含接头和低质量的序列得到高质量的reads。利用mothur(version1.34.4)软件，将reads拼接成一条序列(rawtags)，通过去除模糊碱基(anbiguous)数大于0，单碱基高重复区(homologous)大于8、overlap区错配(mismatch)数大于0以及长度大于97.5％的低质量tags等步骤，优化得到高质量的cleantags。根据平均邻近聚类法(averageneighborclusteringalgorithm)在0.03(97％相似度)水平下对cleantags进行聚类分析，获得菌群out个数。基于分类学数据库对out进行物种注释，若一个out中包含的51％以上的cleantags都注释为同一物种，则out即为该物种，否则在上一个物种分类等级再进行out分析。统计每个out内所含的cleantags数，结合物种组成信息获得在各分类学水平上每个物种的相对丰度。实验结果如表1所示，本发明复合菌群在界、门、纲、目、科和属分类水平上共产生的物种数目分别为1、2、3、4、5和6。结合物种注释信息，获得本发明复合菌群在属水平上各物种的相对丰度(图1)，假单胞菌属(pseudomonas)占明显优势，相对丰度达94.14％；其次是产碱菌科无法鉴定的属类别(alcaligenaceae.unclassified)，相对丰度达3.86％；其他属类别还包括假单胞菌科无法鉴定的属类别(pseudomonadaceae.unclassified)、无色杆菌属(achromobacter)、杆菌属(geobacillus)和短芽孢杆菌属(brevibacillus)，这些物种的总相对丰度为2.00％。表1复合菌群在不同水平上的物种组成界门纲目科属1234593、固定化复合菌群的降解能力分析3.1、固定化复合菌群修复石油污染土壤能力分析称取相当于5.0g风干质量的新鲜土壤，加入10ml石油醚，25℃300w超声10min，涡旋振荡5min，6000r/min离心5min，反复提取5次，合并上清液，无水硫酸钠除水，用石油醚定容后在225nm处读数，3次重复，获得固定化复合菌群修复后土壤中石油烃的含量，计算石油烃类污染物的降解率，结果如表2所示。表2固定化复合菌群修复过程石油烃类污染物的降解率结果表明，利用本发明固定化复合菌群修复初始浓度为5000、10000和50000mg/kg的石油污染土壤，污染物降解率可达91.45％、91.83％和73.97％，半衰期分别为6.79、7.37和13.86d。3.2、固定化复合菌群修复后土壤的种子发芽指数分析按质量体积比1:10的比例将固定化复合菌群修复后的土壤(湿质量)与蒸馏水混合均匀，滤液3000r/min离心10min，取5ml上清液于铺有滤纸的9cm培养皿中，放置30粒上海青种子，以蒸馏水为对照，3次重复，30℃培养48h后测量根长，计算sgi(表3)。sgi(％)＝[(堆肥浸提液种子发芽率×种子根长)/(蒸馏水种子发芽率×种子根长)]。表3固定化复合菌群修复后土壤的种子发芽指数注：平均值±标准差(n＝3)，同列数据不同字母表示差异显著(p<0.05)结果表明，利用本发明固定化修复菌群修复石油污染土壤后的种子发芽指数分别比修复初期提高了18.26％、20.42％和36.41％。综上所述，本发明复合菌群及其固定化可用于石油污染土壤的修复，有效改善土壤生态环境，且具有快速、高效、环境友好等优点。当前第1页12