专利名称：纳米沸石分子筛组装材料作为亲和色谱填料分离功能蛋白质分子的方法
技术领域：
本发明是利用具有大孔-微孔多级有序结构的纳米沸石材料，通过阳离子交换，化学沉积和表面化学嫁接等方法对其表面进行改性后，选择性的作为一种新型亲和色谱的填充载体进行复杂生物体系中功能蛋白质分子的分离(如经离子交换固定金属离子Co2+后，亲和分离小鼠血浆中富含组氨酸结构的硒蛋白-P等)。
1994年由澳大利亚科学家Wilkins等提出的蛋白质组学的新概念，是后基因组时代(Post-Genome Era)生命科学研究的新生长点。它是通过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的整体蛋白质的定量研究，以揭示生命的过程和解释基因表达控制的机理。我国从去年也开始了题为“人类重大疾病的蛋白质组学研究”的973项目，其研究重点之一是筛选功能蛋白相对应的带有特殊位点的标志性肽段，建立高通量、规模化、高灵敏度、高准确性的蛋白质组组分谱、蛋白质功能连锁谱和蛋白质功能筛选的技术体系，并实用于重大疾病相关蛋白质群的研究。该领域中的核心课题之一是建立生物复杂样品蛋白质组高效分离、规模化鉴定技术和新方法。
沸石分子筛具有大比表面积，高水热稳定性，丰富均一的纳米孔，良好的离子交换性能和丰富可调的表面性质，以及机械稳定性好等优点，最近有报道应用沸石材料进行氨基酸分子的分离。但对大分子体系，由于传统的沸石材料其孔道狭窄，扩散阻力较大，使用范围受到限制。纳米分子筛不仅具有大晶粒沸石分子筛的大部分特性，而且由于具有独特的可修饰的活性外表面、短的扩散通道、外表面的离子交换性、独特的纳米孔口吸附和反应性能，在涉及大分子的化学、材料和生物分离技术方面弥补后者的不足。沸石尺寸进入纳米级后其外比表面积将显著增大，通过纳米组装可以获得具有各种宏观形貌(如管、球、膜和块体)的含有多级有序大孔或介孔尺度的组装孔的多孔材料。这种材料以其丰富而性质可控的外表面及其组装孔为基础，将生物大分子高亲和力与高专一性可逆结合，有可能作为一类刚性好，宏观形貌可控，易衍生化，适合较高的流速下功能蛋白的有效分离材料，实现目标蛋白表面上的生物功能位点特异并可逆地同分离材料中固定的亲和配体相结合，使生物复杂体系中目标分子有效富集纯化，以满足蛋白质组学研究必需的亲和色谱及微柱高效液相色谱(μHPLC)等技术的要求，并实现微柱亲和色谱-μHPLC-ESI-MS以及微柱亲和色谱-CE-ESI-MS等多种分离分析技术的联用。目前尚未见该类研究方法的报道。
相对于传统亲和材料而言，本发明所选择的材料具有孔道均匀，成本低廉、易于再生、性质稳定、化学物理机械稳定性好，并满足于μHPLC/CE等大规模生物大分子的筛选分离的要求。材料经离子交换过程，使过渡金属离子如Co2+等固定于材料的表面，并利用某些功能蛋白分子的结构中富含的组氨酸结构，以组氨酸结构侧链中的咪唑环与沸石材料中固定的过渡金属离子的相互络合作用，以发挥过渡金属离子特异性的吸附结合具有丰富组氨酸结构的蛋白分子的作用，从而使功能蛋白分子得以从复杂的生物体系中得到分离。
本发明工艺的方法如下(填充料的的具体制备方法是中国申请专利02132609.3)1、选择具有大孔-微孔多级有序结构的纳米沸石材料作为亲和分离的载体。
2、一定数量的多级孔道结构的纳米沸石组装多孔材料同一定浓度的过渡金属离子如硝酸钴溶液加热回流，使过渡金属离子通过离子交换过程固定于材料中。
3、将处理得到的分离材料湿法填充入柱体中。
4、利用去离子水反复淋洗柱体。
5、平衡柱体以动物的血浆样品为例，可用0.05moll-1Tris-HCl溶液/1.0moll-1的NaCl溶液/磷酸盐缓冲溶液平衡柱体。
6、洗脱过程，样品吸附在柱上之后，用3-5倍柱体积的起始缓冲溶液淋洗柱以除去非特异性结合的物质，当紫外吸收检测达到原始的基线时，结束淋洗。选择最佳的洗脱条件使目标蛋白分子在最小的梯度缓冲溶液体积内达到较完全的回收。
具体条件如下1、得到的多级孔道结构的纳米沸石材料在经离子交换过程固定过渡金属离子如Co(II)等离子后，以湿法填充入亲和色谱柱中。该色谱柱可自制，也可为商品化的柱子。
2、利用近中性的0.05moll-1Tris-HCl溶液/1.0moll-1的NaCl溶液/磷酸盐缓冲溶液(3-5倍的柱体积)平衡柱子，平衡一般用溶解样品的溶液或相近溶液。
3、将待分离的样品加在柱子的顶端。并经过大约20-40分钟左右的时间，使待分离的样品同柱中的材料充分结合。样品浓度在0.1-10mg/ml范围，高浓度用于蛋白分离，以提高效率。
4、利用淋洗液如甲酸-甲酸铵缓冲溶液在起始的pH值7.0，以2-3倍的柱体积淋洗柱体，除去非特异性结合在柱体中的物质。
5、在梯度范围内，在10-50ml/hr的速度范围内反复淋洗柱体，使目标蛋白分子在pH约为4.0时，特异性地被淋洗出来。可以适当加压以提高流速。
6、对得到的收集流出物，以原子吸收光谱或电泳技术跟踪鉴定目标蛋白分子。
7、可通过焙烧使填充材料得到反复再生。
本发明的淋洗液以下述任何一种均能获得满意的结果。甲酸-甲酸铵缓冲溶液，或者醋酸-醋酸钠缓冲溶液，磷酸-磷酸钠缓冲溶液或咪唑溶液。由于该类淋洗液可选择性地将与过渡金属离子络合的目标蛋白分子洗脱下来，从而达到分离富集的目的。
分离柱的柱体长度和内径可影响分离效率。柱长可以0.5-5m，内径可以0.5-20cm，用于分离可使用较长，口径大的柱子，以提高效率。
上述分离柱可以是多根短柱串联，如每根0.5m柱串联为3m，或是3根1m柱串联而成。
收集洗脱组份，可采用电泳，原子光谱，紫外吸收光谱等方法检测蛋白分子。
本发明方法的填充物可以通过400℃-600℃的焙烧得到再生，反复使用，降低成本。
多级孔道的纳米沸石材料具有孔道均匀、外比表面积大、性质稳定、成本低廉等优点，其良好的机械物理性能可满足微柱HPLC/CE的要求。
将本发明方法与高效液相色谱或气相色谱联用如微柱高效液相色谱μHPLC或μHPLC-ESI-MS等多种分离技术联用，将进一步拓展本发明方法的应用领域。
传统的亲和色谱填充材料多采用琼脂糖、葡聚糖凝胶等作为承载体，不仅价格昂贵，而且不耐高压，在柱压力超过一定范围后极易因挤压变形，堵塞柱体，影响分离效率。本发明的多级孔道的纳米沸石材料作为亲和色谱的填充物后，其良好的机械物理化学稳定性可有效弥补上述传统材料的不足；其相对简单的操作方法对蛋白质分子的分离富集具有良好的推广应用前景。同时其方便反复再生的性质和通过分子嫁接等技术可同时引入其它功能亲和基团的特点，将大大扩展该种类型的材料在亲和分离中的应用范围。
图2为高分辨率下天然硅藻土材料的电镜扫描图。可以看出其上均匀分布有孔径300-500nm的孔道。
图3则表示通过静电吸附，一层纳米β沸石被均匀地修饰于该种硅藻土的表面的电镜扫描图。
图4为表示金属离子Co2+通过离子交换过程进入到纳米沸石材料的结构骨架中的特定位置的原理示意图。
图5为表示通过静电作用固定在分离载体上的过渡金属离子Co2+与表面含有连续的组氨酸残基的目标蛋白分子相互螯合的过程示意图。这种选择性的特异结合作用主要依赖于目标蛋白分子中连续的组氨酸结构中的咪唑环同固定在分离材料中的过渡金属离子的相互螯合。
图6表示以自制的亲和分离柱，选择Beta纳米沸石作为填充物亲和分离富集实验培养的小鼠血浆中目标蛋白-硒蛋白-P的装置图。
图7为实例1的具有不同组氨酸组成结构的多肽混合物分离结果图。显示两种具有不同的连续组氨酸结构的人工合成的多肽分子在以多级结构的沸石分子筛为填充物的亲和色谱柱中的流出过程。过程中选择甲酸-甲酸铵缓冲溶液为淋洗液。(pH分布范围见图上)从图中可以看出具有4个连续组氨酸结构的多肽B较多肽A(结构中含有2个组氨酸)同柱材料中的Co2+结合更为牢固，因此多肽B的流出时间晚于多肽A。
图8为实例2的分离结果图。显示经过特殊培养的小鼠血浆样品，经自制的以多级沸石分子筛材料为填充物进行亲和色谱分离。并以碱性熔融-碱性氢化物发生-ICPAES联用技术分析流出组分中的硒元素的浓度，间接确定目标蛋白分子的分离过程。从图中可以看出组分10和11对应于淋洗液pH约为4.0附近的为硒蛋白-P。并通过SDS-PAGE的分离在分子量55-60kDa附近的明显加深的条带可得到进一步的证明。
图7、图8表明具有丰富组氨酸结构的硒蛋白-P和人工合成的具有连续组氨酸结构的多肽分子可通过上述的亲和模式得到很好的分离图。
下面的实例是对本发明所提供的多级孔道的纳米沸石材料进行亲和色谱分离过程所做的进一步说明。实例1组氨酸或多肽的分离将0.1g自制的修饰纳米Beta沸石的填料用适量去离子水调成浆状物，转移到分离柱中，柱子床层高度约为1cm。然后加入1.0ml平衡缓冲溶液将柱子进行平衡。将0.50ml浓度为124μgL-1的组氨酸或1.0mL浓度为1.5mgL-1的多肽溶液样品(样品为人工合成的含有不同组氨酸结构的多肽分子)移入到提取柱中，待液体流净后加入1.0ml平衡缓冲溶液洗涤，吸附到柱子上的组氨酸或多肽通过依次加入pH为7.0，6.0，5.0，4.0的甲酸-甲酸铵洗提缓冲溶液梯度洗脱，淋洗速度是10ml/hr，然后通过紫外光谱检测每一收集管中的吸收光度值，并绘制流出物分布图。实例2-5调整柱子的床层高度分别为1.5，2.0，2.5，3.0cm，其它条件同上，重复上述的分离实验。实例6-8分别选择甲酸-甲酸铵缓冲溶液体系或磷酸钠-磷酸缓冲溶液或咪唑梯度溶液作为洗脱系统进行多肽分子混合物的分离，重复实例1步骤(人工合成的多肽分子A和B中分别含有不同的组氨酸结构，并按1∶1摩尔比混合)。实例9小鼠血浆中硒蛋白-P的分离将0.5g自制修饰纳米Beta沸石的填料用适量去离子水调成浆状物，转移到分离柱中，柱子床层高度约为1cm。然后加入4.0ml平衡缓冲溶液将柱子进行平衡。将冷冻的血浆在室温解冻后在4000转/秒，离心5min，并通过0.45μm的滤膜过滤。将2.0ml血浆样品移入到提取柱中，待液体流净后加入4.0ml平衡缓冲溶液洗涤，吸附到柱子填料上的硒蛋白P通过加入洗提缓冲溶液梯度洗出，淋洗速度是30ml/hr，(具体洗提方式与组氨酸和多肽的分离相同)。在每一接受的组分中滴加约200μl浓度为2.0M HCl，然后通过碱性熔融-碱性模式HG-ICP-AES检测每一管中的总硒含量，并结合电泳分离技术，以确定所建立的亲和分离系统对硒蛋白-P的特异性分离效能。实例10-11分别选择经过特殊培养的小鼠血浆和绍兴麻鸭的血浆样品为实验对象，重复实例9步骤，分离富集其中的硒蛋白-P。实例12-15分别选择甲酸-甲酸铵缓冲溶液体系；磷酸钠-磷酸缓冲溶液、咪唑梯度溶液作为洗脱系统，重复实例9步骤，进行小鼠血浆和绍兴麻鸭的血浆样品中硒蛋白-P的分离富集。实例16-18在材料载体中通过离子交换过程分别固定过渡金属离子Zn2+，Cu2+，Ni2+，重复实例9步骤，进行小鼠血浆中硒蛋白-P的亲和分离过程。实例19-24分别选择表面修饰有不同类型的纳米LTA、FAU、MFI沸石分子筛，重复实例1和实例9，以确定其金属离子的交换容量，并考察其不同的亲和色谱行为。实例25纳米组装的多级孔道沸石的材料表面改性修饰镓离子后，以分离富集具有丰富磷酸根基团的酪蛋白。选择的洗脱溶液为在一系列梯度范围内的咪唑溶液。实例26利用等离子体光谱-质谱法分析选定的分离材料的交换容量。即在硝酸钴溶液同材料回流处理后，将得到改性的材料装柱，并用4M HCl溶液淋洗柱体，收集得到的流出物，以等离子体光谱-质谱法分析确定钴离子的绝对浓度，并计算材料的交换容量。结果显示Beta纳米沸石的交换容量约为0.1％。实例27-28比较不同材质的亲和分离柱对分离效果的影响，如石英玻璃，塑料，聚四氟乙烯等。
权利要求
1.纳米沸石分子筛组装材料作为亲和色谱填料分离功能蛋白质分子的方法，其特征是以表面修饰有纳米沸石分子筛的多级有序的分离材料，经离子交换固定过渡金属离子后，作为亲和色谱柱填充物，并通过一定梯度范围的缓冲溶液淋洗柱体，达到分离富集蛋白质分子的目的，具体条件是(1)纳米沸石均匀修饰于多孔基体材料的表面，并通过离子交换过程，将过渡金属离子固定于材料中；作为亲和分离的填充载体装柱；(2)平衡填充柱柱体，并将待测样置于柱床的顶端；(3)常温下以一定梯度范围的弱酸缓冲溶液或咪唑溶液使目标蛋白分子被选择性地洗脱下来；(4)鉴定目标蛋白分子的存在。
2.按权利要求1所述的纳米沸石分子筛组装材料作为亲和色谱填料分离功能蛋白质的方法，其特征是淋洗液为下述中的任一种甲酸-甲酸铵缓冲溶液；醋酸-醋酸钠缓冲溶液；磷酸-磷酸钠缓冲溶液；或者是咪唑溶液。
3.按权利要求1所述的纳米沸石分子筛组装材料作为亲和色谱填料分离功能蛋白质的方法，其特征是分离柱是串联。
4.按权利要求1所述的纳米沸石分子筛组装的多孔材料为亲和色谱的填充物分离蛋白质的方法，其特征是收集的组分可用下述任何一种方法进行检测电泳；紫外吸收光谱；原子光谱。
5.按权利要求1所述的纳米沸石分子筛组装材料作为亲和色谱填料分离功能蛋白质的方法，其特征填充物可经焙烧或离子交换后再生。
6.按权利要求1所述的纳米沸石分子筛组装材料作为亲和色谱填料分离功能蛋白质的方法，其特征是本发明方法可适用于高效液相色谱和气相色谱的模式。
全文摘要
本发明是一种以纳米沸石分子筛组装体为新型的亲和色谱填充物，进行特定结构的功能蛋白分子分离的方法。目前尚无满意的分离功能蛋白分子的色谱分离方法。本发明以大孔－微孔多级有序的沸石结构通过离子交换过程固定过渡金属离子后，其作为亲和活性位点可同结构中具有连续组氨酸结构的功能生物大分子发生特异结合，然后通过缓冲溶液梯度洗脱，从而达到富集分离目的。该种载体具有孔道均匀，机械化学稳定性好，表面易改性，可以有效减小分离过程中的传质阻力，容易再生等优点。其中选择以硅藻土为模板，表面修饰纳米Beta沸石的分子筛材料为亲和色谱填充物，装柱后，利用不同的淋洗体系，分离功能蛋白分子得到满意的效果。
文档编号B01D15/08GK1431497SQ0311523
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月28日 优先权日2003年1月28日
发明者徐芳, 王亚军, 王德举, 唐颐, 杨芃原 申请人:复旦大学