具有沟槽的孔生物传感器的制作方法

专利名称：具有沟槽的孔生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器领域并且具体地涉及亚波长传感器、即亚 衍射极限传感器。
背景技术：
生物传感器技术在本领域中众所周知。
美国专利申请第2003/0174992号公开一种用于提供包括如下分 析物的零模波导的方法和装置，该分析物受到电磁辐射的激活以便分 析该分析物。
于2005年6月23曰提交、标题为"Luminescence sensors using sub-wavelength apertures or slits"的欧洲专利申请第05105599.4 号公开一种在流体内操作的具有亚波长空间分辨率的生物传感器。
在这样的传感器中，分析物可以布置于具有至少部分亚波长尺度 的孔中.可以在流体中包括该分析物.存在于流体中的发光体在暴露 于激励能量时发出辐射，发出的辐射由检测器收集.
这些类型的生物传感器的一个弊端在于源于个别发光体的发光能 量可能依赖于发光体在孔内的位置。因而这些类型的生物传感器可能 具有与待分析的分析物的量化关系欠佳的响应、导致被检测性质的准 确性欠佳。

发明内容
因而，本发明的一个目的在于单独地或者组合地减轻、緩解或者 消除一个或者多个上述不足和弊端。
根据本发明的一个方面，提供一种将在传感器、优选为发光传感 器中包括的衬底，该衬底包括非透明衬底结构，具有用以包括分析 物的至少一个孔；透明衬底结构，布置到或者邻近于所述第一结构并 且具有表面部分，该表面部分具有与所述分析物的结合能力；所述表 面部分布置于与所述孔的一端有预定距离处.
在一个实施例中，表面部分可以布置于所述孔的一端以外的预定
4距离处.表面部分可以包括至少一个配位体，所述配位体对于包括在 分析物中的靶分子具有亲合性.所述距离可以约等于配位体长度的平 均值.
在另一实施例中，所述距离等于配位体长度、靶分子尺寸和恒定
长度之和.恒定长度可以是lnm到50nm，比如lmn到lOnm,
在又一实施例中，所述距离可以是lnm到60nm,比如3nm到25mn。 可替换地，所述距离可以是lnm到15nm。所述距离可以是60mn到 lOOOmn。
在又一实施例中，所述表面被布置于所述透明结构中形成的沟槽 中.沟槽可以具有与孔对应的尺度并且可以与孔相对布置.
在又一实施例中，所述孔可以具有小于所述分析物中包括的发光
50%更小的至少一个横向尺度.所述孔可以具有比衍射极限或者有效 波长的50%更小的笫一横向尺度和在衍射极限以上或者比有效波长的 50%更大的第二横向尺度。可替换地，所述孔可以基本上为圃形、椭 圆形.
根据本发明，还提出一种用于发光传感器的传感器衬底和一种包 括这一传感器衬底的发光传感器.


本发明的更多目的、特征和优点根据参照以下附图对本发明实施 例的下文具体描述将变得清楚
图l是生物传感器的第一和第二实施例的示意图； 图2是生物传感器的另一实施例的示意图；并且 图3是生物传感器的又一实施例的示意图.
具体实施例方式
下文将参照附图描述本发明的数个实施例。出于说明的目的来描 述这些实施例以便使本领域技术人员能够实现本发明并且公开最佳实 施方式.然而，这样的实施例没有限制本发明.另外，不同特征的其 它组合在本发明的范围内是可能的.
下文描述的根据实施例的生物传感器村底可以包括在如下第一类
5型的孔中布置的分析物，该笫一类型的孔具有小于填充该孔的介质中 的所用激励光的衍射极限的两个横向面内尺度.在其它实施例中，所 述孔为如下笫二类型，该第二类型具有小于填充该孔的介质中的衍射 极限的第一横向面内尺度和大于填充该孔的介质中的衍射极限的第二
横向面内尺度。面内尺度意味着在与村底平行的平面中的尺度.
由于在孔的至少一个面内尺度中的亚衍射极限尺度，所以激励辐 射穿透到孔中，但是孔的透射率小，因而孔后面的激励能量基本上受 抑制.就第一类型的孔而言对于光的所有偏振都是这种情况，而就第
二类型的孔而言仅对于R偏振光才是这样情况.R偏振光被定义为其电 场在与孔的如下透射平面垂直的方向上的光，该透射平面是与衬底垂 直而与沿着孔的笫一尺度的矢量平行的平面。被检测的发光能量因此 基本上仅源于孔内的发光体并且孔内的少量发光体可以区别于孔外和 孔后面的常常大量的发光体，
可以在流体中包括分析物.存在于流体中的发光体在暴露于激励 能量时发出电磁辐射。发出的辐射由检测器收集。
总辐射能量，即由发光体发出的各个发光体的辐射能量之和，与 分析物的性质具有预定关系，比如与分析物的靶分子的浓度成比例。 通过分析发出的辐射，可以定量地和/或定性地确定分析物的性质。
可以在生物传感器衬底的任一侧检测由发光体发出的辐射.如果 分析物流体存在于一侧上，则可以在另一侧上检测辐射，在这一情况 下，由于孔大量抑制激励光，所以由在孔以外的流体中存在的发光体 发出的辐射明显地小于由在孔入口部分(在这里激励光没有被衰减) 附近存在的发光体发出的辐射。因此，检测的辐射实质上仅为由在孔 的入口部分附近存在的发光体发出的辐射。因此，可以获得高的信号 与背景之比和信号与噪声之比，因为可以减少背景辐射.
配位体或者俘获分子可以布置或者固定于孔的特定部分。所述配
位体或者俘获分子可以具有与耙分子的亲合性，从而靶分子可以与所 述配位体或者俘获分子特别地结合，因而靶分子可以在孔的所述特定
部分特别地结合。靶分子可以是发光分子或者可以由发光分子标记。 配位体或者俘获分子与靶分子由此形成的聚集体形成了发光体.在本
发明的背景中，发光体是指能够发出发光辐射的粒子、珠子、分子或 者分子或粒子或珠子的组合，发光体这样的形成可以在不同方式中实现，比如在通过引用将4支术内容结合于此、S. Weiss在Science第283 巻第 1676-1683 页的 "Fluorescence spectroscopy of single biomolecules" —文中描述的方式。在本发明的背景中，发光体也指 代被发光标记的分子，配位体可以固定发光体，从而它们在激励时从 固定的位置发出辐射，作为第一例子，考虑配位体如寡核苷酸，这些 寡核苷酸与在孔的特定部分固定的具有互补序列的核酸(靶分子)特 别地结合。对于脱氧寡核苷酸(DNA)，聚合酶链反应常常用来放大DNA
浓度和所得靶分子(扩增子)的荧光标记。扩增子的序列片段与在孔 的特定部分固定的寡核苷酸互补并且可以与这些寡核苷酸结合(杂 化).作为笫二例子，考虑如下夹心分析，该分析是在孔的特定部分 固定的特别用于靶蛋白质的抗体.首先，被靶向的蛋白质分子与抗体 结合，其中在包含流体的分析物中存在的抗体在被荧光标记之后与被 靶向的蛋白质分子结合。两个粒子均获得在孔的特定部分固定的有荧 光标记的聚集体，
根据沿着孔的位置，激励光和发出的辐射将在不同程度上被孔衰 减，这可以造成来自出口侧的孔内存在的发光体的辐射与入口侧附近 的发光体相比将给出来自检测器的更小响应。因此，如果发光体存在 于整个孔，则检测器响应将不会与存在于孔中的发光体的数目成比例， 而在与入口部分更近处存在的发光体将比孔内存在的发光体对检测器 信号起更大作用.其中限定孔的村底结构可以部分地或者完全地由诸 如铝、金、银、铬等金属组成。接近金属的发光体如荧光体(通常少 于10nm)可以经由近场交互将它们的荧光耦合到金属从而获得荧光的 淬火。因而，用于在孔的金属附近的发光体的发光功率不同于与金属 更远的发光功率.
可以用不同方式、比如通过电能或者化学能来激励发光体以发出 辐射.发出的辐射可以通过不同物理过程来实现，比如发光、磷光、 荧光、拉曼散射光、超拉曼散射光或者超瑞利散射光等.发出的辐射 可以是电磁辐射，比如光、包括红外光.
下文将考虑电磁辐射，特别是如下光(包括红外光)的激励，该 光在相关介质中具有比孔的至少一个横向尺度更大的波长。有效波长 是辐射在真空中的波长除以介质的折射率。
如果孔的至少一个横向尺度小于在填充孔的介质中的有效波长的一半，则将在孔中建立瞬息电磁场.对于一个横向尺度比有效波长的
一半更大的孔，瞬息电磁场也涉及到R偏振光.
这样的瞬息场可以激励孔中存在的发光体.瞬息场将从孔的入口 侧或者侧面在孔中具有指数式衰退。因此，在进口附近处存在的发光 体将比在孔的另一侧存在于孔内和孔外的发光体被更高效地激励。
在一个实施例中，由发光体发出的辐射的出口侧与激励辐射的进 口側相同。在这一情况下，如果发光体在与孔的进口/出口侧有一定距 离处存在或者固定于孔内，则沿着孔长度(该长度在与平行于衬底的 平面垂直的方向上)的降低激励效率将增加孔对发光体发出的辐射的 衰减。
另外，激励辐射虽然被孔衰减(这一衰减的典型值为因子1000 )
但是将穿过孔并且在孔的另一侧射出.这样的穿行辐射将激励在介质 中存在的发光体并且形成背景辐射.这样的辐射将以背景辐射的形式 穿过孔并且增添到检测器中的信号.如果降低有用信号，则如上文说 明的那样，将降低信号与背景之比并且也降低信号与噪声之比。 如果发光体如上文说明的那样由配位体固定，则配位体可以在孔
的出口部分附着到表面。然而，配位体具有可以例如为lmn到60nm的 某一长度.由于孔的长度可以在50n迈到1000nm的范围中，所以这样 的配位体长度将造成发光体定位于孔内大段距离或者在一些情况下甚 至于孔外。由于激励能量呈指数衰弱，所以配位体在孔内的定位将造 成发光体暴露于更少激励能量，因此朝着检测器发出更少辐射，另外， 发出的光沿着孔穿行并且变得在某一程度上衰减，从而也对减少有用 信号起作用。由于背景辐射不变，所以有用信号的减少造成降低的信 号与背景之比和信号与噪声之比.
如果配位体定位于表面附近，则固定于该表面的配位体可能具有 与把分子较少的亲合性。因此，配位体可以包括间隔物从而进一步增 加配位体总长度，
图1公开了根据现有技术的生物传感器衬底.生物传感器衬底包 括衬底结构1.衬底结构对于相关辐射、比如波长(在真空中)约为 700mn的光而言基本上不透明或者非透明。衬底结构可以部分地或者完 全地由诸如金、铝、银、铬等金属组成。部分地或者完全地组成衬底 的材料应当具有如下折射率，该折射率具有相当大的虚部。折射率的所述虚部优选为大于l、更优选为大于3并且最优选为大于6.
村底结构1包括至少一个孔2,该孔具有比用于填充该孔的介质的 有效波长的50%更小的第一面内橫向尺度.数个孔可以布置于衬底1 的表面，例如具有规则隔开的间隔。孔可以如在美国专利申请第 2003/0174992号中公开的那样分組.
孔可以具有诸如圆形、椭圃形、三角形、矩形、六边形等任何形 状。孔可以布置为如下的缝，该缝具有比用于填充该孔的介质的有效 波长的50%更小的第一面内橫向尺度和比用于填充该孔的介质的有效 波长的50%更大的第二面内横向尺度。孔可以如在2005年9月2日提 交的欧洲专利申请笫05198773. 2号中公开的那样布置为两种缝设置的 组合.
第一面内横向尺度可以小于在用于填充该孔的介质中的有效波长 的40%、更优选为15 %与25%之间并且最优选为10%与15%之间.
对于第二类型的孔，笫二面内横向尺度可以在用于填充该孔的介质中 的有效波长的l倍与IO倍之间、更优选为10倍与200倍之间并且最 优选为多于200倍，激励光的辐射可以约为633nm，在以水(折射率为 1. 33)作为用于填充孔的介质时对应的有效波长为476nm。笫一面内横 向尺度可以小于190nm、更优选为71nm与119nm之间并且最优选为 48nm与71nm之间，对于第二类型的孔，第二面内橫向尺度可以在0. 48m 与5m之间、更优选为5m与100m之间并且最优选为大于100m。可替换 地，激励光的波长可以约为350nm，在以水(折射率为1.35)作为用 于填充孔的介质时对应的有效波长为260nm。第一面内横向尺度可以小 于103nm、更优选为39nm与65mn之间并且最优选为25nm与391nm之 间。对于笫二类型的孔，第二面内横向尺度可以在O. 26m与2.5m之间、 更优选为2. 5m与50m之间并且最优选为大于50m.
透明结构3布置于该衬底结构1之下以支撑所述村底结构.透明 结构3由对于激励而言基本上透明而对于发出的辐射而言也可以是透 明的材料制成.该材料可以是玻璃、丙烯酸玻璃、环氣树脂、聚氯乙 烯(PVC)等。为了充分地透明，该材料应当具有虚部小于l(T的折射率.
透明结构3的表面如图1中所示形成孔2的底部。该表面具有与 孔2重合的凹陷或者沟槽4。通过蚀刻与孔相对的透明材料来制作所述
9沟槽，形成沟槽的其它方法可以按照规则间隔将间距部件添加到透明 材料。
沟槽4中的表面是修改成包括俘获分子(如配位体5)的表面.配 位体5具有与在孔2中和在衬底1上存在的流体6中的靶分子7的亲 合性.把分子7由发光体8标记.
发光体是在暴露于来自激励源的能量时生成发光辐射的分子或者 粒子。荧光体是在暴露于来自包括红外光的光源的能量时通过荧光来 生成电磁辐射(如光或者红外光)的分子或者粒子。在本说明书中无 论何时提及荧光或者荧光体都可以代之以用来意味着发光或者发光 体.
图3的实施例的操作如下。附着有荧光体8的靶分子7进入孔2 并且由固定于沟槽4的表面上的配位体5捕获。在图1中的沟槽中示 出了配位体5、靶分子7和荧光体8的三个这样的聚集体9.流体基本 上是折射率为1. 3的水。
对于第一类型的孔，生物传感器衬底暴露于来自透明结构3这一 侧的光IO。光10在真空中具有700nm的波长，在水中对应的有效波长 为538nm,孔的两个横向面内尺度小于约269nm、即小于有效波长的50 %,比如70nm。因此，瞬息电磁场存在于使场强度呈指数衰弱的孔内。
对于第二类型的孔，生物传感器衬底暴露于来自透明结构3这一 侧的R偏振光10' R偏振光10在真空中具有700mn的波长，在水中对 应的有效波长为538nm.孔的第一横向面内尺度小于约269nm、即小于 有效波长的50%，比如70nm。孔的第二横向面内尺度大于约269nm、 即大于有效波长的50%,比如lmm,因此，瞬息电磁场存在于使场强 度呈指数衰弱的孔内，
也可以使用其它波长辐射，比如微波、红外光、近红外(NIR)光、 可见光、紫外光、X光等.
在沟槽4的表面存在的聚集体9a中存在的荧光体被激励并且如箭 头lla和llb所示发出辐射.根据箭头lla的辐射的约50。/。被引向存 在于夹层部件3以下的检测器12。如箭头lib所示的发出的辐射的另 50%被引向孔并且在孔中衰减，因为荧光体由非衰减激励光激励—— 由于孔对激励光10的反射，激励光在沟槽中的能量实际上按照约为2 的因子来增加，并且因为发出的辐射中的大部分到达检测器，所以获得高效率。
附着到存在于孔内的靶分子7的荧光体(如聚集体9b所示)暴露 于在孔内已经衰减很多的激励辐射.因此，这样的荧光体比存在于聚 集体9a中的荧光体发出更少辐射，因为发出的荧光的功率与对于荧光 体9b而言减少的激励辐射的强度成比例。如箭头13a所示引向检测器 12的发出的辐射因孔的作用而衰减，该作用也与在如箭头13b所示另 一方向上引导的辐射有关.
激励辐射的小部分到达孔外进入存在于孔上的流体中.在实际生 物传感器中，这样的辐射的衰减约为iooo并且对于孔的给定横向尺度
而言依赖于孔的长度.对于孔长度160nm和第一横向面内尺度70mn, 已经穿过孔的激励辐射的衰减约为1000。这样的辐射将激励存在于流 体中的荧光体，比如标记到自由靶分子的荧光体以及未附着到靶分子 的自由荧光体。这样的荧光体将发出辐射，并且其小部分如箭头14a 所示将进入孔并且在再次由孔衰减的情况下传递到检测器12。这样的 辐射13a和14a形成背景辐射.此外，反射回到检测器的激励辐射将 增添背景辐射.透射荧光辐射并且阻止激励辐射的波长滤波器可以用 来衰减反射的激励辐射.
可以通过洗掉自由把分子和荧光体来减少背景辐射。然而，这样 的清洗可能在实时测量中是不可能的。另外，尽管有这样的清洗，一 些靶分子和荧光体仍然可以留存.
如图1中所示，沟槽具有与配位体5的长度对应的某一深度，从 而发光体存在于孔的出口表面。例如，对于夹心分析，靶分子夹入于 结合界面处的笫一受体分子与被荧光标记的第二受体分子之间。
深度可以等于配位体的长度.对于夹心分析而言它通常为lOnm到 60mn;对于缩氨酸-抗体分析而言它为3nm到25nm;对于DNA杂交分析 而言它可以是lnm到15nm。
由于激励能量在孔外近似地恒定，所以沟槽的深度可以略大于配 位体长度，比如大lnm到50mn。
深度可以是配位体长度、靶分子的尺寸和预定常数之和.
适当深度为lnm到60nm，但是可以在某些应用中使用上至1000nm 的深度.
如果配位体没有如图1中所示凹陷而是布置于透明结构3与非透明结构1之间的界面处，则激励能量将如上文说明的那样在到达荧光
体之前大量衰减。因此，由聚集体9a生成的辐射的检测功率可以在一 个实际实施例中按照因子IO来减少，而检测的背景辐射保持实质上相 同，因此造成背景抑制的减少，
图2公开了另一实施例，其中使沟槽24的至少一个横向面内尺度 明显地大于孔22的对应(也就是与之平行的)横向面内尺度.沟槽可 以由表面上与孔对应的配位体25a提供.此外，沟槽可以具有表面之 上在各孔之间的配位体25b.
在又一实施例中，配位体仅存在于与孔相对的位置.
在图3中所示又一实施例中，沟槽34仅存在于孔的出口区域的一 部分之上.
沟槽之间的区域可以形成如下结构，这些结构用于支撑包括孔的 衬底结构。如果孔由接线结构形成，则沟槽可以在多个接线之上延伸 并且充当用于接线的支撑结构.
沟槽表面具有配位体，这可以在任何常规方式中实现.配位体可 以是蛋白质、缩氨酸、抗体或者其片段、与被靶向的DNA序列互补的 序列特定探测器、碳水化合物、激素、抗氣化剂、糖蛋白、脂蛋白、 活性染料或者其组合.
在上述实施例中，在反射模式中操作生物传感器，其中在与布置 激励辐射相同的一侧检测信号.在这一情况下，应当防止激励輻射到 达检测器，这可以通过滤波器来实现，这些滤波器比如是阻止激励辐 射的偏振滤波器或者波长滤波器.
也可以在透射模式中运用相同原理，其弊端在于生成的荧光辐射 略受抑制，因为它必须经过孔传播.
虽然上文已经参照具体实施例描述了本发明，但是本意并非限于 这里阐述的具体形式。实际上，本发明仅由所附权利要求限定，并且 除了上述之外的实施例在这些所附权利要求的范围内同样是可能的，
在权利要求书中，字眼"包括"并不排除其它单元或者步骤的存 在。另外，多个装置、单元或者方法步骤虽然被个别地列举但是可以 由例如单个单元或者处理器实施.此外，虽然可以在不同权利要求中 包括个别特征，但是可以有可能有利地组合这些特征，但是包含于不 同权利要求中并不意味着特征的组合不是可行和/或有利的。此外，单数引用并不排除多个。字眼"一个/一种"、"第一"、"第二"等并 不排除多个。提供权利要求中的标号仅作为阐明例子并且不应将这些 标号理解为以任何方式限制权利要求的范围.
权利要求
1.一种传感器衬底，包括-非透明衬底结构(2)，具有用于包括分析物的至少一个孔(5)；-透明衬底结构(3)，布置到或者邻近于所述第一结构(2)并且具有表面部分，所述表面部分与所述分析物的结合能力高于与所述透明衬底上别处的所述分析物的结合能力；-所述表面部分布置于与所述孔的一端有预定距离处。
2. 根据权利要求l所述的传感器衬底，其中所述表面部分布置于 所述孔的所述端以外的预定距离处.
3. 根据权利要求2戶/f述的传感器衬底，其中所述表面部分包括至 少一个配位体，所述配位体具有与所述分析物中包括的把分子的亲合 性。
4. 根据权利要求3所述的传感器衬底，其中所述距离约等于配位体长度的平均值.
5. 根据权利要求3所述的传感器衬底，其中所述距离等于所述配 位体的长度、所述靶分子的尺寸和恒定长度之和。
6. 根据权利要求5所述的传感器衬底，其中所述恒定长度为lnm 至ij 50nm， t匕如lnm多10nm。
7. 根据权利要求2所述的传感器衬底，其中所述距离为lnm到 60nm，比如3nm到25nm。
8. 根据权利要求2所述的传感器衬底，其中所述距离为lnm到
9. 根据权利要求2所述的传感器衬底，其中所述距离为60nm到 1000mn,
10. 根据任一前述权利要求所述的传感器衬底，其中所述表面布 置于在所述透明结构(3)中形成的沟槽中。
11. 根据权利要求10所述的传感器衬底，其中所述沟槽具有与所 述孔对应的尺度并且与所述孔相对布置.
12. 根据任一前述权利要求所述的传感器衬底，其中所述孔具有 至少一个横向尺度，其比对于所述分析物中包括的发光体的发射辐射 或者激励辐射的有效波长的50%更小。
13. 根据权利要求12所述的传感器衬底，其中所述孔是其第二面内尺度比有效波长的50%更大的缝。
14. 根据权利要求12、 13或者14所述的传感器衬底，其中所述 孔的长度在所述小横向尺度的0. 5倍到IO倍之间.
15. —种发光传感器，包括根据任一前述权利要求所迷的传感器 衬底。
全文摘要
一种发光传感器包括非透明衬底结构(2)，具有用以包括分析物的至少一个孔(5)；以及透明衬底结构(3)，布置到或者邻近于所述第一结构(2)。孔具有比激励辐射(比如波长为700nm的光在水中获得约538nm的有效波长)的有效波长的一半更小的最小横向尺度。透明结构具有沟槽(4)，该沟槽具有表面部分，该表面部分具有配位体，这些配位体具有与靶分子的亲合性。沟槽造成附着到靶分子的发光体将定位于激励能量最大的孔入口表面。
文档编号B01L3/00GK101568823SQ200780047867
公开日2009年10月28日 申请日期2007年12月17日 优先权日2006年12月21日
发明者D·J·W·克伦德, H·R·斯塔珀特, M·M·J·W·范赫彭 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司