具有无机层状双氢氧化物的深度过滤器层的制作方法

专利名称：具有无机层状双氢氧化物的深度过滤器层的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有无机层状双氢氧化物(inorganic layer double hydroxide)的 深度过滤器层(cbpth filter layer)，其生产方法，含有其的过滤设备，利用至少一种上游 深度过滤器层将液体介质中的至少一种目标产物与至少一种污染物分离的方法以及将深 度过滤器层用于除去污染物的用途。其中，为了从生产溶液中分离非所需生物组分，使含有 这些生物组分和所需目标产物的液体介质与根据本发明的深度过滤器层接触，由此至少一 种非所需生物组分被吸附结合到深度过滤器并因此从生产溶液除去。因此，所需目标产物， 例如治疗性蛋白质应当能够以活性形式不受阻碍地通过深度过滤器。非所需的生物组分特 别包括生物污染物，如来自生产溶液的核酸、细胞蛋白质、病毒或内毒素。治疗性蛋白质的 实例是抗体、激素、酶或肽。
背景技术：
大量治疗性、重组蛋白质基于细胞培养工艺，该细胞培养工艺以小规模和大规模、 工业规模在生物反应器或发酵罐中进行。细胞培养液含有在大量其它组分如完整细胞 (intact cells)、细胞碎片和较小细胞组分中的所需的目标蛋白，必须以由许多组成步骤 (“下游工艺”)组成的高成本工艺将目标蛋白与这些其它组分分离。深度过滤在细胞、细 胞碎片和胶质组分的分离中起重要作用。基于纤维素纤维的深度过滤器尤其描述于以下专利中US 5，232，595描述了由与硅藻土或珍珠岩组合的纤维材料如纤维素、聚烯烃、玻 璃或者陶瓷组成的深度过滤器。US 4，676，904描述了由与硅藻土或珍珠岩组合的中性和带正电的纤维素纤维组 成的深度过滤器层。US 4，007，114描述了用于分离0. 1_0. 7 μ m大小的带负电的颗粒的由纤维素和玻 璃纤维以及带正电的三聚氰胺-甲醛树脂组成的无颗粒过滤器介质。在US 4，007, 113和 US 4，321，288中描述了将硅藻土添加到该过滤器系统。US 4，305，782描述了一种过滤器系统，其具有正ζ电位，由纤维素纤维和SiO2/ Al2O3复合物组成，没有湿强度剂。用US 4，305，782中公开的过滤器系统从生物溶液除去 大小在亚微米范围内的污染物的方法描述于US 4，366，068中。在US 4，309，247中描述了将未研磨和研磨的纤维素纤维的组合与50重量％的粉 末，如硅藻土 /珍珠岩以及带正电的三聚氰胺-甲醛树脂一起引入过滤器系统。US 4，282’ 261描述了通过由纤维素纤维、硅藻土和聚酰胺/聚胺-表氯醇树脂组 成的过滤器系统从不稳定饮料除去悬浮物质的方法。US 4，859，340描述了由至少50重量％含SiO2的粉末如硅藻土，纤维素纤维以及 1-3重量％的聚酰胺/聚胺-表氯醇树脂组成的深度过滤器层，其中深度过滤器层表现出对 来自液体的带负电的颗粒污染物增大的结合量。在US 4, 981,591中描述了将一次和二次电荷载体(charge carriers)引入含有纤维素纤维和硅藻土的深度过滤器元件。将聚酰胺/聚胺-表氯醇树脂吸附到深度过滤器 元件表面作为一次电荷修饰剂(primary charge modification agent)，并随后将具有伯 胺和仲胺官能团的脂肪族多胺键合到一次电荷修饰剂的环氧基团作为二次电荷修饰剂。在 US 5，085，780中描述了用公开于US 4，981，591的这些过滤器层从水性溶液除去阴离子污 染物的工艺。根据目前工艺水平使用的深度过滤器层一方面用于分离大于过滤器孔径的颗 粒(筛孔效应)，另一方面，小于过滤器孔径的颗粒通过吸附相互作用被深度过滤器保留 (retained)。目前为止，纤维素类深度过滤器层已特别发现用于细胞培养液纯化的用途。 在过去10年中，细胞培养工艺中的细胞密度已从大约IO5个细胞/ml增加到远超过IO7个 细胞/ml。与此相关的是细胞活力显著地降低，随着全面的细胞溶菌作用(cell lysis), 导致细胞蛋白质和DNA浓度非常显著的增加。现代细胞培养工艺显示了超过IO7个细胞/ ml的细胞密度和小于50%的活力，它们能够导致DNA浓度达到Kfppmdg/l) (Tarrach et al. ,Pharmaceutical Technology Europe，01. 2008 年 4 月，71-77)。这是关于分离非需要 的组分如细胞、细胞碎片、胶质组分、细胞蛋白质、DNA等的特殊深度过滤器需求增加的基本 原因。同时，必须确保成本集中(cost-intensive)的治疗性目标蛋白能够以活性形式不受 阻碍地通过深度过滤器。因此，对改善的深度过滤器层在更高量和/或更高污染物清除以 及足够高的目标蛋白传送方面存在不断的需要。有关当局明确需要清除细胞培养DNA，这是因为它在人类发病机理方面对于患者 代表一种危险。指导准则是“Points to Consider in the Manufacturing and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use，，(FDA CBER ； 1997 年 2 月 28 日) 禾口 "Requirements for Biological Substances No. 50. Requirements for the Use of Animal Cells as in vitro Substrates for the Production of Biologicals，， (WHO Technical Report Series No. 878，1998)。关于工艺技术，因为根据准则，生物反应器/ 发酵罐下游的纯化工艺必须去除该DNA至检出限以下的含量，所以高DNA浓度是一个问 题。通常将色谱方法(“捕获步骤”中的蛋白质A和流动方式下的阴离子交换色谱法)用 于DNA清除。然而，在起始DNA浓度大于IOfiPPm的情况下，通过这些工艺进行充分的DNA 清除在工艺技术和经济方面是不切实际的(K. Tarrach,"Process Economy of Disposable Chromatography in Antibody Manufacturing"WIBio ' s BioProcess Technology 4th Annual Conference(Amsterdam, The Netherlands,2007 年 4 月))。因此，为了使下游工艺没有高的DNA和污染物浓度，在起始处理(workup)步骤需 要另外的步骤或改善的技术，因为由于高传导性曲线(conductivity profile)，色谱方法 在这点上不足(J. Nolan, EMD Pharmaceuticals, Downstream Technology Forum, Boston, Massachusetts, October 9th, 2007)。在原理上通过使用更大的深度过滤器面积或更大的过滤器体积提供这样的可能 性，并且发现多层深度过滤器在此特别有效，因为通过使用更大的过滤器层高度(一层铺 设在另一层之上的2层过滤器层)和由于与其相关的更高的滞留(residence)时间以及更 大的结合量，能够清除比单层深度过滤器更大的DNA量。从文献中，目前已知仅有少量通过深度过滤器清除DNA的研究(Review in: Yigzaw et al. ,Biotechnol. Prog. 2008,22,288-296 ；"Exploitation of the AdsorptiveProperties of Depth Filters for Host Cell Protein Removal during Monoclonal Antibody Purification”)。这些表明DNA结合通过疏水机制和电荷依赖机制两者发生。 其中，过滤器的正表面电荷最重要，并通过利用带正电的结合剂(binder)来获得正表面电 荷。结合剂含量对DNA滞留(retention)的影响由hchrich等人研究并表明DNA滞留通 过结合剂含量仅能增加到有限程度(BioWmrm，January 1997，46_49)。另外，该方法具有 重大缺陷，即，随着在深度过滤器中增加结合剂含量，在工艺中可提取组分的含量也增加。能够增加DNA清除而不同时增加可提取组分的深度过滤器代表了所希望的改进。 同时，随着DNA清除的增加目标产物如治疗性蛋白质的清除必须不增加。在这点上，强调应 当赋予DNA清除深度过滤器层以物理化学稳定性是重要的，该物理化学稳定性允许该DNA 清除深度过滤器层在下游工艺中的色谱工艺前或后使用。同时，DNA清除深度过滤器层的结 合量应当位于细胞培养上清液的传导性曲线之内，以便能够可靠的清除所述的污染物。在 第一纯化步骤之后的工艺开始时使用这样的深度过滤器层以减轻下游的负担、更成本集中 的纯化步骤是可能和必要的。在Angew. Chem. 2000，112,4207-4211 中，报道 了作为 DNA-LDH 杂合物形式的 无机、非细胞毒素载体的可溶性层状双氢氧化物(LDH)。在此，带负电的DNA片段通过 离子交换过程插入层状双氢氧化物的带正电的、水镁石类层的夹层空隙。通过该引入 (incorporation)，防止DNA的降解并能够通过胞吞作用将DNA-LDH杂合物输送到哺乳动物 细胞中。然后在细胞的细胞质中释放DNA用于进一步的工艺中。在DE 102 37 517 Al和DE 102 37 518 Al中，描述了利用粉末形式的层状双氢 氧化物如煅烧的水滑石富集或清除生物分子。多孔层状双氢氧化物作为吸附剂起作用，这 些吸附剂与结合剂如尤其是藻酸盐、壳聚糖、果胶和碳酸钙结合成为颗粒聚集体或成形体 或者沉淀到载体如碳酸钙上。从而，得到在煅烧的水滑石和DNA之间以及在煅烧的水滑石 和所需的目标蛋白之间的高结合量。发现平均粒径(D50)超过Iym的水滑石特别有利于 用作吸附剂。根据DE 102 37 517 Al和DE 102 37 518 Al，用该吸附剂不能实现将目标蛋 白与DNA选择性分离。JP 2006-026566 A描述了膜状材料(其由有机聚合物颗粒、水滑石和基于纸或塑 料膜的过滤材料组成)，其用于吸附气体，用于家庭领域内的除臭，用于食物保鲜以及驱虫 剂。JP 2003-047647 A描述了水滑石、金属氧化物、(甲基)丙烯酸衍生物和有机聚硅氧烷 的除臭组合物。WO 2005/014160A1描述了基于含纤维素或木质素的纸以及无机层状双氢氧 化物的多孔材料。DE 295 20 817 Ul描述了从纤维素纤维和湿强度剂生产的纸。DE 100 44 218 Al描述了湿强度处理的深度过滤器，其中的纤维素纤维用亲水性聚异氰酸酯处理。在目前工艺水平下，不知道任何关于利用水滑石或利用深度过滤器层来选择性和 充分高地清除非所需的生物分子如DNA同时与目标蛋白不结合的情况。

发明内容
本发明的目的是提供小规模和大规模、工业规模的稳定且廉价的深度过滤器层， 其能够特别高和快速的从液体介质中清除非所需的生物污染物如核酸，同时所需的目标产 物如治疗性蛋白质能够以活性形式不受阻碍地通过深度过滤器。另外，还应当提供根据本 发明的深度过滤器层的应用，从生产溶液分离生物污染物的方法和含有根据本发明的深度过滤器层的过滤设备。这个问题通过提供根据权利要求1所述的深度过滤器层、根据权利要求18所述的 生产深度过滤器层的方法，通过使用根据权利要求32所述的根据本发明的深度过滤器层， 通过提供根据权利要求27所述的将污染物与目标产物分离的方法以及通过提供根据权利 要求沈所述的含有根据权利要求1所述的深度过滤器层的过滤设备来解决。目标产物应当理解为意指通过上游生产工艺得到的所有产物。它们包括生物分子 如蛋白质、肽、多肽或激素。特别地，目标产物理解为意指治疗性蛋白质。本文中，核酸应当理解为意指所有天然存在的核酸如核糖核酸(RNA)和脱氧核糖 核酸(DNA)，特别是源自真核、原核和病毒来源的基因组以及表观基因组的DNA，并相当特 别的是具有超过15个碱基对链长度的核酸。污染物应当理解为意指不同于目标分子并包含于生产溶液的所有物质，特别是整 个细胞和细胞聚集体、细胞碎片、胶质组分和大分子生物分子，并且在后者的情况下，特别 是指选自由核酸、宿主细胞蛋白质、脂多糖、脂质、糖类等的组中的那些生物分子。术语生产 溶液包括其中目标分子是通过生物生产者(发酵方法)，特别是来自真核和原核生物体以 及细胞的组中的生物生产者来生产的那些溶液。另外，它包括源自于发酵液的那些溶液，特 别是通过分离工艺如离心、预过滤、渗透工艺或者稀释或引入化学药品等来生产的那些溶 液。令人惊讶地发现，根据本发明，含有无机层状双氢氧化物，特别是水滑石的深度过 滤器层选择性结合生物组分，其中发生非所需生物污染物如DNA的特别高的清除，而所需 的目标蛋白能够不受阻碍地通过深度过滤器。目前工艺水平的深度过滤器仅清除可忽略量 的DNA而目标蛋白大量不受阻碍地通过深度过滤器。目前工艺水平的水滑石粉末(没有处 理到深度过滤器层中)既所希望地清除DNA又非所需地清除目标蛋白。与目前工艺水平相比，用根据本发明的深度过滤器层，实现高达10倍的DNA高清 除(比较后面的表3，"50% DBT”，例如DF4对DF7)，而没有所需的目标蛋白结合到深度过 滤器上。这种表现是令人惊讶的，因为例如水滑石作为粉末没有选择性；生物污染物如DNA 以及所需的目标蛋白在很大程度上都结合，这使得不可能使用粉末本身用于纯化细胞培养 液。仅仅通过根据本发明的例如将水滑石粉末处理到具有纤维素纤维、任选的硅藻土和带 正电的湿强度剂的深度过滤器层中的工艺，就实现了这种从生产溶液分离生物组分的高度 选择性。显然，这种令人惊讶和有益的表现是基于水滑石和带电湿强度剂的复合结构之间 的相互作用。


图1至6示出在下文中更详细说明的穿透曲线。
具体实施例方式本文中，根据本发明的湿强度剂应当理解为意指在深度过滤器生产工艺中添加到 水性悬浮液以增加湿态深度过滤器的拉伸强度、耐折强度、破裂强度和耐磨强度的所有水 溶性合成树脂。本文中，使用具有反应基团的聚合或多官能化合物，所述聚合或多官能化合 物在干燥条件下仅与纤维素和无机粉末的羧基和/或OH基反应，并从而使过滤器组分彼此桥接。湿强度剂的最重要组是表氯醇树脂、三聚氰胺-甲醛树脂(MF)、脲甲醛树脂(UF)、乙 二醛-聚丙烯酰胺树脂以及异氰酸酯树脂。带正电的湿强度剂优选包括聚胺-表氯醇树 脂、聚酰胺-表氯醇树脂和聚酰胺-聚胺-表氯醇树脂，如Kymene 、NadaVin 或Polycup ，其中作为反应基团的具有张力环四元环结构的阳离子氮杂环丁烷鐺(azetidinium)基团 能够同质交联(homo-crosslinking)和共交联。使用根据本发明的含有例如水滑石的深度 过滤器层，第一次能够提供除了分离常规细胞和细胞碎片以及除去胶质组分之外，还同时 从细胞培养液除去大量DNA的深度过滤器层。因此，根据本发明的例如含水滑石的深度过 滤器层产生在降低污染物浓度方面改善质量的滤液，这有利地导致随后和有时昂贵的“下 游工艺”中的纯化步骤，即下游中用于目标分子处理的多步骤工艺的简化。根据本发明的深 度过滤器层的物理化学稳定性因此能够使深度过滤器在下游工艺的色谱法步骤之前以及 色谱法步骤之后均用于细胞培养液的过滤。从而，得到在细胞培养上清液的传导性曲线中 的高DNA结合量。正如上述部分所述，根据本发明的深度过滤器层由纤维素纤维和/或其衍生物、 至少一种无机层状双氢氧化物和至少一种有机湿强度剂制成。根据本发明，使用从木材(硬木材或软木材)或棉花原始获得的纤维素纤维和/ 或其衍生物。优选使用来自木材并特别优选来自软木材的纤维素纤维。可以使用不同长度 (长和短纤维纤维素)的纤维素纤维的混合物以及纯短或纯长纤维纤维素，其中纤维长度 位于0. Imm至7mm之间，并且纤维宽度在5 μ m至30 μ m之间，优选在10 μ m至30 μ m之间。 在过滤器中，纤维素形成三维网络，其确保高机械稳定性和高流速。在三维网络的空腔以 及无机粉末中，存在短纤维纤维素，所述短纤维纤维素还用作填料并有助于过滤器表面的 平滑。在优选实施方案中，将专用短纤维纤维素用作纤维素纤维。还可使用纤维素纤维的 衍生物，水溶性羧基烷基纤维素是优选的。水溶性羧基烷基纤维素中特别优选羧甲基纤维 素(CMC)。CMC在用于生产根据本发明的深度过滤器层的混合物中的重量比为0. 1至10% 之间，优选在0. 3至2. 0%之间，更优选在0. 4至1. 5%之间和最优选在0. 5至1. 0%之间。 CMC与表氯醇树脂组合导致改善的干态强度和湿态强度。另外，作为纤维素的衍生物，可使 用阳离子改性的纤维素，如用带铵离子的基团，优选三甲基铵丙基纤维素氯化物(trimethy Iammoniumpropylcellulose chloride)和2-羟基-三甲基铵丙基纤维素氯化物官能化的 或者用氨基、优选烷基胺官能化的纤维素。如F. Cavani 等人在 Catalysis Today 1991，11 (2)，173-301 中所描述的，根据本 发明的深度过滤器层的无机层状双氢氧化物优选选自天然和合成水滑石和水滑石类化合 物的组。在这方面，可特别参考第176至191页，其公开的内容包含于此作为参考。水滑石 具有在夹层空隙内具有可交换的阴离子的阳离子层结构。根据本发明，对于上述的天然和 合成水滑石和水滑石类化合物，例如可以给出下式用于说明[ (M2+) “ (M3+) x (OH) 2]x+ (An_x/n) · mH20[ (M+) h (M3+) x (OH) 2] (2x_1)+ (Αη_βχ_1)/η) · mH20本文中，χ可以取0至1的值，优选0.1彡χ彡0.5和更优选0.2彡χ彡0.33。η 可以取1至4的值，和m根据结晶水的量而变化并且是包括0的有理数。在适当化合物中 结晶水的最大可能量可通过描述于上述资料的第189和190页的各种方法测量。另外，对 于上述天然和合成的水滑石以及水滑石类化合物还可以规定例如不仅含有M+而且含有M2+的化合物。对于这些情况，同样可参考上述资料。根据本发明，优选将水滑石Mg6Al2 (CO3) (OH)16 · 4H20用作天然或合成的、未被煅烧 的产物。通常，使用的层状双氢氧化物由一价、二价和三价金属阳离子M+、M2+和M3+，氢氧化 物阴离子0H—和另外的一价至四价阴离子Α11—(η = 1、2、3、4)以及如果需要的结晶水组成。此 处M+是一价碱金属离子如Li+或Na+，M2+是二价碱土或过渡金属离子如Mg2+、Sr2+、Ba2+、Ni2+、 Cu2\Co2\Zn2\Fe2\Mn2+ 或 Ca2+，M3+ 是三价主族或过渡金属离子如 B3+、Al3+、(ia3+、Ni3+、Co3+、 Cr3+、Fe3+、Mn3+、V3+、Ti3+、Sc3+ 或 In3+，A^ 是阴离子如 Γ、Cl\ Br\ Γ、0H\ NO” ClOp ClOf、 I(V、CO广、SO:、PO广、As043\ 广、WO广、CrO广、[Fe (CN) 6]3\ [Fe (CN)6广、[SiO (OH) 3Γ、杂 多酸、有机酸或有机金属配合物。此处杂多酸的实例是(PMo12O4tl)3IP (PW12O4tl)3_，有机酸的 实例是脂肪酸、草酸、琥珀酸、丙二酸、癸二酸、1，12-十二烷二羧酸，酰基和芳基磺酸盐以及 氯肉桂酸，和有机金属配合物的实例是[1 1^4，7-二苯基-1，10-菲咯啉二磺酸盐)3]4_。此 处M2+与M3+的摩尔比最大为2. 5 1，优选最大为2.3 1并特别优选最大为2.1 1。M2+ 与M3+的重量比(以氧化物MO与M2O3的重量比计算)最大为2. 2 1，优选最大为2.0 1 并特别优选最大为1.85 1。最优选使用由镁和铝阳离子和作为阴离子的碳酸盐组成的合 成、未被煅烧的水滑石。在实际的实例中，使用来自^ldchemie AG的碱式碳酸铝镁Syntal 696，其中氧化物MgO与Al2O3的重量比等于1.625。无机层状双氢氧化物颗粒的直径在 0. 1 μ m至500 μ m之间，优选在0. 3至300 μ m之间和特别优选在0. 5至100 μ m之间。使用 的水滑石具有超过15m2/g，优选超过25m2/g和特别优选超过35m2/g的布鲁厄-埃米特-特 勒(Brunauer-Emmet-Teller) (BET)表面积。在特别的实际的实例中，使用BET表面积为 50m2/g或54m2/g的水滑石粉末。如下所述测定此处的BET表面积。根据本发明的深度过滤器层可以只包括无机层状材料也可以包括无机层状材料 和基于SiO2的颗粒和/或至少一种其衍生物的混合物作为无机粉末。作为基于SiO2的颗 粒，优选使用多孔硅藻土和/或合成硅胶，任选地与珍珠岩组合。特别优选使用硅藻土，任 选地与珍珠岩组合，最优选天然硅藻土。天然硅藻土未被煅烧。基于SW2的颗粒的衍生物包 括基于S^2的所有阴离子交换材料，如含有季铵离子的用有机基团官能化的Sio2,特别优 选用三甲基铵丙基氯化物官能化的Si02。基于SiA的颗粒的平均粒径在0. 5 μ m和100 μ m 之间，优选2 μ m禾口 40 μ m之间，相当优选4 μ m禾口 20 μ m之间。在实际的实例中，使用具有 8μπι平均粒径的硅藻土。优选只使用水滑石或水滑石和硅藻土的混合物作为无机粉末。此处特别优选只有 水滑石或水滑石按重量计的含量大于硅藻土按重量计的含量的水滑石和硅藻土的混合物。 在根据本发明的深度过滤器7(ΗΤ900)的实际实例中，仅使用水滑石，并在另外的实际实例 中，水滑石按重量计的含量优选至少1. 7倍，特别优选至少两倍于硅藻土按重量计的含量。使用的基于其它组分的无机粉末按重量计的含量在10%至75%之间，优选20% 至70%之间，和特别优选为30%至65%之间。深度过滤器层中水滑石的含量越高，根据本 发明的深度过滤器的DNA结合量越高。作为湿强度剂，根据本发明，使用来自以下组中的水溶性树脂表氯醇树脂、三聚 氰胺-甲醛树脂、脲甲醛树脂、乙二醛-聚丙烯酰胺树脂、异氰酸酯树脂及它们的混合物。优 选的是带正电的表氯醇树脂，并且特别优选的是聚酰胺/聚胺-表氯醇树脂、聚胺-表氯醇 树脂和聚酰胺-表氯醇树脂，如Kymene 、Nadavin 或Polycup 。在实际的实例中，使用来自Hercules的Kymene 作为湿强度剂。当在生产工艺中将树脂与根据本发明的深度过 滤器层的其它组分接触时，在湿强度剂的反应性氮杂环丁烷鐺基团或其它表氯醇类基团和 纤维素纤维以及无机粉末(由无机层状双氢氧化物和任选的基于S^2的颗粒如天然硅藻 土或合成硅胶组成)的羧基和/或羟基之间发生聚合物桥接，然而主要只在过滤器生产的 随后干燥工艺中发生随着共价键如酯键以及非共价键的形成的化学交联。只有通过这种反 应，在维持正电荷的使用过程中深度过滤器才能保持其湿态强度。基于添加的其它过滤器 组分的湿强度剂按重量计的含量在0.5%至10%之间，优选至5%之间。在实际的实例 中，使用2%的湿强度剂。根据优选实施方案，本发明提供深度过滤器，其由以下生产纤维素纤维和/或其衍生物，至少一种无机层状双氢氧化物和至少一种有机湿强度剂，其中深度过滤器层由混合物生产，该混合物中至少一种无机层状双氢氧化物按重 量计的含量为10-65%，纤维素纤维和/或其衍生物按重量计的含量为30-80%和有机湿强 度剂按重量计的含量为0. 5-10%，和所述按重量计的含量之和达到100%。根据本发明的深度过滤器层的生产优选通过以下方法来实现，该方法包括以下步 骤(1)在至少一种液体介质中制备纤维素纤维和/或其衍生物，(2)添加至少一种无机层状双氢氧化物，(3)将至少一种有机湿强度剂添加到步骤O)中得到的混合物，(4)将步骤(3)中得到的悬浮液施涂到载体上，(5)除去至少一种液体介质和(6)干燥步骤(5)中得到的深度过滤器层。根据优选实施方案，将纤维素纤维添加到水中并用研磨机研磨至所需的细度 (fineness)。纤维素纤维的研磨程度以及使用的无机粉末的粒径和过滤器中的粉末含量主 要决定了深度过滤器的过滤分辨率(filtration resolution)。还可以在添加无机层状双 氢氧化物之后，即在步骤( 之后或添加湿强度剂之后，即步骤( 之后来进行纤维素纤维 的研磨。本文中，过滤分辨率应当理解为意指来自溶液的不同大小组分的分离。对于比过 滤器层孔径小的那些颗粒，深度过滤也可以有效。因此，用深度过滤器，过滤效果并没有如 基于绝对滞留率的膜的情况中那样由给出的孔径表示。此处，过滤分辨率的表征而是由规 定条件下的水渗透性的状况来确定。添加无机粉末后，纤维素纤维和无机粉末的水悬浮液的总固体含量为大约4%。根 据本发明可在添加无机粉末前或后进行湿强度剂的添加。将得到的悬浮液例如施涂到筛 分容器(sieving vessel)，例如通过应用表面真空除去水，根据优选实施方案在此期间浓 缩的悬浮液同时通过超行程辊(overtravelling rollers)均质化并使得到的过滤器表面 平滑。优选通过辊将湿深度过滤器层压缩至所需的过滤器厚度并优选在干燥炉内在大约 100-250°C的可变可调温度区域内干燥。在此期间中，可用升温曲线或在恒温下进行干燥。 优选运行温度曲线，相当优选具有不同温度区域的温度曲线。根据本发明的深度过滤器层的厚度优选在1至8mm之间，特别优选2至6mm之间。在实际的实例中该厚度在3. Omm至 4. 5mm之间。通过测量47mm直径的根据本发明的深度过滤器在Ibar压差下IOOml蒸馏水 需要的以单位[s]表示的时间得到作为根据本发明的深度过滤器的过滤分辨率量度的水 流速(water flow)。也经常将水流速表示为具有单位[升/ (m2aiI^ 分钟)]的水流速率。 优选在厚度为约4mm下具有水流速率为20至20001/(m2min)的根据本发明的深度过滤器 层。根据本发明另外的优选实施方案，在上述步骤(4)之前可添加二氧化硅和/或其 至少一种衍生物作为另外的组分。可选地，根据本发明，在步骤O)中可将二氧化硅和/或 其至少一种衍生物与至少一种无机层状双氢氧化物一起添加。根据本发明另外的优选实施方案，在上述步骤(4)之前可添加硅藻土和/或珍珠 岩作为另外的组分。可选地，根据本发明，在步骤( 中可将硅藻土和/或珍珠岩与至少一 种无机层状双氢氧化物一起添加。根据本发明的深度过滤器层用于从液体介质中除去颗粒、胶质和溶解组分的过滤 工艺中。本文中待分离组分优选为非所需的生物污染物。特别优选的待分离组分包括来自 细胞培养液的污染物，如细胞、细胞碎片、胶质组分、细胞蛋白质、DNA、病毒和内毒素。本文 中的分离包括这样的分离，即从液体介质分离至少一种非所需的生物污染物，而仍包含于 液体介质的目标产物能够以活性形式不受阻碍地通过深度过滤器层。目标产物应当理解为 意指通过上游生产工艺得到的所有产物。优选目标产物包括生物分子。特别优选地，将目 标产物理解为意指蛋白质、肽、多肽或激素。特别地，将目标产物理解为意指治疗性蛋白质。 本文中，将液体介质理解为意指能够使待分离组分与深度过滤器接触的所有介质。本文中 它们特别是溶液、悬浮液、分散液、乳液或胶体溶液形式的水性或含水的介质。其中可使用 常规的所有液体介质，如生物和生物技术溶液，医学溶液，来自食品、饮品、动物饲料和工业 垃圾的溶液和来自化学工业的溶液。优选地，将根据本发明的深度过滤器层用于来自生物、 生物技术和制药工业以及来自饮食工业的液体介质的过滤。特别优选地，将深度过滤器层 用于生物和生物技术溶液的过滤。在实际的实例中，将深度过滤器层用于细胞培养液以及 含DNA和含蛋白质的生物溶液的过滤。本文中，可通过尺寸排阻、通过吸附机制、通过离子 交换工艺和/或插层反应(intercalation)进行从待过滤液体介质除去待分离组分。如果需要，根据工艺，新式深度过滤器层必须在其使用前通过冲洗工艺，如用水或 用含缓冲液的溶液预冲洗来制备。如果需要，根据工艺待过滤液体介质也必须在其使用前， 如通过预过滤或离心来制备。 为了适当地利用深度过滤器层，本发明进一步提供含有上述特征的深度过滤器层 的过滤设备。根据本发明的过滤设备优选包含金属或特别优选塑料或类似材料的过滤器外 壳，其能够使过滤设备和至少一种上述特征的深度过滤器层廉价的一次性使用。另外，提供一种方法，其用于将液体介质中的至少一种目标产物与至少一种生物 污染物分离，该方法包括以下步骤(a)将含有至少一种污染物和至少一种目标产物的液体介质与至少一种根据本发 明的深度过滤器层接触，(b)通过至少一种深度过滤器层滞留至少一种污染物和(C)得到含有至少一种目标产物和液体介质的滤液。
作为另外的步骤(d)，在另外的优选实施方案中，可以在步骤(C)之后用液体介质 和/或用冲洗介质洗涤深度过滤器层以增加滤液中至少一种目标产物的含量。根据本发明的工艺可以是独立的工艺或可以是包含有其后进一步的纯化步骤的 更复杂工艺的一部分。最后，本发明提供上述特征的深度过滤器层用于除去污染物的用途。参考实施例中所述的实施方案在下面的描述中将更详细地说明本发明及另外由 其产生的优点。
实施例分析方法的描述静杰的DNA和蛋白质结合为了测定无机粉末的静态结合量，将在蒸馏水中的粉末的规定的悬浮液制备为含 量为50mg无机粉末/ml蒸馏水。将悬浮液分成IOml塑料离心管中的Iml等份。向等份 中进一步添加3. 5ml蒸馏水和0. 5ml IOX浓缩的PBS缓冲液(在水中的2. 4g KH2PO4/1, 14. 4g Na2HPO4 · 2H20/l，80g NaCl/l，2g KC1/1)，将其混合并温育 10 分钟。摇动以平衡。 离心后除去上清液。平衡过的粉末用2.5ml DNA测试溶液或蛋白质测试溶液在室温摇动 下温育3小时。作为测试溶液，使用溶解于1 X浓缩PBS缓冲液中浓度为lmg/ml的鲑鱼精 DNA (钠盐，尺寸分布500-1000个碱基对，产品编号54653，Biomol)或多克隆人IgG混合物 (Cytoglobin /Bayer Vital, D-Leverkusen)。接下来，离心后，基于标准系列光度测定上 清液的DNA或蛋白质浓度。无机粉末和深度过滤器材料的BET测定利用Gemini BET系统(Micromeretics)进行通过布鲁厄-埃米特-特勒(BET) 方法的材料吸附表面的测定。为了制备，用样品填充约25%的玻璃样品管并在真空120°C 下加热2小时以干燥。得到的干燥样品的重量基于来自空样品管的重量差来测定。为了测 定BET表面积，将样品管以设置的安装方式固定于Gemini BET系统中。与用液氮冷却的 空参比管相比较进行测定。通过启动设备的软件通过在200mm Hg/min的抽气速度下记录 11个测定点和假设氮气的以下物理性质，进行测定和评价浓度0. 0015468，非理想因子 0. 000062，分子横截面积0. 162mm2。动杰的DNA和蛋白质结合对深度过滤器层的动态结合量的测定是利用直径为47mm和有效过滤器面积为 13. 2cm2的圆形压盘(pressed discs)以流动方式在流速为4. 3ml/min的恒定流下进行的。 压盘放置于不锈钢过滤外壳中(Sartorius Stedim Biotech GmbH)，用200ml反渗透(RO) 水，然后用60ml IX浓缩的PBS缓冲液预冲洗，然后用DNA或蛋白质测定溶液彻底冲洗。 作为测试溶液，使用溶解于1 X浓缩PBS缓冲液的浓度为0. 5mg/ml的鲑鱼精DNA (钠盐，尺 寸分布为500-1000个碱基对，产品编号M653，Biomol)或浓度为lmg/ml的多克隆人IgG 混合物(Cytoglobin /Bayer Vital, Leverkusen)。另外，作为测试溶液，使用 DNA 和 IgG 的混合物。向其添加溶解于1 X浓缩PBS缓冲液的浓度为0. 5mg/ml的鲑鱼精DNA(Na盐， 尺寸分布为500-1000个碱基对，产品编号M653，Biomol)并同时添加浓度为lmg/ml的多 克隆、人IgG混合物(Cytoglobin /Bayer Vital, Leverkusen)。通过在线光度计分别在260nm和在^Onm处记录滤液的消光值，由此利用标准系列测定浓度。利用DNA和多克隆、人 IgG混合物的混合物，利用下式AX [260nm的消光]_BX [280nm的消光]计算DNA的浓度， 并用下式CX [280nm的消光]-DX [260nm的消光]计算IgG的浓度。如K. L. Manchester, BioTechniques 20(6) 1996,968-970中所述，由DNA以及多克隆、人IgG混合物的消光系数 计算系数A-D作为特定的仪器常数。通过测定整个过滤过程中的50%动态穿透(DBT)和 累积传送的累积结合进行穿透曲线的评价。将50% DBT理解为意指基于使用的DNA或IgG 浓度，达到滤液流中50%的浓度水平。水流谏为了测量水流速，将直径为47mm的圆形深度过滤器压盘放入200ml容量的过滤器 支座(holder) (Sartorius Stedim Biotech GmbH SM 16249)并用 IOOml 水在 Ibar 分压下 预冲洗。然后用秒表测定Ibar分压下以[s]计的IOOml水的流动时间。假设有效过滤面 积为12. 57cm2用下式计算水流速率水流速率[l/m2min] = 0. 1[1]/(12. 57X10_4[m2] X时 间[min])。職·、臓嶋口痛·利用对应于17. 35cm2过滤器面积具有47mm直径的圆形压盘进行深度过滤器层的 重量、厚度和密度的测定。用试验物质监测天平(test material-monitored balance) (Sartorius LP 3200D)用Img精度测定重量。用来自Hahn & Kolb (精度0. Olmm)的厚度测量装置进行深度过滤器样品平均厚 度的测定。在四个边缘点和压盘中间测量厚度。计算平均厚度作为五个测量点的平均值。由厚度和重量测定值，根据下式计算密度密度[g/cm3]=重量[g]/(17.35cm2X 厚度[cm])。(A)使用的深度过滤器深度过滤器1 :C8HP (Sartorius Stedim Biotech GmbH)深度过滤器2 :S5P (Sartorius Stedim Biotech GmbH)深度过滤器3 :40DE (Millipore Corp.)深度过滤器4 :75DE (Mi 11 ipore Corp.)深度过滤器5 :HT500，根据本发明，按照(B)深度过滤器6 :HT750，根据本发明，按照(B)深度过滤器7 :HT900，根据本发明，按照(B)深度过滤器8 :HT500G，根据本发明，按照(B)深度过滤器5(HT500)37. 5重量％的纤维素纤维(Weyerhaeuser Tyee)、0. 5重量％的羧甲基纤维素、38 重量％的水滑石Syntal 696 (0. 8 μ m-25 μ m)、22重量％的硅藻土 SA3、2重量％的Kymene
ο深度过滤器6(HT750)32. 5重量％的纤维素纤维(Weyerhaeuser Tyee)、0. 5重量％的羧甲基纤维素、45 重量％的水滑石Syntal 696 (0. 8 μ m-25 μ m)、20重量％的硅藻土 SA3、2重量％的Kymene
深度过滤器7 (HT900)34. 5重量％的纤维素纤维(Weyerhaeuser Tyee)、0. 5重量％的羧甲基纤维素、63 重量 ％ 的水滑石 Syntal 696 (0. 8 μ m-25 μ m)、2 重量 ％ 的 Kymene 。深度过滤器8 (HT500G)27. 5重量％的纤维素纤维(Weyerhaeuser Tyee)、0. 5重量％的羧甲基纤维素、55 重量％的水滑石Syntal 696 (1 μ m-278 μ m)、15重量％的硅藻土 SA3、2重量％的Kymene
ο
(C)水滑石粉末Svntal 696的表征测量静态系统中鲑鱼精DNA (钠盐，尺寸分布500-1000个碱基对，产品编号 54653,Biomol)的结合和多克隆人IgG混合物(Cytoglobin /Bayer Vital,D-Leverkusen) 的结合。详细步骤描述于上述“分析方法”部分。表权利要求
1.一种深度过滤器层，其由以下组分生产纤维素纤维和/或其衍生物，至少一种无机层状双氢氧化物和至少一种有机湿强度剂，其中所述深度过滤器层由混合物生产，所述混合物包含按重量计含量为10-65%的所 述至少一种无机层状双氢氧化物、按重量计含量为30-80%的所述纤维素纤维和/或其衍 生物和按重量计含量为0. 5-10%的所述有机湿强度剂，基于所述混合物总重量。
2.根据权利要求1所述的深度过滤器层，其特征在于所述至少一种无机层状双氢氧化 物含有一价碱金属离子M+和/或二价碱土或过渡金属离子M2+、三价主族或过渡金属离子 Μ3+、η = 1-4的η价阴离子Αη_和氢氧离子0Η_。
3.根据权利要求1或2所述的深度过滤器层，其特征在于所述一价碱金属离子M+是单 独或组合形式的Li+、Na+,所述二价碱土或过渡金属离子M2+选自Mg2+、Sr2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、 Co2+、Zn2\ Fe2\ Mn2+、Ca2+或它们的组合的组，所述三价主族或过渡金属离子M3+选自B3+、 Al3+、Ga3+、Ni3+、Co3+、Cr3+、Fe3+、Mn3+、V3+、Ti3+、Sc3+、In3+ 或它们的组合的组和所述 η 价阴离 子选自 Γ、Cr、Br\ Γ、N03\ ClOp CIO” 10” CO广、S042\ P043\ As043\ S2032\ W042\ Cr042\ [Fe(CN)6]3_、[Fe(CN)6]4_、[SiO(OH)3]_、杂多酸、有机酸、有机金属配合物或它们的组合的 组。
4.根据前述权利要求任一项所述的深度过滤器层，其特征在于所述无机层状双氢氧化 物含有结晶水。
5.根据前述权利要求任一项所述的深度过滤器层，其特征在于所述无机层状双氢氧化 物具有下式[(M2+)^x (M3+) x (OH) 2]x+(An-x/n) · mH20和其中0. 1彡χ彡0. 5，1彡η彡4和m是包括0的有理数。
6.根据权利要求1至4任一项所述的深度过滤器层，其特征在于所述无机层状双氢氧 化物具有下式[(M+) l x (M3+) x (OH) 2] (2χ-1)+ OT(2χ_1)/η) · mH20和其中0. 1彡X彡0. 5，1彡η彡4和m是包括0的有理数。
7.根据权利要求1至5任一项所述的深度过滤器层，其特征在于所述无机层状双氢氧 化物是水滑石Mg6Al2(CO3) (OH) 16 · 4H20。
8.根据权利要求7所述的深度过滤器层，其特征在于所述水滑石未被煅烧。
9.根据前述权利要求任一项所述的深度过滤器层，其特征在于所述至少一种有机湿强 度剂是水溶性和带正电的。
10.根据权利要求9所述的深度过滤器层，其特征在于所述至少一种有机湿强度剂选 自聚酰胺/聚胺-表氯醇树脂、聚酰胺-表氯醇树脂、聚胺-表氯醇树脂或它们的混合物的 组。
11.根据前述权利要求任一项所述的深度过滤器层，其特征在于所述深度过滤器层通 过进一步添加二氧化硅和/或其至少一种衍生物而生产。
12.根据权利要求1至10任一项所述的深度过滤器层，其特征在于所述深度过滤器层通过进一步添加硅藻土或珍珠岩或它们的混合物而生产。
13.根据权利要求11所述的深度过滤器层，其特征在于所述二氧化硅和/或所述至少 一种衍生物包括平均直径在0. 5 μ m和100 μ m之间的颗粒。
14.根据权利要求12所述的深度过滤器层，其特征在于所述硅藻土、珍珠岩或它们的 混合物包含平均直径在0. 5 μ m和100 μ m之间的颗粒。
15.根据前述权利要求任一项所述的深度过滤器层，其特征在于所述至少一种无机层 状双氢氧化物包含平均直径在0. 1 μ m和500 μ m之间的颗粒。
16.根据权利要求11或13所述的深度过滤器层，其特征在于所述深度过滤器层由混合 物生产，在所述混合物中，所述至少一种无机层状双氢氧化物和所述二氧化硅和/或所述 其至少一种衍生物按重量计的含量为20-75%，所述纤维素纤维和/或其衍生物按重量计 的含量为30-80%和所述有机湿强度剂按重量计的含量为0. 5-10%，这些按重量计的含量 合计达100%。
17.根据权利要求12或14所述的深度过滤器层，其特征在于所述深度过滤器层由混合 物生产，在所述混合物中，所述至少一种无机层状双氢氧化物和所述硅藻土或所述珍珠岩 或它们的混合物按重量计的含量为20-75%，所述纤维素纤维和/或其衍生物按重量计的 含量为30-80%和所述有机湿强度剂按重量计的含量为0. 5-10%，这些按重量计的含量合 计达100%。
18.—种生产根据前述权利要求任一项所述的深度过滤器层的方法，其包括以下步骤(1)在至少一种液体介质中制备纤维素纤维和/或其衍生物，(2)添加至少一种无机层状双氢氧化物，(3)将至少一种有机湿强度剂添加到步骤O)中得到的混合物，(4)将步骤(3)中得到的悬浮液施涂到载体上，(5)除去所述至少一种液体介质和(6)干燥步骤(5)中得到的深度过滤器层。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于在步骤O)中添加所述至少一种有机湿 强度剂，并在步骤(3)中添加所述至少一种无机层状双氢氧化物。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于在步骤(1)之后和在步骤( 之前 研磨所述纤维素纤维和/或其衍生物。
21.根据权利要求18至20任一项所述的方法，其特征在于在步骤(6)中在100°C至 250 V下干燥所述深度过滤器层。
22.根据权利要求18至21任一项所述的方法，其特征在于在步骤(4)之前添加二氧化 硅和/或其至少一种衍生物作为另外的组分。
23.根据权利要求18至21任一项所述的方法，其特征在于在步骤( 中将二氧化硅和 /或其至少一种衍生物与所述至少一种无机层状双氢氧化物一起添加。
24.根据权利要求18至21任一项所述的方法，其特征在于在步骤(4)之前添加硅藻 土、珍珠岩或它们的混合物作为另外的组分。
25.根据权利要求18至21任一项所述的方法，其特征在于在步骤O)中将硅藻土、珍 珠岩或它们的混合物作为另外的组分与所述至少一种无机层状双氢氧化物一起添加。
26.一种过滤设备，其含有至少一种根据权利要求1至17任一项所述的深度过滤器层。
27.一种利用至少一种根据要求1至17任一项所述的深度过滤器层将液体介质中的至 少一种目标产物与至少一种污染物分离的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(a)将含有所述至少一种污染物和所述至少一种目标产物的所述液体介质与所述至少 一种深度过滤器层接触，(b)通过所述至少一种深度过滤器层滞留所述至少一种污染物，和(c)得到含有所述至少一种目标产物和所述液体介质的滤液。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于在步骤(c)之后接着是进一步的步骤(d)用所述液体介质和/或用冲洗介质洗涤所述深度过滤器层以便增加所述滤液中所 述至少一种目标产物的含量。
29.根据权利要求27或观所述的方法，其特征在于所述至少一种污染物选自核酸、细 胞蛋白质、病毒、内毒素或它们的混合物的组。
30.根据权利要求27至四任一项所述的方法，其特征在于所述至少一种目标产物是蛋 白质。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于所述蛋白质选自抗体、激素、酶、肽或它 们的混合物的组。
32.根据权利要求1至17任一项所述的深度过滤器层用于除去污染物的用途。
全文摘要
本发明涉及包含无机层状双氢氧化物的深度过滤器层，其生产方法，包含深度过滤器层的过滤设备，利用至少一种上述深度过滤器层从液体介质中的至少一种目标产物除去至少一种污染物的方法，以及深度过滤器层用于去除污染物的用途。所述深度过滤器层选择性滞留污染物如核酸，而生物技术工艺中的目标蛋白能够传送进入滤液。
文档编号B01D39/18GK102123777SQ200980131763
公开日2011年7月13日 申请日期2009年8月11日 优先权日2008年8月14日
发明者A·西弗斯, K·凯勒, K·塔里奇 申请人:德国赛多利斯生物技术公司