专利名称：微型高效莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物分离、纯化富集装置，尤其是一种微型高效莱克多巴胺免疫亲和层析柱的制备方法及其应用。
背景技术：
莱克多巴胺均属于β_兴奋剂，可以提高瘦肉率、促进动物生长。因其经济效益明显，利益驱使养殖户或养殖企业大量使用，导致畜产品中莱克多巴胺大量残留，人食用这类畜产品后，可引发肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心等中毒症状，特别是对血压、心脏病患者危害更大，长期使用可能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。莱克多巴胺在许多国家，特别是欧盟和中国，被禁止用做家畜促生长剂。所以，对动物来源的食品中莱克多巴胺残留进行严格地检测是非常重要。由于生物样本成分复杂，待测物浓度低，大多数取样量少，而我国明确规定禁止莱克多巴胺及其衍生物在动物的饲养过程中使用。这就对分析方法的灵敏度、准确度有更高的要求。采用免疫亲和色谱柱提取样品中莱克多巴胺，再与高效液相色谱法(HPLC-UV)、气-质联机法(GC-UV)、胶体金快速试纸条检测法确证是必然的趋势。但是，现有的提取莱克多巴胺免疫亲和色谱柱的技术与工艺存在活化后填料不稳定、非亲和法提纯的抗体特异性差、抗体和填料偶联不稳定，造成偶联在填料上的抗体脱落、装柱体积偏大(装柱体积I毫升以上)，提取莱克多巴胺时造成洗脱体积大、富集效率低，减低了确证的准确度和灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、准确纯化富集莱克多巴胺的免疫亲和纯化富集柱及其制备方法和用途。本发明釆取的技术方案:
本发明的目的是提供一种高效、特异性分离纯化、富集莱克多巴胺(Sal)的免疫亲和纯化富集柱制备方法及其应用。为达上述目的，本发明2次采用抗原抗体的特异性反应和可离解的特性Ag + Ab(固相) Ag-Ab (固相)原理，具体如下:
首先利用这一原理将莱克多巴胺乙酰酯偶联到活化琼脂糖(Agarose)上制得Sal -Agarose亲和柱,用于提取莱克多巴胺特异性多克隆抗体。再利用这一原理将提取所得的抗莱克多巴胺特异性抗体(Ant1-Sal)偶联到Agarose上制得Ant1-Sal- Agarose免疫亲和柱,用于分离纯化、富集待检样品中的莱克多巴胺。根据上述机理， 本发明采用如下具体技术步骤: 一种莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于:
1)将经免疫亲和纯化的莱克多巴胺特异性多克隆抗体和过碘酸活化的琼脂糖混匀，在摇床上室温反应30分钟，然后在4°C冰箱静置30分钟后加入硼氢化钠还原，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液清洗填料，10倍填料体积/次，洗4次，滴干磷酸缓冲液后加入等体积甘油，混匀，得到莱克多巴胺免疫亲和填料；
2)在特制的塑料柱内下端装上过滤膜，将莱克多巴胺免疫亲和填料装入柱中，25μ L/柱，填料上层盖上过滤膜，即得所述的莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱。所述的莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱，包括偶联有免疫亲和纯化的莱克多巴胺特异性多克隆抗体的琼脂糖填料及装载该填料的特制塑料柱。所述的免疫亲和纯化的莱克多巴胺特异性多克隆抗体是用莱克多巴胺与溴乙酰氯反应得到衍生物莱克多巴胺溴乙酰酯溶液，用反向高效液相色谱HPLC纯化该溶液，得到纯化后的莱克多巴胺溴乙酰酯，将纯化后的莱克多巴胺溴乙酰酯与载体蛋白偶联，得到该偶联物作为免疫原免疫动物，得到抗血清，同时用该纯化后的莱克多巴胺溴乙酰酯与经活化的琼脂糖珠反应制备纯化抗体用的免疫亲和柱，用该亲和柱一步提取抗血清得到莱克多巴胺特异性多克隆抗体。所述的莱克多巴胺溴乙酰酯制备方法是将莱克多巴胺标准品在三乙胺催化下与溴乙酰氯反应得到衍生物莱克多巴胺溴乙酰酯溶液。将此莱克多巴胺溴乙酰氯酯溶液用制备型高效液相色谱仪反向柱色谱分离纯化出相对于莱克多巴胺标准品峰后移，且具有莱克多巴胺紫外光吸收光谱特征的单一主峰组分，收集该主峰组分得到纯化的莱克多巴胺溴乙酰酯。所述的莱克多巴胺溴乙酰酯与载体蛋白偶联制备免疫原，是用十二烷基硫酸钠SDS变性牛血清蛋白BSA或卵清蛋白OVA等常用载体蛋白，再与碘乙酸-羟基琥珀酰亚胺酯即NHS-碘乙酸反应，再用二硫苏糖醇DTT还原，得到巯基化的BSA或OVA ;通过葡聚糖凝胶G25 Sephadex脱盐去掉多余的二硫苏糖醇后，将莱克多巴胺溴乙酰酯与巯基化的BSA或OVA混合，调ρΗ=8.5，在室温摇动反应60分钟，经G25 Sephadex脱盐后得到的为免疫原。所述的用纯化后的莱克多巴胺溴乙酰酯与经活化的琼脂糖反应制备纯化抗体用的免疫亲和柱，是将经活化的琼脂糖与赖氨酸反应得到氨基花的琼脂糖，再将氨基化的琼脂糖与NHS-碘乙酸反应后，再用DTT还原，得到巯基化的琼脂糖，将巯基化的琼脂糖和莱克多巴胺溴乙酰酯快速混匀，室温反应60分钟，得到化学共价键复合体莱克多巴胺溴乙酰-琼脂糖填料，将填料装柱，洗去多余的DTT，得到提纯莱克多巴胺特异性抗体用的免疫亲和柱。所述的莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱和莱克多巴胺胶体金试纸条联用的技术。本发明的优点:
I)本亲和柱所用偶联的抗体为经过免疫亲和一步法提纯的，抗体特异性高；采用高密度、大容量将特异性抗体偶联于活化的琼脂糖填料，使得本发明亲和柱抗体和填料结合稳定，柱容量、回收率明显优于当前同类产品，达到排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性。2)本亲和柱装载填料的微型化，填料装柱体积仅需25 μ L/柱，能使洗脱体积缩小，非常明显地提高检测的灵敏度。3)本发明转载填料的塑料柱为特制的，能达到灵活掌握上样体积、提高过柱效率的效果。
图1为经制备型高效液相色谱分离纯化的莱克多巴胺色谱图，及主要衍生组分收集峰。图2为莱克多巴胺多克隆抗体间接竞争ELISA的IC50图。图3为莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱和莱克多巴胺胶体金试纸条联用效果图，图中的1、2为用胶体金试纸条测试莱克多巴胺猪阴性尿液；2、3为用胶体金试纸条检测在莱克多巴胺阴性尿液中加入莱克多巴胺标准品使浓度是0.01ng/mL ;5、6为用胶体金试纸条检测在莱克多巴胺阴性尿液中加入莱克多巴胺标准品使浓度为0.0lng/mL经过莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱富集后的洗脱液。
具体实施例方式提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。实施例1莱克多巴胺特异性多克隆抗体的制备。1.1莱克多巴胺溴乙酰脂的制备:
1.1.1取50 mg的莱克多巴胺溶于500 μ L的富马酸二甲酯(DMF)溶液中，充分溶解冰冻10分钟，再与40 μ 的溴乙酰氯摇匀冰冻2分钟后加入25 μ 三乙胺摇匀，在60°C反应30分钟；加入500 μ 的50%甲醇。1.1.2离心，取上清用制备型高效液相色谱仪(C-18 HPLC)反向柱色谱分离纯化。分别收集相对于莱克多巴胺 标准品峰后移的峰，且有莱克多巴胺紫外光(UV)吸收光谱特征的主要组分(大约20 mg)，冻干。1.1.3收集冻干后的衍生物立即用I mL甲醇复溶，用0.1 mo I/L Na2CO3调PH>8。1.2莱克多巴胺免疫原、配对检测抗原制备 1.2.1莱克多巴胺免疫原
取 250 mg BSA,加入 5 mL 0.1 mol/L Na2C03、0.5 mL 10% 的 SDS 混匀后煮沸 5 分钟变性后冷却至室温，加入100 mg现制的NHS-碘乙酸活性酯(碘乙酸-NHS)，4°C避光反应30分钟，立即脱盐，收集10 mL，然后加入50 mg的二硫苏糖醇(DTT)保持pH>8.5下室温避光反应60分钟，再加入50 mg DTT煮沸5分钟还原。冷却至室温，还原后的BSA经过脱盐柱G25 S印hadex去掉多余的DTT后加入上述1.1.3的经HPLC纯化的莱克多巴胺溴乙酰酯400 μ L，用0.1 mol/L Na2CO3调pH=8.5，室温避光反应60分钟后生成莱克多巴胺溴乙酰-BSA共价键复合体，经G25 Sephadex脱盐、分装保存待用。1.2.2配对检测抗原
取 10 mg 卵清蛋白 0VA，溶解于 400 μ 含 0.1 mol/L EDTA 的 0.1 mol/L Na2CO3 溶液，充分溶解后，加入40 μ 10%的SDS混匀后煮沸5分钟变性，然后加入6 mg的DTT煮沸10分钟还原。冷却至室温，还原后的OVA经脱盐柱G25 Sephadex去掉多余的DTT后加入上述经HPLC纯化的莱克多巴胺溴乙酰酯200 μ L，用0.1 mol/L Na2CO3调ρΗ=8.5，室温避光反应60分钟后，生成莱克多巴胺溴乙酰-OV共价键复合体，经G25 S印hadex脱盐后得到的为配对检测抗原。1.3莱克多巴胺多克隆抗血清制备
用新西兰大白兔为免疫动物，疫苗浓度为I mg/mL，首次免疫用0.5 mL疫苗加0.5 mLPBS加I mL完全佐剂混匀多点注射，加强免疫用0.25 mL疫苗加0.75 mLPBS加I mL不完全佐剂混匀分2点注射，首次免疫后，每间隔2周加强免疫一次，35-40天采集0.5 mL血清检测滴度，用配对检测抗原包被做血清的间接ELISA检测，血清滴度达到1:6400后进行大量血清制备。
权利要求
1.一种微型高效莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于: 1)将经免疫亲和纯化的莱克多巴胺特异性多克隆抗体和过碘酸活化的琼脂糖混匀，在摇床上室温反应30分钟，然后在4°C冰箱静置30分钟后加入硼氢化钠还原，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液清洗填料，10倍填料体积/次，洗4次，滴干磷酸缓冲液后加入等体积甘油，混匀，得到莱克多巴胺免疫亲和填料； 2)在特制的塑料柱内下端装上过滤膜，将莱克多巴胺免疫亲和填料装入柱中，25μ L/柱，填料上层盖上过滤膜，即得所述的莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱。
2.根据权利要求1所述的方法制备的莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱，包括偶联有免疫亲和纯化的莱克多巴胺特异性多克隆抗体的琼脂糖填料及装载该填料的特制塑料柱。
3.根据权利要求1所述的莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于:所述的免疫亲和纯化的莱克多巴胺特异性多克隆抗体是用莱克多巴胺与溴乙酰氯反应得到衍生物莱克多巴胺溴乙酰酯溶液，用反向高效液相色谱HPLC纯化该溶液得到纯化后的莱克多巴胺溴乙酰酯，将纯化后的莱克多巴胺溴乙酰酯与载体蛋白偶联，得到的偶联物作为免疫原免疫动物，得到抗血清，同时用该纯化后的莱克多巴胺溴乙酰酯与经活化的琼脂糖反应制备纯化抗体用的免疫亲和柱，用该亲和柱一步提取抗血清得到莱克多巴胺特异性多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于:所述的莱克多巴胺溴乙酰酯是将莱克多巴胺标准品在三乙胺催化下与溴乙酰氯反应得到衍生物莱克多巴胺溴乙酰酯溶液。
5.将此莱克多巴胺溴乙酰氯酯溶液用制备型高效液相色谱仪反向柱色谱分离纯化出相对于莱克多巴胺标准品峰后移，且具有莱克多巴胺紫外光吸收光谱特征的单一主峰组分，收集该主峰组分得到纯化的莱克多巴胺溴乙酰酯。
6.根据权利要求3所述的莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于:所述的莱克多巴胺溴乙酰酯是将莱克多巴胺标准品在三乙胺催化下与溴乙酰氯反应得到衍生物莱克多巴胺溴乙酰酯溶液。
7.将此莱克多巴胺溴乙酰氯酯溶液用制备型高效液相色谱仪反向柱色谱分离纯化出相对于莱克多巴胺标准品峰后移，且具有莱克多巴胺紫外光吸收光谱特征的单一主峰组分，收集该主峰组分得到纯化的莱克多巴胺溴乙酰酯。
8.根据权利要求3所述的莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于:所述的用纯化后的莱克多巴胺溴乙酰酯与经活化的琼脂糖反应制备纯化抗体用的免疫亲和柱，是将经活化的琼脂糖与赖氨酸反应得到氨基化的琼脂糖，再将氨基化的琼脂糖与NHS-碘乙酸反应后，再用DTT还原，得到巯基化的琼脂糖，将巯基化的琼脂糖和莱克多巴胺溴乙酰酯快速混匀，室温反应60分钟，得到化学共价键复合体莱克多巴胺溴乙酰-琼脂糖填料，将填料装柱，洗去多余的DTT，得到提纯莱克多巴胺特异性抗体用的免疫亲和柱。
9.根据权利要求1或2所述的莱克多巴胺免疫亲和纯化富集柱和莱克多巴胺胶体金试纸条联用。
全文摘要
本发明提供了一种高效、准确富集莱克多巴胺的免疫亲和纯化富集柱及其制备方法和用途，本发明所提供的免疫亲和纯化富集柱包括偶联有莱克多巴胺特异性抗体的活化琼脂糖填料和装载该亲和填料的塑料柱。所述的亲和填料偶联的莱克多巴胺特异性抗体是用免疫亲和法提取得到，所述的免疫亲和纯化富集柱是将免疫亲和填料装载入特制的塑料柱得到。该免疫亲和纯化富集柱装载填料体积小、富集莱克多巴胺能力强，与色谱法、胶体金试纸条联合使用，可高效、准确检测莱克多巴胺的含量。
文档编号B01D15/22GK103100237SQ20121058931
公开日2013年5月15日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者谢体三, 李军, 宁欢欢, 潘丽金, 叶云峰, 韦良云, 萧浩 申请人:南宁市蓝光生物技术有限公司, 广西壮族自治区兽药监察所