用于澄清乳剂的试剂及澄清的方法

用于澄清乳剂的试剂及澄清的方法
【专利摘要】一种用于澄清乳剂的，包含盐和第一表面活性剂以及第二表面活性剂的新型试剂被用于澄清乳剂的方法中，所述乳剂可以包含待测的无机颗粒、有机颗粒或生物颗粒。所述试剂可以被证明为用于原位配制所述试剂的试剂盒。
【专利说明】用于澄清乳剂的试剂及澄清的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于澄清水包油/脂（0/W)型乳剂的试剂以及一种澄清所述乳剂 的方法，在所述方法中使用所述试剂，本发明还涉及一种用于原位配制所述试剂的包含所 述试剂的组分的试剂盒。

【背景技术】
[0002] 为了分析的目的，将0/W型乳剂澄清至它们呈透明液体的程度是尤为重要的。例 如，乳剂中的固体不溶颗粒，如果存在的话，只能艰难地被测定。如果乳剂没有被澄清至少 达到其呈半透明的程度，通过如光学方法计算乳剂中的固体不溶颗粒的数量是不可能的。
[0003] 乳剂中的生物污染物的定量是特别重要的，这是因为当由于细菌、酵母或藻类的 污染超过一定界限值时，在它们被利用的所有领域中的，尤其在食品、饮料以及医疗保健和 /或化妆产品中的乳剂会变得无法使用和/或存在健康风险。
[0004] 关于测定乳剂中的活的微生物，非常需要提供一种试剂和方法，所述试剂和方法 能够在尽可能短的时间内和在尽可能低的温度下，将乳剂澄清为完全透明的液体，以便允 许例如通过光学的方法快速并准确的直接定量测定生物体。如果对乳剂的澄清不彻底，例 如，由于所剩的类似颗粒的团聚体，计数会不准确，并且，如果温度过高和处理时间过长，一 方面，微生物会被破坏，或者，另一方面，微生物会增殖，二者都会导致错误的测试结果。
[0005] 特别是关于属于水包脂型乳剂的牛奶，现有技术中描述了多种目的在于澄清牛 奶以使其成为透明液体的方法（见如US 3679365 A、EP 0246987 B1、DE 0S17089 A1、DE 4017398 A1和EP 0573054;所有这些文件的全部公开内容通过引用并入本说明书中）。然 而，这些方法中没有一种方法在常规使用的情况下证明是令人满意的。
[0006] 本发明的目的是寻找一种用于将乳剂变成透明液体的更加令人满意的解决方案。


【发明内容】

[0007] 在第一方面，本发明涉及一种用于澄清水包油/脂型乳剂（也被叫做0/W型乳剂） 的试剂，所述试剂包含水溶液，所述水溶液含有一种或多种具有至少约lmol/L的水溶度的 盐、一种或多种具有约8. 0至约13. 0的HBL值（亲水亲油平衡值）和约0°C至约45°C的浊 点的第一非离子型表面活性剂、以及一种或多种具有约13. 1至约16. 9的HBL值和约59°C 至约100°C的浊点的第二非离子型表面活性剂，其中，所述试剂具有等于或小于约57°C的 池点。
[0008] 在另一方面，本发明针对所述试剂的用于澄清0/W型乳剂的用途。
[0009] 在又一方面，本发明涉及一种澄清0/W型乳剂的方法，其中，根据本发明的试剂以 预定的量被加入所述乳剂中，所述试剂与所述乳剂的混合物被保持在室温下、或被加热至 高达约所述混合物的沸点的高温，并且在所述温度下保持足够长的时间，直至所述乳剂已 澄清并且变成透明液体。
[0010] 本发明的另外一个方面涉及用于原位配制本发明的试剂的试剂盒，在至少两个单 独的容器中所述试剂盒包括所述一种或多种盐、所述一种或多种第一表面活性剂、所述一 种或多种第二表面活性剂、以及可选地包括所述缓冲剂。

【专利附图】

【附图说明】
[0011] 图1为示出根据本发明的方法的实施方式对生奶样品中的细菌数量的测定与根 据BactoCountk方法（Bentley Instruments，本特利仪器公司）对生奶样品中的细菌数 量的测定之间的相关性的图表。
[0012] 图2为示出根据本发明的方法的另一个实施方式对生奶样品中的体细胞数量的 测定与根据BactoCount?:方法（Bentley Instruments)对生奶样品中的体细胞数量的测 定之间的相关性的图表。
[0013] 图3为示出根据本发明的方法的又一个实施方式对生奶样品中的体细胞数量的 测定与根据BactoCount:'方法（Bentley Instruments)对生奶样品中的体细胞数量的测 定之间的相关性的图表。

【具体实施方式】
[0014] 本发明的第一方面涉及一种用于澄清0/W型乳剂的试剂。
[0015] 0/W型乳剂为本领域技术人员所熟知并被用在各种各样的不同的应用领域中。示 例有工艺乳剂（如冷却润滑剂）、家用乳剂（如餐具洗涤剂）、用于化妆品、医疗保健产品和 药剂制品的乳剂（如面霜、身体乳液和各种药膏）、以及食品和饮料乳剂（如冰淇淋、酸奶、 奶油、牛奶和其他乳制品）。
[0016] 在许多情况下，特别地出于分析的目的，借助于合适的试剂将该乳剂澄清为至少 半透明的或者完全清澈透明的像水一样的液体是值得期望的。所述试剂需要满足两个重要 的要求：在相对低的温度下澄清0/W型乳剂，并且在相对短的时间内达到澄清的目的。此 夕卜，所述试剂应该与乳剂中可能的微生物相容，也就是，既不造成对微生物的破坏也不导致 微生物的增殖。
[0017] 出人意料地发现，如上文的
【发明内容】
中所述的包含一种或多种盐以及两种不同种 类的表面活性剂或非离子型表面活性剂的混合物的试剂满足这些要求。
[0018] 本发明的试剂中包含的盐必须具有至少lmol/1的高的水溶度。高的盐浓度可以 抑制微生物的细胞溶解，否则试剂中的非离子型表面活性剂可以诱导微生物的细胞溶解。
[0019] 如果将被本发明的试剂处理的乳剂中的微生物将被检测，有时优选地，试剂中的 盐不包含高于生理浓度、S卩154mmol/l和4mmol/l的Na+离子和K+离子，这是因为它们有 时会促进微生物的细胞溶解。
[0020] 由于铵阳离子通常提供非常好的水溶度并且在生理上相容，所以其是所述试剂的 盐中优选的阳离子。
[0021] 同样为了所述试剂的盐的良好的水溶度，所述试剂的盐的阴离子优选地选自氯离 子、氟离子、硝酸根、甲酸根和醋酸根。
[0022] 氯化铵和甲酸铵为特别优选的盐，无论单独使用或作为混合物使用。
[0023] 所述试剂中的一种或多种盐的总浓度通常约0· 5mol/l至约12mol/l，更多时候是 约1. 5mol/l至约5mol/l，特别地优选约1. 5mol/l至约2. 5mol/l。
[0024] -种或多种第一非离子型表面活性剂具有或者各自具有约8. 0至约13. 0的HLB 值和约0°C至约45°C的浊点，然而，一种或多种第二非离子型表面活性剂具有或者各自具 有约13. 1至约16. 9的HLB值和约59°C至约100°C的浊点。（本文的HLB值是根据Griffin 对于非离子型表面活性剂所熟知的那些）。
[0025] 非离子型表面活性剂为本领域的技术人员所熟知的（见如Jean-Louis Salager， SURFACTANTS，Types and Uses，FIRP B00LKET#E300-A(2002)，第 4章-非离子型表面活性 齐U，通过引用的方式并入本文献中）。非离子型表面活性剂通常选自乙氧基直链醇（也为指 定的聚氧乙烯烷基醚、脂肪醇乙氧基化物或CnEm)、乙氧基烷基酚、脂肪酸酯、胺和酰胺衍生 物、烷基聚葡萄糖苷、氧化乙烯/环氧丙烯共聚物、多元醇和乙氧基多元醇、硫醇及衍生物。
[0026] 本领域技术人员熟知非离子型表面活性剂溶解油或脂的能力随HLB值的增加而 提高。因此，对于澄清具有高的油或脂含量的0/W型乳剂，表面活性剂具有高HLB值是必要 的。另一方面，高的HLB值通常伴随着高的浊点温度（尽管该温度也取决于其他参数，见下 文）。这意味着包含乳剂和具有高的浊点温度的表面活性剂的混合物必须被加热至近似浊 点的温度，以便引发混合物的澄清，当微生物需要被测定时，这是不合需要的，这是因为恰 好在更高的温度下在非离子表面活性剂中，微生物遭受细胞溶解。一经冷却至浊点以下，非 离子型表面活性剂形成胶束。这些胶束比光波长小得多，因此溶液变得透明，油/脂的溶解 度显著增加。
[0027] 本发明的试剂被要求具有57°C的最高浊点，这是与活的微生物相容的上限值。更 加优选地，浊点不超过53°C。单一的具有13. 1或者更大的高HLB值的表面活性剂不具有如 此低的浊点。因此，具有较低浊点的第二表面活性剂与第一表面活性剂联合使用。这不仅 降低了浊点，而且降低了 HLB，即混合物的油/脂溶解性能。
[0028] 两种表面活性剂的混合物产生的HLB值能够容易地被计算出（（混合物中表面活 性剂1的质量％ ) X表面活性剂1的HLB+(混合物中表面活性剂2的质量％ ) X表面活性 剂2的HLB =混合物的HLB)。但是，这样一种对混合物的浊点的简单计算是不可能的。
[0029] 如上所述，浊点（CP)取决于HLB，但也是表面活性剂和盐的浓度的函数。超过一 定临界浓度，CP随着盐浓度增加而单调递减。此外，盐的加入将会降低澄清试剂的有效HLB 值的影响也已经被知道，所以，需要找到合适的平衡。
[0030] 因此，为了选择用在混合物中的表面活性剂和一种或多种盐，总是需要一定数量 的实验，以找到期望的HLB和给定的浊点之间（或者期望的浊点和给定的HLB之间）的最 佳折中方案。
[0031] 然而，一般情况下，当乳剂中的油/脂的比例低时，如1重量％左右，约13. 0至约 14的相对低的HLB值是足够的。在这种情况下，一种或多种第一表面活性剂可以占有表 面活性剂混合物的主要量，一种或多种第二表面活性剂只占有表面活性剂混合物的较小的 量。对于具有高脂肪含量的乳剂，如脂肪含量大约3. 5重量％至大约4重量％的生奶或者 脂肪含量高达50%的奶油，更高的HLB (如约14. 5至约15)被需要，以便达到澄清至清澈溶 液的目的。在这种情况下，混合物中的一种或多种第二表面活性剂的量将会显著地大于一 种或多种第一表面活性剂的量。
[0032] 具有约8. 0至约13. 0的HLB值和约0°C至约45°C的浊点的第一表面活性剂的 示例是：TritorT X_114(Dow Chemical Company,陶氏化学公司）；具有7个至8个氧乙 烯单元的聚氧乙烯单辛基苯基醚的专用混合物（浊点（CP) :23°C，HLB值：12. 4)，特别优 选UnitolHydol-6(C8E3;CP:38°C至42°C，HLB值：11.5) ;以及如下所述的专用表面活 性剂：Lutens〇lU TDA 6 (HLB 值：11· 0, CP :41? )、Triton?: X45 (HLB 值：9· 6, CP :38°C )、 PLURAFAC" LF-400 (HLB 值：9· 0, CP :35°C )、PLURAFAC K· SL_42 (HLB 值：13. 0, CP : 42。〇、1〇丑卩八1^)〇八620〇11^值：12.0，〇？：22。〇、和1〇[1)八1：! <00-610011^值：12.6，0？： 26。。）。
[0033] 具有约13. 1至约16. 9的HLB值和约59°C至约100°C的浊点的第二表面活性剂 的示例是：Walloxen ID 110(Wall Chemie GmbH,肯彭，德国）；聚氧乙烯异癸基醚（"异癸 醇-11-聚乙二醇醚"）（HLB 值 15. 1，CP :62°C至 66°C )，特别优选LanspecK EMP906C、专用 的C13醇乙氧基化物（HLB值：13· 5, CP :68°C至72°C )和Tergito丨X 15-S-9(陶氏化学公 司）；专用的仲醇乙氧基化物（HLB值13. 3, CP :60°C );以及如下所述的专用表面活性剂： Triton'1 X 1〇〇(HLB 值：13· 5, CP :65°C )、Brij? 35(HLB 值：16· 9, CP>100°C )、Tween?: 20 (HLB 值：16. 7, CP :95°C )、Tweeil? 80 (HLB 值：15. 0, CP :60°C )、以及Nonidet? P4〇 (HLB 值：13. 5, CP :63°C至 67°C )。
[0034] 如上文所不，一种或多种第一表面活性剂与一种或多种第二表面活性剂的重量比 可以有很大变化，如从约1:6变化至约6:1，更优选地从约1:3变化至约3:1，尤其优选地从 约1:2变化至约2:1。所述重量比主要取决于乳剂中的脂肪量，但也取决于分别影响乳剂的 稳定性和溶解的试剂中的一种或多种盐的量和乳剂中的一种或多种盐的量，以及取决于其 他可能干扰澄清的非脂肪或非油组分。
[0035] 盐和表面活性剂的总重的比值也可以有很大变化，如从每100g总表面活性剂约 0. 5mol -种或多种盐变化至每100g总表面活性剂约2mol -种或多种盐。
[0036] 试剂中一种或多种第一表面活性剂和一种或多种第二表面活性剂的总浓度可以 改变，如从约l〇〇g/l变化至约500g/l，更多时候从约160g/l变化至约380g/l，特别地从约 175g/l变化至约275g/l。一种或多种第一表面活性剂的总浓度可以是，如约15g/l或约 25g/l或约50g/l或约75g/l至约120g/l或约180g/l或约300g/l或约430g/l。一种或 多种第二表面活性剂的总浓度可以是在相同范围内。
[0037] 除了盐之外，本发明的试剂可选地可包含缓冲剂，或者，如果缓冲剂只包含盐，则 作为本发明的试剂的盐。只包含盐的合适的缓冲剂是，例如Bentley Instruments的IBCM BactoKit 500组分1，包括硼酸钠十水合物、碳酸钠和EDTA二水合物，所述缓冲剂以约1重 量％至约5重量％的比例包含在所述试剂中。
[0038] 此外，该试剂可以包括一种或多种荧光染料。
[0039] 本发明的试剂也可以含有少量的非必需的组分，例如少量的有机溶剂，如醇、醚、 酯、酮和醛，或者染色剂。
[0040] 因此，所述试剂可以包含或者可以基本上包含上述一种或多种盐和第一非离子型 表面活性剂和第二非离子型表面活性剂，以及可选地包含缓冲剂和一种或多种荧光染料。
[0041] 根据本发明的特别优选的试剂包括约130g/l至约150g/l的异癸醇-11-聚乙二 醇醚（Walloxen ID 110/80)、约 65g/l 至约 75g/l 的Triton" X_114、约 110g/l 至约 130g/ 1的甲酸铵、和可选择地包括荧光染料，并且具有约51°C至约53°C的浊点。
[0042] 本发明的试剂的配制是简单的，但是，下列顺序必须被遵守：首先，盐和可能的缓 冲盐被加至去离子水或蒸馏水中，如果必要，微微加热。在该温度下或冷却到室温后，加入 一种或多种第二表面活性剂，此后，加入一种或多种第一表面活性剂。如果当表面活性剂被 加入时，混合物仍然是温热的，则混合物会变得浑浊，但是一经冷却至室温，该混合物将会 转变为可供使用的清液。
[0043] 上述试剂被用来将0/W型乳剂澄清为半透明溶液或透明溶液。
[0044] 在本发明的方法中，上述试剂按照预定量被加入至乳剂中，届时获得的混合物或 者保持在室温下，或者保持在高达混合物的沸点的高温下，直到乳剂已转变为半透明的液 体或透明的液体。
[0045] 如上所述，本发明的方法能够被应用于任何乳剂，例如工艺乳剂（如冷却润滑 剂）、家用乳剂（如餐具洗涤剂）、用于化妆品、医疗保健产品和药剂制品的乳剂（如面霜、 身体乳液和各种药膏）、以及食品和饮料乳剂（如其他乳制品）。
[0046] 在澄清试剂被加入前，乳剂可以被稀释，例如，如果油/脂的浓度或者乳剂中的其 他组分的浓度太高，会干扰澄清和/或干扰对所需参数（如乳液中的颗粒/微生物的数量） 的测试。
[0047] 将乳剂澄清至半透明液体或透明液体所必需的试剂的量可能变化很大，并且取决 于多种参数，比如油或脂的种类、油或脂的浓度、电解质的浓度、其它中性物质的浓度等。该 试剂的量通常是由预备的系列实验预先确定，其中，首先确立必需量的粗略的范围，然后， 在较小的区间内测试用量。本领域技术人员熟悉此种常规测试。如果涉及微生物的检测， 所使用的浓度应该尽可能低，以便确保微生物的生存能力或者至少微生物的完整性。
[0048] 存在乳剂可在室温（约25°C )下被本发明的试剂澄清的情况，当微生物将被检测 时，这种情况是非常令人满意的，这是因为，在这种情况下，微生物的生存能力或至少完整 性被确保。然而，为了澄清，通常乳剂和澄清试剂的混合物不得不被加热。如果澄清试剂不 含有任何热敏性组分，则加热温度可能要高达乳剂的沸点。所需的温度高度取决于乳剂的 特定性质，如在上面所讨论的试剂的量，通常需要预备的常规实验来寻找对于特定乳剂的 最佳温度和反应时间的周期。不管怎样，当混合物已完全澄清并且已经变成半透明溶液或 者透明溶液时，反应完成。
[0049] 待被澄清的乳剂可以包含或不包含无机颗粒、有机颗粒或者生物颗粒，在澄清后 所述颗粒不溶于水介质。
[0050] 对不含有任何颗粒的澄清乳剂，可被测量的性质为，例如，通过紫外/可见（UV/ Vi s)光谱测量任何溶解的有色化合物的颜色。
[0051] 如果有颗粒存在，颗粒的特性，例如颗粒的浓度，可以更容易地被测量或者可只能 在乳剂澄清之后通过技术人员所用的用于测量存在于介质中的颗粒的任何分析方法来测 量，所述介质为溶剂或普通的清液。
[0052] 包含生物颗粒（即微生物（细菌、酵母、藻类）以及可能的体细胞的乳剂，对于本 发明具有特别的重要性。微生物和可能的体细胞可以以非常不同的浓度存在于各种乳剂 中，例如从几乎为零（在新鲜的已灭菌的产品中）或每毫升1000个生物颗粒至大约每毫升 2千万个生物颗粒（例如在生奶中）。由于微生物会使所有类型的乳剂腐坏，最重要的是会 使食物和饮料乳剂腐坏，故微生物的定量和定性测定是最引人注意的。
[0053] 出人意料地发现，即使为了彻底澄清乳剂，需要将乳剂和试剂的混合物加热至约 56. 5°C，或优选地约45°C直至约55°C，加热长达约20分钟的时间，例如约12分钟，优选地 长达约10分钟，更加优选地长达约2分钟，本发明的方法在包含待测的微生物的乳剂中是 有用的，正如例如用于生奶的情形。
[0054] 可以预料到，小部分的微生物在这些情况下可能会遭受细胞溶解。然而，如果在测 量根据本发明的方法澄清的乳剂中的微生物的数量之后，在关注的浓度范围内，根据本发 明的方法测得的结果与已知用于得到正确数量的方法测得的结果存在线性相关，则该方法 是有效的，并且可以被用于正确测定细胞的数量。出乎意料地，当生奶样品中的微生物数量 被检测时，对于本发明的方法，确实找到这种线性相关。
[0055] 图1示出通过自动的BactoCountΜ义器（Bentley Instruments)所实施的方法 (经国际认证的用于快速测定生奶中的全部细菌的方法）对生奶样品进行测试的微生物数 量（单位：ibc(单个细菌计数）/μ1)与通过根据本发明的方法（在本发明的方法中，生奶 样品按照实施方式2中所描述的被澄清，然后通过流式细胞仪对微生物进行计数）对生奶 样品进行测试的微生物数量之间的相关性。所述相关性非常好，其意味着，由于细胞溶解， 微生物（主要是细菌）颗粒（即，细胞）的任何损失与样品中的微生物数量成正比，并且可 通过校正方法来给予考虑。
[0056] 图2为示出根据本发明的方法，如实施方式5所述的对生奶样品中的体细胞数量 的测定与根則BactoCount 1'方法（Bentley Instruments)对生奶样品中的体细胞数量的 测定之间的相关性的图表。所述相关性非常好。
[0057] 图3为示出根据本发明的方法，如实施方式6所述的对生奶样品中的体细胞数量 的测定与根据Bact〇C〇unt k方法（Bentley Instruments)对生奶样品中的体细胞数量的 测定之间的相关性的图表。所述相关性非常好。
[0058] 对于牛奶或其他乳制品，本发明的试剂优选具有等于或小于55°C的浊点，优选地 浊点约51°C至约53°C，并且优选地，该试剂的第一非离子型表面活性剂为Tritoi? X-114， 第二非离子型表面活性剂为异癸醇-11-聚乙二醇醚（Walloxen ID 110)，盐为甲酸铵。
[0059] 如上所述，缓冲盐可以被包含在所述试剂中。
[0060] 如上所述，为了彻底澄清，被加入至乳剂样品中的试剂的量通常必须通过常规的 系列实验确立。通过该实验发现，加入至lml生奶中的试剂的量有利地包含约100mg至约 320mg，特别优选地约190mg至约230mg的一种或多种第一表面活性剂（优选为Trit〇nK) X-114)的总量；约280mg至约530mg，特别优选地约400mg至约450mg的一种或多种第二表 面活性剂（优选为异癸醇-11-聚乙二醇醚）的总量；和约lmmol至约15mmol，特别优选地 约5. 5mmol至约6. 5mmol的所述一种或多种盐（优选为甲酸铵）的总摩尔量；不包括缓冲 盐。所述量可以被包含在3ml的试剂中。
[0061] 此外，乳剂样品和试剂的混合物的pH应当通常被控制在约中性至约9. 5的pH范 围内。可以在所述试剂被加入前、被加入时或者被加入后调节pH值。pH的调节可通过选择 一种或多种合适的盐（如酸性的或碱性的）和所述盐在试剂中的浓度，通过向乳剂中加入 合适的缓冲剂，和/或通过向试剂中加入合适的缓冲剂来完成。用于上述pH范围的合适的 缓冲剂为本领域技术人员所熟知。
[0062] 当检测乳剂中的，尤其是牛奶和乳制品中的微生物时，可以在试剂被加入前、被加 入时或者被加入后，加入一种或多种蛋白水解酶，以便破坏较大的蛋白质团聚体，所述蛋白 质团聚体可能干扰测试。蛋白水解酶和它们的使用方法为本领域的技术人员所熟知。
[0063] 此外，如果微生物是通过需要荧光染色的光学方法来检测，一种或多种荧光染料 可以在所述试剂被加入前、被加入时或者被加入后，被加入至乳剂中。合适的荧光染料和它 们的使用为本领域技术人员所熟知。
[0064] 如上所述，在澄清的乳剂中的不溶的无机颗粒、有机颗粒或生物颗粒的性质和/ 或数量可以通过合适的方法，包括化学方法来测定。优选的用于定性和定量检测颗粒的方 法是光学方法、物理方法和生物化学方法。这些方法包括借助于ICP (电感耦合等离子体）、 流动注射分析仪、流式细胞仪、光谱测定法（可见光、红外光、紫外光（UV)、荧光）、CCD(电 感耦合器件）摄像机、光学显微学以及荧光显微学、和PCR(聚合酶链式反应）的分析。这 些方法为本领域技术人员所熟知。
[0065] 一种用于原位配制本发明试剂的试剂盒，在至少两个单独的容器中包含一种或多 种盐、一种或多种第一表面活性剂、一种或多种第二表面活性剂以及可选地包含缓冲盐。优 选地，每种试剂组分被包含在单独的容器中。该试剂盒也可以包括用于配制所述试剂和用 于所述试剂在澄清乳剂（如牛奶或者其他乳制品）的特定方法中的使用的说明。
[0066] 下列实施例说明本发明，但不具有限制本发明范围的意图。
[0067] 实施例
[0068] 实施您L1-配制用于澄清生奶乳剂的试剂
[0069] 10g用于分析的甲酸铵（Aldrich)在室温搅拌下溶解于60ml专用（in-house)的 去离子无菌水。加入12 8\\^丨丨(《6111<)1〇11〇(80%的水溶液），此后加入68 1'1^〇11父-114。 该溶液在室温下是清澈的。
[0070] 浊点通过实验被测定。该试剂被加热直至它变成浑浊的。然后该试剂被冷却直至 该试剂重新变得透明。该试剂从透明相变为混浊相的温度被记录并且被定义为浊点（CP)。
[0071] 所述浊点被发现为52°C至53°C。
[0072] HLB值被计算得到约为15。
[0073] 实施例2-生奶样品的澄清和细菌计数
[0074] 1ml生奶样品和3ml在实施例1配制中的试剂被混合，2. 0ml Bentley IBCM Bactokit 500试剂（缓冲剂+酶+荧光染料）随后被加入至lml的澄清混合物中。所得混 合物在50°C ±5°C下培养10分钟，然后被超声处理16秒。
[0075] 细胞（主要为细菌）的数量通过流式细胞仪被测定，并且与通过自动的 BactoCountM义器（Bentley Instruments)对另一份同样牛奶样品所测定的结果对比。结 果于图1示出。
[0076] 实施例3-生奶样品的澄清和细菌计数以及通过聚合酶链式反应（PCR)的鉴定
[0077] 1ml生奶样品按照实施例2所述的被澄清，但是，未加入蛋白水解试剂。
[0078] 然后，经澄清的牛奶的全部DNA被提取，并且进行PCR细菌计数和通过标准方案 (Thermo Scientific PathoProof^ Mastitis Complete-12 PCR 试验）的鉴定。
[0079] 通过这种方法彻底澄清牛奶具有重大的有益效果，因为通过这种方法，在离心分 离后没有牛奶凝块和脂必须被去除。所述样品的过滤也更加容易。
[0080] 实施例4-配制用于澄清生奶乳剂的试剂
[0081] l〇g用于分析的甲酸铵（Aldrich)在室温搅拌下溶解于60mL专用的去离子无菌 水。加入12g WaH〇xen:Ki ID 110(80%的水溶液），此后加入6g Triton X-114,最后加入 10 μ g菲啶盐荧光染料。该溶液在室温下是清澈的。pH值约7. 0。
[0082] 实施例5-生奶样品的澄清和体细胞的快速定量
[0083] 1ml生奶样品与1ml实施例4的试剂和1ml染料溶液（Bentley IBCM BactoKit 组分3)混合，于室温培养10秒钟后，体细胞的数量通过流式细胞仪被测定，并且与通过 BactoCount"方法（Bentley Instruments)对另一份同样牛奶样品所测定的结果对比。结 果在图2示出。
[0084] 实施例6-生奶样品的澄清和体细胞的快速定量
[0085] 1ml生奶样品和3ml实施例4的试剂混合，于54°C培养3分钟直至彻底澄清（透 明）。
[0086] 1ml上述澄清的混合物和2ml染料溶液（Bentley IBCM BactoKit组分3)的50% 的水溶液于室温培养10秒钟。然后体细胞的数量通过流式细胞仪被测定，并且与通过 Bact〇C〇untK方法Oentley Instruments)对另一份相同牛奶样品所测定的结果对比。结 果于图3不出。
[0087] 实施例7-配制用于澄清冷却润滑剂的试剂
[0088] 9. 8g氯化铵被加入至45ml蒸馏水中，微热至40°C。然后加入2. 3g Lanspec? EMP906,此后加入5g Triton X-114。冷却至室温后得到澄清溶液。
[0089] 实施例8-含有微生物的冷却润滑剂乳剂的澄清
[0090] 以1:1的体积比，将实施例7的试剂加入至受微生物污染的冷却润滑剂乳剂样品 中。加入该试剂后，所述乳剂立即转变为澄清的黄色液体。
[0091] 通过流式细胞仪进行微生物计数。
【权利要求】
1. 一种用于澄清水包油/脂（0/W)型乳剂的试剂，所述试剂包含水溶液，所述水溶液 含有一种或多种具有至少约lmol/1的水溶度的盐、一种或多种具有约8.O至约13.O的HBL 值和约(TC至约45°C的浊点的第一非离子型表面活性剂、以及一种或多种具有约13. 1至约 16. 9的HBL值和约59°C至约100°C的浊点的第二非离子型表面活性剂，其中，所述试剂具有 等于或小于约57°C的浊点。
2. 根据权利要求1所述的试剂，其中，所述的一种或多种盐既不包含总量大于 154mmol/l的Na+,也不包含总量大于4mmol/l的K+。
3. 根据权利要求1或2所述的试剂，其中，所述一种或多种盐的量与所述一种或多种 表面活性剂的量的配给为,每IOOg总的所述一种或多种表面活性剂,约0. 25mol至约2mol 所述一种或多种盐，在所述试剂中所述一种或多种盐的浓度是约〇. 5mol/l至约12mol/l。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的试剂，其中，所述一种或多种盐的阳离子是 NH:。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的试剂，其中，所述一种或多种盐的一种或多种阴 离子选自氯离子、氟离子、硝酸根、甲酸根和醋酸根。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的试剂，其中，所述一种或多种盐选自氯化铵和甲 酸铵。
7. 根据权利要求1所述的试剂，其中，所述盐包含硼酸钠十水合物、碳酸钠和EDTA二水 合物的缓冲混合物。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的试剂，其中，所述一种或多种第一非离子型表面 活性剂与所述一种或多种第二非离子型表面活性剂的比值按重量计算为约6:1至约1:6， 优选地约1:3至约3:1，特别为约1:2至约2:1。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的试剂，其中，所述一种或多种第一表面活性剂选 自TritonKX-114。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的试剂，其中，所述一种或多种第二表面活性剂 选自异癸基-11-聚乙二醇醚（WalloxenID110)。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的试剂，其中，所述一种或多种第一表面活性剂 和所述一种或多种第二表面活性剂在所述水溶液中的总浓度是约l〇〇g/l至约500g/l。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的试剂的用于澄清0/W型乳剂的用途。
13. -种澄清0/W型乳剂的方法，其中，根据权利要求1至10中任一项所述的试剂以预 定的量被加入至所述乳剂中，然后所述试剂和所述乳剂的混合物被保持在室温下、或被加 热至高达约所述混合物的沸点的高温，并且在所述温度下保持足够长的时间，直至所述乳 剂已澄清且变成半透明液体或透明液体。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述乳剂包含无机颗粒、有机颗粒或生物颗 粒，所述颗粒不溶于所述透明液体。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中，加入根据权利要求2至8中任一项所述的试 齐U，所述颗粒为生物颗粒，并且其中，在所述方法中，不超过约56. 5 °C的温度。
16. 根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，所述乳剂选自工艺乳剂、家用乳 齐U、化妆品和/或医疗保健产品和/或药剂制品所用的乳剂、以及食品/饮料乳剂。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述乳剂为选自牛奶和乳制品的食品/饮料乳 剂。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述方法涉及范围从高于约37°C至约56. 5°C 的最高温度，经过约20分钟的最长时段。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中，所述方法涉及在约45°C至55°C的温度下，经过 约10分钟的最长时段的培养。
20. 根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中，为了获得半透明至透明的溶液， 所述试剂的HLB值为10或者更高，为了获得透明的溶液，所述试剂的HLB值为13或者更高。
21. 根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中，所述试剂的浊点等于或小于 55°C，优选地为约51°C至约53°C，所述第一非离子型表面活性剂为TritonX-114,所述第 二非离子型表面活性剂为异癸醇-11-聚乙二醇醚，所述盐为甲酸铵。
22. 根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中，被加入至Iml牛奶中的所述试 剂包含总量为约IOOmg至约320mg，特别优选地约190mg至约230mg的所述一种或多种第一 表面活性剂；总量为约280mg至约530mg，特别优选地约400mg至约450mg的所述一种或多 种第二表面活性剂；总摩尔量为约Immol至约15_〇1，特别优选地约5. 5mmol至约6. 5mmol 的所述一种或多种盐；不包括缓冲盐。
23. 根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中，在加入所述试剂之前、在加入所 述试剂同时或在加入所述试剂之后，所述牛奶或乳制品的PH被调节至pH为约7. 0至9. 5。
24. 根据权利要求15至23中任一项所述的方法，其中，在加入所述试剂之前、在加入 所述试剂同时或在加入所述试剂之后或在加入所述试剂期间，还加入一种或多种蛋白水解 酶。
25. 根据权利要求15至24中任一项所述的方法，其中，在加入所述试剂之前、在加入所 述试剂同时或在加入所述试剂之后或在加入所述试剂期间，还加入一种或多种荧光染料。
26. 根据权利要求15至25中任一项所述的方法，其中，超声处理被应用于所述乳剂或 所述乳剂与所述试剂的混合物。
27. 根据权利要求14至26中任一项所述的方法，其中，所述不溶的有机颗粒、有机颗粒 或生物颗粒的性质和/或数量通过光学方法或物理方法来测定。
28. 根据权利要求15至27中任一项所述的方法，其中，在所述乳剂澄清后，包含在所述 乳剂中的DNA被提取，并且进行聚合酶链式反应（PCR)。
29. -种用于原位配制根据权利要求1至11中任一项所述的并且如用于根据权利要 求20和21所述的方法中的试剂的试剂盒，在至少两个单独的容器中所述试剂盒包括所述 一种或多种盐、所述一种或多种第一表面活性剂、所述一种或多种第二表面活性剂、以及可 选择地包括所述缓冲盐。
30. 根据权利要求29所述的试剂盒，其中，每种试剂组分被包含在单独的容器中。
【文档编号】B01D17/04GK104272081SQ201280073031
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2012年5月8日 优先权日:2012年5月8日
【发明者】诺伯特·帕吾茨, 皮埃尔·布鲁汀 申请人:本特利仪器有限公司