一种制备纳米尖端移液管的装置及方法与流程

本发明涉及一种集微纳毛细管拉制、湿法刻蚀和电流检测于一体的制备纳米尖端移液管的方法及系统，属于纳米加工领域。

背景技术：

随着分析系统微型化、分析样品微量化在分析化学中的迅速发展，纳米尖端移液管逐渐进入研究人员的视野中，纳米尖端移液管的出现使研究人员对皮升甚至飞升体积液体的操控成为现实。同时纳米尖端移液管在生物领域也得到了重视，尤其是在显微操作技术中。显微操作技术现被广泛应用于实验生物学研究的多个重要领域，如细胞及染色体的显微分离、细胞核移植、胚胎显微操作、显微注射及显微受精等方面。在操作过程中，移液管尖端对细胞的损伤不可避免，尤其是体积较小的细胞，对移液管尖端的要求更高，损伤严重的细胞将会死亡。因此良好的移液管尖端不仅能够提高操作效率，而且能够减小对胚胎和细胞的损害，从而保证实验操作的顺利进行。由此可见，纳米尖端移液管的使用在生物分析领域具有非常重要的意义，而纳米尖端移液管购买或制作成本高、制作过程复杂、常规方法制作尖端尺寸较大等一直是亟待解决的问题。

制作纳米尖端移液管的原料一般是硼硅酸盐玻璃毛细管或熔融石英毛细管，根据不同的研究目的，毛细管的规格有很多，它们的外径、内径及壁厚有很大差别。常规制备纳米尖端移液管的方法的流程包括拉针、断针、磨针、拔尖。

首先，将毛细管置于拉针仪上，按照实验研究的需求，对拉针仪的参数进行设定，按照设定的参数将毛细管拉断，拉断的毛细管将出现尖端。由于制作原料毛细管的种类多样，一般情况下，会出现拉制出来的毛细管尖端内径封闭或尖端尺寸较长的问题，不能直接进行试验。因此，将拉制好的带尖端的毛细管固定于煅针仪上，在电热丝上做一玻璃珠，大小以刚盖住电热丝为宜，调节旋钮到所需温度，将拉好的玻璃管在所需内径处，与玻璃珠轻轻靠拢，此时轻踩脚控开关，使针与玻璃珠稳定地接触，待玻璃针有一个极小的摆动时，立即松开脚控开关，此时玻璃珠会突然冷却而收缩拉断玻璃针。随后将断好的带尖端的毛细管固定在磨针仪上，调节角度，先将转速调到0，将视野调清，把毛细管尖端下降至刚好接触磨石，调节转速，在显微镜下观察、磨针。将磨好的带尖端的毛细管固定在锻针仪上，在高倍镜下将尖端靠近加热过的铂金丝或玻璃球，当针尖微融时，迅速拉开，拔出尖端。

制作出来的尖端外径在纳米级别的毛细管就被称为纳米尖端移液管，这样制作的缺点在于：毛细管的尖端尺寸较大，无法得到较小或很小的尺寸；步骤相对复杂。在此基础上有研究人员为了得到较小尺寸的尖端，将拉制好的毛细管尖端，采用离子束轰击刻蚀的方法，能够得到较小尺寸通透性的尖端，但是该种方法成本较高，大部分实验室无法制作。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术提供一种集微纳毛细管拉制、湿法刻蚀和电流检测于一体的制备纳米尖端移液管的方法及系统，通过该系统，能够成功检测到氢氟酸将石英毛细管尖端由封闭刻蚀通的电流信号变化，在不同的电流值下终止氢氟酸刻蚀，从而可控制备纳米尖端移液管。

为了实现以上发明目的，本发明采用的技术方案如下。

一种集微纳毛细管拉制、湿法刻蚀和电流检测于一体的制备纳米尖端移液管的系统，其特征在于，包括独立的：毛细管通透性验证装置(图1)、毛细管拉制系统(图2)、毛细管刻蚀及电流回路检测系统(图3)。

毛细管通透性验证装置(图1)包括高压气瓶(1)、小钢瓶(2)、待拉制毛细管(3)、离心管(4)；在该装置中小钢瓶(2)中为空，离心管(4)中装有超纯水，将待拉制毛细管(3)一端在小钢瓶(2)中，另一端伸入到在离心管(4)的超纯水中，高压气瓶(1)与钢瓶(2)连通，可向小钢瓶(2)中通入氮气，观察待拉制毛细管(3)在离心管(4)中有明显气泡冒出，证明该待拉制毛细管(3)良好，可用于后面的拉制；

毛细管拉制系统(图2)包括高压气瓶(1)、小钢瓶(2)、待拉制毛细管(3)、小离心管(5)、毛细管拉制器(6)；小离心管(5)中放有一半体积的盐酸(HCl)溶液，将小离心管(5)放入小钢瓶(2)中，待拉制毛细管(3)一端浸在小钢瓶(2)中的小离心管(5)的盐酸溶液中，另一端固定在毛细管拉制器(6)上，高压气瓶(1)与小离心管(5)连通，用高压气瓶(1)向小钢瓶(2)的小离心管(5)中通入氮气，通一段时间的氮气，当待拉制毛细管(3)中充满盐酸溶液后，为避免在拉制过程中盐酸挥发及在内径中形成气柱，在连续通氮气的条件下，将待拉制毛细管(3)拉断，得到带尖端毛细管，用于后续的湿法刻蚀；

毛细管刻蚀及电流回路检测系统(图3)包括高压输液泵(7)、二通(8)、Peek管(9)、四通(10)、第一Pt电极(11)、第二Pt电极(12)、离心管(13)、毛细管(14)、数字源表(15)、数字源表输出端线(16)、数字源表输入端线(17)、带尖端毛细管(A)；高压输液泵(7)的流动相为KCl溶液，高压输液泵(7)依次经由二通(8)、Peek管与四通(10)的一个端口连接，二通(8)与四通(10)之间连有一根Peek管(9)因Peek管(9)是绝缘的，主要用于隔断二通(8)前段部分的金属管对检测电流的干扰；毛细管(14)安装到四通(10)的另一个端口，此端口位置与Peek管相对，毛细管(14)主要用于在给定的流速下，使泵内的压力平衡稳定；第一Pt电极(11)固定在四通(10)的第三个端口内，可与流动相中的KCl溶液相接触；四通(10)的第四个端口通过带尖端毛细管(A)与离心管(13)连接，离心管(13)中是含有HF和KCl的溶液，HF可以刻蚀毛细管尖端，KCl可以起导电作用；离心管(13)同时还经由第二Pt电极(12)与数字源表输出端线(16)连接，数字源表输出端线(16)与数字源表(15)连接；第一Pt电极(11)通过数字源表输入端线(17)与数字源表(15)连接；

拉制完的内径充满盐酸溶液的带尖端的毛细管(A)，由于其被拉制完成后尖端内径多是封闭的，故将带尖端的毛细管(A)无尖端的部分固定在与第一Pt电极(11)相对的四通(10)的第四个端口内，带尖端的毛细管(A)无尖端部分的端面与流动相中的KCl溶液相接触，带尖端的毛细管(A)的尖端浸入离心管(13)的HF、KCl的溶液中，第二Pt电极(12)同样浸在离心管(13)的HF、KCl的溶液中；将数字源表输入端线(17)与第一Pt电极(11)相连，数字源表输出端线(16)与第二Pt电极(12)相连，通过数字源表(15)在第一Pt电极(11)、第二Pt电极(12)之间施加一个电压；由于开始时带尖端的毛细管(A)的尖端内径封闭，所以没有电流被检测到(因为外界对数字源表(15)有一定干扰，所以断路时稳定后电流并非完全为0，而是有一个小波动，但这并不是通路时的电流，也并不影响检测，可以理解为电流背景，检测过程中尽量不要碰触数字源表(15)的输入输出线)，一旦带尖端的毛细管(A)封闭的尖端被离心管(13)的HF溶液刻蚀变通，第一Pt电极(11)、四通(10)内的流动相、带尖端的毛细管(A)、离心管(13)的HF、KCl的溶液及第二Pt电极(12)就构成一个通路，灵敏的数字源表(15)将检测到电流由无到有、有小变大的过程。

想要得到不同尺寸的尖端，可以在不同的电流下将带尖端的毛细管(A)的尖端从离心管(13)中取出，用碱溶液终止HF溶液对毛细管(A)的尖端刻蚀。

采用上述系统进行微纳毛细管制备纳米尖端移液管的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配置KCl溶液，浓度在0.001-0.3mol/L之间，过滤两遍；配置盐酸(HCl)溶液，浓度小于1mol/L，使用前需过滤；配置NaOH溶液，浓度小于1mol/L；配置刻蚀液(KCl溶液+HF溶液的混合液)，配置完成的刻蚀液中KCl溶液浓度在0.001-0.3mol/L之间，含HF的量为0.1％-15％；准备两根铂电极(11、12)

(2)将高压输液泵(7)的流动相换成KCl溶液；

(3)利用毛细管通透性验证装置(图1)验证待拉制毛细管(3)的通透性良好后进行下一步；

(4)利用毛细管拉制系统(图2)将待拉制毛细管(3)拉断得到带尖端的毛细管，备用；

(5)调节数字源表(15)稳定后关闭备用，组装毛细管刻蚀及电流回路检测系统(图3)，在将带尖端的毛细管(A)的尖端放入离心管(13)溶液前，打开数字源表(15)；

(6)将带尖端的毛细管(A)的尖端放入离心管(13)的溶液中，观察数字源表(15)的电流示数变化；

(7)发现数字源表(15)的电流有明显变化；检测的电流由无到有，根据实验要求，在电流为某一数值时将带尖端的毛细管(A)的尖端从离心管(13)中取出，放入配置的NaOH溶液中一段时间，再放入超纯水中保护；

(8)将高压输液泵(7)的流动相换成超纯水，用水冲洗高压输液泵(7)和制备的毛细管；

(9)用氮气将制备的毛细管吹干，放于真空干燥箱中，在真空或惰性气体气氛中保存，待用。

本发明将湿法刻蚀与电流检测相结合，可实现：利用各种规格的玻璃毛细管和熔融石英毛细管来制备通透的纳米级别尖端的移液管。本发明可制备：锥尖外径小于1μm的通透性纳米移液管尖端，能够精确移取皮升级甚至飞升体积的液体。本方法将湿法刻蚀与电流检测相结合，与传统的制作方法和现有的其它方法相比，简便、灵敏、可控性强，提高了取液精度，由于制备的尖端尺寸较小，因此大大减小了对操作对象的损伤。本法所制备的纳米尖端移液管具有广泛用途，如：可用于精确移液、显微操作，电化学检测电极的制备、膜片钳、质谱进样等方面。

本发明由于采用以上技术方案，其具有以下优点：

(1)制备方法与系统简便。减少了制备步骤，避免使用较多的仪器，操作人员容易掌握。

(2)数字源表的灵敏性高。能够检测到10pA(10^-11)级的电流，故决定了该制备方法具有较强的灵敏性，数字源表的灵敏度直接决定了该实验的成败。

(3)可控性强。通过调节刻蚀液中HF的浓度，来调节刻蚀毛细管速度，再通过检测电流的变化，电流由无到有，证明了毛细管由封闭到通的变化；电流由小变大，证明了毛细管内径开口由小变大的过程。其它条件不变的条件下，在不同的电流下终止刻蚀，得到的毛细管尖端尺寸不同，达到可控制备的目的。

(4)成本较低。与干法(离子束)刻蚀毛细管尖端来得到较小的通透性纳米尖端的方法相比，该方法大大减小了制作成本。

(5)在生物中，制备的纳米尖端移液管对操作对象的损伤小，提高了操作对象的存活率，可推进医学的进步；

(6)外该方法还可灵敏地检测已制备的纳米尖端移液管的通透性；

(7)本方法所制尖端具有多种用途，比如：可用于化学中的精准取样，尤其对比较珍贵且用量很少的液体样品；可用于显微操作中的取样/进样针；可用于电化学检测微电极的制备；可用于膜片钳中，检测细胞的离子通道；也可作为质谱进样针使用等。

附图说明

图1是本发明中验证毛细管通透性装置的示意图；

图2是本发明中毛细管拉制系统的示意图；

图3是本发明中毛细管刻蚀及电流回路检测系统的示意图；

图4是本发明具体实施方式中，用内径为100μm、外径360μm的毛细管制备出的尖端开口横切面及侧面扫描电镜图；

图5是本发明具体实施方式中，用内径为75μm、外径360μm的毛细管制备出的尖端开口横切面及侧面扫描电镜图；

图6是本发明具体实施方式中，用内径为25μm、外径360μm的毛细管制备出的尖端开口横切面及侧面扫描电镜图；

图7是本发明具体实施方式中，用内径为5μm、外径360μm的毛细管制备出的尖端开口横切面及侧面扫描电镜图；

图8、9、10是本发明具体实施方式中，用内径为0.9μm、外径360μm的毛细管制备出的不同尺寸的尖端开口横切面及侧面扫描电镜图；

图11是本发明具体实施方式中用内径为0.9μm、外径360μm的毛细管制备的尖端，在荧光倒置显微镜100倍油镜下接近并扎取动物细胞的显微图；

1高压气瓶，2小钢瓶，3待拉制毛细管，4、13离心管，5小离心管，6毛细管拉制器，7高压输液泵，8二通，9Peek管，10四通，11第一Pt电极、12第二Pt电极，14毛细管，15数字源表，16数字源表输出端线，17数字源表输入端线，A带尖端毛细管。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例提供一种集微纳毛细管拉制、湿法刻蚀和电流检测于一体的制备纳米尖端移液管的方法及系统，现以外径360μm，内径0.9μm的微纳毛细管来制备纳米尖端移液管为例对本发明进行详细描述，具体实施步骤如下：

S1.配置0.1mol/L的KCl溶液，过滤两遍；配置0.2mol/L的HCl溶液，使用前过滤；配置0.1mol/L的NaOH溶液；配置HF浓度为2％-5％的刻蚀液(稀KCl溶液+原HF溶液的混合液)；准备两根铂电极(11、12)；

S2.将高压输液泵(7)的流动相换成0.1mol/L的KCl溶液；

S3.利用毛细管通透性验证装置(图1)验证外径为360μm，内径为0.9μm的微纳毛细管(3)的通透性，设定高压气瓶(1)分阀压力约为1000psi，当离心管(4)中有明显气泡冒出时，证明毛细管良好；

S4.利用毛细管拉制系统(图2)将外径为360μm，内径为0.9μm的微纳毛细管(3)拉断备用，设定高压气瓶(1)分阀压力也约为1000psi，设定毛细管拉制器(6)的参数为HEAT:360FIL:2VEL:50DEL:120PUL:100，设定高压输液泵(7)的流速为0.1mL/s，；

S5.调节数字源表(15)稳定后(因为受外界环境干扰，10pA位置的的值在上下波动，不影响检测，可以理解为电流背景)，关闭备用，组装毛细管刻蚀及电流回路检测系统(图3)，在将毛细管(A)的尖端放入离心管(13)的刻蚀溶液中前，打开数字源表(15)；

S6.将毛细管(A)的尖端放入离心管(13)的溶液中，观察数字源表(15)的电流示数变化；

S7.发现数字源表(15)的电流有明显变化，检测的电流由无到有；根据实验要求，在电流为某一数值时将毛细管(A)的尖端从离心管(13)中取出，放入配置的0.1mol/L的NaOH溶液中2-5min，再放入超纯水中保护；

S8.将高压输液泵(7)的流动相换成超纯水，用大量的水冲洗高压输液泵(7)和制备的毛细管(A)；

S9.用氮气将制备的毛细管(A)吹干，放于超精间的真空干燥箱中，在真空或惰性气体气氛中保存，避免制备的毛细管尖端被灰尘或其它微小物质堵塞，备用。

按照实施例的方法，还可用外径360μm，内径分别为5μm、25μm、75μm、100μm或其它规格的的微纳毛细管来制备纳米尖端移液管。根据毛细管的规格不同，需要适当调节所使用溶液的浓度及操作仪器的参数；其它步骤基本不变。

按照实施例的方法制备得到的尖端用于动物细胞的活体取样

S1.取已分散好的动物细胞悬浮液，滴加少量到盖玻片上；

S2.将盖玻片放于荧光倒置显微镜的载物台上，及时用移液枪补充液体到盖玻片上，保持盖玻片细胞的活性；

S3.将制备的毛细管尖端夹于三维调节架的夹具上，毛细管尖端朝向盖玻片，另一端接通电渗泵；

S4.显微镜下操作尖端接近并刺入动物细胞进行取样。(参见图11)

需要说明的是，上述方法和系统内的各单元之间的相互配合、执行过程等内容，由于与本发明方法实施例基于同一构思，具体内容可参见本发明方法实施例中的叙述，此处不再赘述。

本领域普通技术人员可以理解上述实施例的方法具有简便、灵敏、可控性强、成本低等优点，并且容易被操作者所掌握。

以上对本发明实施例所提供的一种集微纳毛细管拉制、湿法刻蚀和电流检测于一体的制备纳米尖端移液管的方法及系统，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的实施方式及所得产品进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。