用于微阵列3D生物打印的芯片平台的制作方法

本申请要求2016年11月17日提交的临时专利申请62/423，586的优先权，并通过引用将其公开的内容全部并入本文中。

背景技术：

开发治疗药物时，必须确定药物的安全性和有效性。在药物开发的相对早期阶段，药物的安全性和有效性通常在活体之外(“体外”)进行测试。然而目前可用的体外分析-使用2d细胞单层或3d细胞球体-并不能充分模拟药物在活体之内(“体内”)的作用。因此，需要一种能够高度模拟体内相应组织并系统模拟疾病的体外细胞/组织模型。

在这方面，3d生物打印是一种很有前景的技术。一般来说，3d生物打印是指在水凝胶中逐层地自动滴涂(dispensing)细胞，从而创建出相对大规模的组织构建体，能够更准确地模拟体内环境。但是，由于组织构建体通常是大规模的，因此3d生物打印对于高通量检测并不理想，因此作为当前可用的体外分析的替代方法受到限制。然而，最近，一种微阵列3d生物打印的方法被开发出来，该方法允许高通量检测。

微阵列3d生物打印是指使用微阵列点样器将非常少量的细胞与其他生物样品，比如水凝胶、生长因子、细胞外基质、生物分子、药物、dna、rna、病毒、细菌、生长介质或其组合，一起滴涂到微孔/微阵列芯片平台上，然后培养细胞创建微型生物构建体。这项技术能够潜在地彻底改变组织工程和疾病建模，用于筛选治疗药物和研究毒理学。

由于微孔/微柱芯片平台(也称为“微阵列生物芯片”)包含多达5000个微孔/微柱，因此该方法对高通量检测是理想的。然而，由于微柱芯片上有限的可用空间或微孔芯片中各个实验条件的有限控制，目前可用的微孔/微柱芯片对于微阵列3d生物打印并不理想。

例如，目前可购得的微柱芯片使用具有平顶的柱，这不利于逐层滴涂细胞。因此，难以在微柱芯片上进行3d生物打印。此外，目前可购得的微孔芯片使用在打印细胞层时在水凝胶中截留气泡的孔。此外，很难在微孔芯片中分别控制每个生物打印的组织构建体，因为微孔芯片中的所有组织结构都应浸入具有通用生长介质的培养皿中。因此，需要在芯片上设计一种新的微孔和微柱结构，其能够促进在柱和孔上分层细胞打印，确保用于高含量成像和免疫荧光分析的牢固(robust)细胞斑附着，并避免在牢固的3d细胞/组织培养中气泡截留。新的芯片设计可与传统的微量滴定板兼容，包括96-、384-和1536-孔板。

技术实现要素：

本发明涉及微柱芯片和微孔芯片，所述芯片促进在柱上和孔上分层细胞打印，确保用于高含量成像和免疫荧光分析的牢固细胞斑附着，并避免气泡截留。本发明还涉及使用微柱和微孔芯片来创建微型多细胞生物构建体的方法。

所述微柱芯片包括具有至少一个微柱的芯片基座。微柱不是具有平顶，而是在其顶端具有柱-微孔。所述柱-微孔包括柱-微孔底座和从所述底座向上延伸的侧壁。

所述微孔芯片包含至少一个微孔，与传统微孔不同，该微孔具有上微孔和下微孔。

所述创建微型多细胞生物构建体的方法包括将细胞沉积到柱-微孔中，将柱-微孔暴露于生长介质中，并培养细胞。

参考以下描述和所附的权利要求，将更好地理解本发明总体构思的这些和其它特征、方面和优点。

附图说明

图1a显示了微柱芯片的实施方案。

图ib显示了微孔芯片的实施方案。

图2a显示了微柱的实施方案的截面图。

图2b显示了微柱的实施方案的透视图。

图2c显示了微柱的实施方案的透视图。

图3是微柱的实施方案的截面图。

图4是微孔的实施方案的截面图。

图5a是具有包含细胞的柱-微孔的微柱的实施方案的截面图。

图5b是具有柱-微孔的微柱的实施方案的截面图，所述柱-微孔包含夹在含有生长介质的微量滴定板中的细胞。

图6a显示了微柱和微量滴定板的实施方案的截面图。

图6b显示了夹在微量滴定板的微柱的实施方案的截面图。

图6c显示了微柱和微量滴定板的实施方案的截面图。

图6d显示了夹在微量滴定板中的微柱的实施方案的截面图。

图7a显示了灌注通道芯片的实施方案。

图7b显示了图7a的放大部分。

图7c显示了与灌注通道芯片配对的微柱的分解图。

图7d显示了图7c的放大部分。

图8显示了灌注通道芯片、微柱芯片和储液槽芯片的实施方案。

图9a显示了夹在灌注通道芯片的实施方案中的微柱芯片的实施方案的横截面图。

图9b显示了灌注通道芯片的实施方案的俯视图。

图10是细胞染色的微型生物构建体的图像。

图11显示了功能化微柱的实施方案的表面化学。

图12显示了说明实施例3所用方法的流程图。

图13a是微柱/微孔芯片中hep3b细胞的图像。

图13b是微柱/微孔芯片中hep3b细胞的图像。

图14是微柱/微孔芯片中hep3b细胞的图像。

图15显示了说明实施例5中所用方法的流程图。

图16是染色的神经祖细胞的图像。

图17a显示了说明将抗体连接到微柱所用方法的实施方案的流程图。

图17b显示了说明将抗体连接到微柱所用方法的实施方案的流程图。

图18a显示了将抗体连接到微柱所用方法的实施方案的表面化学。

图18b显示了将抗体连接到微柱所用方法的实施方案的表面化学。

图18c显示了将抗体连接到微柱所用方法的实施方案的表面化学。

图19显示了说明检测生物标记物方法的实施方案的流程图。

图20显示了说明测量细胞表面标记物变化的方法的实施方案的流程图。

图21显示了说明定量癌细胞迁移的方法的流程图和染色的hep3b细胞的图像。

图22a显示了微孔芯片的实施方案的截面图。

图22b显示了微孔芯片的实施方案的截面图。

具体实施方式

虽然本文描述了各种示例性实施方案和方法，但与本文所述的那些类似或等效的其它实施方案、方法和材料均包含在本发明的总体构思中。本文所引用的所有参考文献，包括已公开的或相应的美国或外国专利申请、已授权的美国或外国专利以及任何其他参考文献，均通过引用整体并入本文中，包括所引用参考文献中公开的所有数据、表、图和文本。

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。

除非另有说明，否则本文所用的所有百分比、份数和比率均以总配方的重量计。除非另有说明，否则所有与所列组份有关的重量均基于活性物质含量，因此，不包括可能包含在市售材料中的溶剂或副产物。

除非另有说明或在引用的上下文中明确暗示相反的含义，否则对本发明公开的单数特征或限定的所有引用应包括相应的复数特征或限定，反之亦然。

本发明所披露的方法和实施方案可以包含、由或基本上由本文所述的本发明的必要要素组成，以及本文所述的任何附加的或可选的要素，或者在实施本发明总体构思中有用的任何附加的或可选的要素。

在说明书或权利要求中使用术语“包括(include)”、“包括(including)”、“含有(contain)”或“含有(containing)”的范围内，这些术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式包含在内，正如该术语在权利要求中用作过渡词时所解释的那样。此外，在使用术语“或”的范围内(例如，a或b)，旨在表示“a或b或两者兼而有之”。当申请人旨在表明“只有a或b而不是两者兼而有之”时，将使用术语“只有a或b而不是两者兼而有之”。因此，本文中“或”一词的使用是包含性的，而不是排他性的。此外，在说明书或权利要求中使用的术语“在……中(in)”或“到……中(into)”的范围内，旨在另外表示“在……上(on)”或“到……上(onto)”。

除非另有说明或所引用组合的上下文中明确暗示相反的含义，否则本文所使用的方法或工艺步骤的所有组合可按任意顺序执行。

本文公开的所有范围和参数(包括但不限于百分比、份数和比率)应理解为包括其中假定或包含的任何和所有的子范围，以及端点之间的每个数字。例如，所述范围“1到10”应视为包括从最小值1或大于1的值开始，到最大值10或小于10的值结束的任何和所有子范围(例如，1到6.1或2.3到9.4)，以及该范围内包含的每个整数(1、2、3、4、5、6、7、8、9和10)。

本发明总体构思涉及用于微阵列分析的微柱和微孔芯片，以促进在微柱上和微孔中分层细胞打印。微柱和微孔芯片确保了用于高含量成像和免疫荧光分析的牢固细胞斑附着，并避免气泡截留。本发明总体构思还考虑了使用本发明的微柱和微孔芯片创建和分析微型多细胞生物构建体(“微型生物构建体”)的方法。

设计常规微阵列生物芯片以使微柱芯片与微孔芯片相匹配。微柱的尺寸设计使得它们可以插入相应的微孔中。本发明的微柱和微孔芯片可以相互兼容并且可以与常规的微柱和微孔芯片或微量滴定板兼容。例如，本发明的微柱芯片可以与常规的微孔芯片和常规的微量滴定板以及本发明的微孔板兼容，并且本发明的微孔芯片可以与常规的微柱芯片和本发明的微柱芯片兼容。示例性的常规微柱/微孔芯片由三星电子机械公司(samsungelectromechanics,co.)和mbd韩国(mbdkorea)(例如s+微孔芯片)制造。示例性的常规微量滴定板，包括96-、384-、1536-和3456-孔板，由corning和其他制造商制造。

本发明的芯片可以由生物相容性聚合物制成。生物相容性聚合物可以是透明的或不透明的，这取决于要进行分析的类型。例如，在一些示例性实施方案中，芯片可以由透明的聚苯乙烯制成。在另外一些示例性实施方案中，芯片可以由功能性苯乙烯-马来酸酐共聚物制成。可以使用任何传统的制造工艺(包括3d打印)来制造芯片。

参考图1，本发明的微柱芯片100包括芯片基座101和至少一个微柱102。在一些示例性实施方案中，微柱芯片包含微柱阵列103，例如，约90到约5000个微柱。微柱102可以是任何形状，其形状取决于测试的需要。例如，所述微柱可以是圆柱形201，或者它可以是方形202。图1描绘了包含384根柱的阵列的板的实施方案。

在一些示例性实施方案中，微柱102的宽度为约0.3-5mm，长度为约0.3-5mm，高度为约1-20mm。在另外一些示例性实施方案中，微柱102的直径可以为约0.3-5mm，高度可以为约1-20mm。例如，微柱102的直径可以为2.6mm，高度可以为13.5mm。

参考图2，与具有平顶的传统微柱不同，本发明的微柱102包括含柱-微孔204的顶端203。柱-微孔204是具有柱-微孔基座205和至少一个侧壁206的储液槽。所述柱-微孔可以从所述微柱的顶端203延伸到所述柱-微孔的基座205。柱状微孔基座可位于芯片基座101和柱顶端203之间的任何位置。例如，柱-微孔可以容纳任意体积样品，包括1-4μl。所述侧壁可位于高度约0.5-5mm，厚度约0.3-1mm的任意位置。柱状微孔侧壁206促进逐层细胞打印以及牢固细胞斑的附着。

在一些示例性实施方案中，所述微柱芯片包含用于使气泡截留最小化的装置。例如，在一些示例性实施方案中，柱状微孔侧壁206可包含至少一个狭缝207。狭缝207是侧壁中的一个间隙，该间隙至少部分延伸穿过侧壁的宽度。在另外一些示例性实施方案中，柱-微孔侧壁可包含1-5个狭缝207或更多。

参考图3，在另一个示例性实施方案中，所述微柱芯片包含用于使气泡截留最小化的装置，其中，所述微柱102包含从柱-微孔基座205延伸的孔301，所述孔301至少部分地通过该微柱。在一些示例性实施方案中，所述孔的直径可以小于所述微柱的直径。例如，在一些示例性实施方案中，对于直径为2mm的柱，孔的直径可以是但不限于0.4mm，或者对于直径为5mm的柱，孔的直径可以是但不限于1mm。

此外，在一些示例性实施方案中，柱-微孔的基座205可用等离子体处理或用功能性聚合物涂覆以增强牢固细胞斑的附着。所述示例性功能性聚合物包括但不限于马来酸酐与1-十八碳烯的交替共聚物(pma-od)、马来酸酐与十四碳烯的交替共聚物(pma-td)、聚氧化乙烯-马来酸酐共聚物，包括acm1510、adm1510、aem1510、akm0530和akm1510、聚-l-赖氨酸(pll)、氯化钡(bacl2)、氯化钙(cacl2)、胶原、肽水凝胶(puramatrix)、纤维蛋白原、纤连蛋白和基质胶(matrigel)。

参考图4，本发明的微孔芯片104包含至少一个微孔105。在一些示例性实施方案中，所述微孔芯片可以包含微孔阵列106，例如，约90到约5000个微孔。

与常规的微孔不同，本发明的微孔105包括上微孔401和至少一个下微孔402。下微孔可从上微孔的基座405大致向下延伸。上微孔和下微孔可以流体连通。

根据测试的需要，所述上微孔401和下微孔402可以是任何形状。例如，所述微孔可以是圆柱形403或是方形404。在一些示例性实施方案中，上微孔401的宽度为约0.3-100mm，长度为约0.3-100mm，高度为约0.3-100mm。在另外一些示例性实施方案中，上微孔401的直径为约0.3-100mm，高度为约0.3-100mm。在另外一些示例性实施方案中，上微孔直径可以为约1.2mm，高度可以为约1.5mm。取决于形状，下微孔402的宽度、长度或直径可以小于上微孔。

在一些示例性实施方案中，所述下微孔402包含用于使气泡截留最小化的装置。例如，在一个示例性实施方案中，至少一个外围通道406沿下微孔402的外围垂直延伸。外围通道406的尺寸可以在大小和形状上变化。例如，外围通道可以是矩形或圆柱形。外围通道可从上微孔基座405延伸至下微孔的底部。

在另外一些示例性实施方案中，可以对下微孔进行等离子体处理或用功能性聚合物涂覆以增强牢固细胞斑的附着。

参考图5-9，本发明的微柱和微孔芯片使一些用于微阵列3d生物打印的创造性方法成为可能。一种示例性方法通常包括将细胞501滴涂到至少一个柱-微孔204中并培养细胞以创建所需的微型生物构建体。在一些示例性实施方案中，可以创建微型生物构建体来模拟特定组织，例如但不限于心脏、肝脏或大脑。例如，可以在胶原中通过逐层打印原代肝细胞/heparg(primaryhepatocytes/heparg)、肝窦内皮细胞(hepaticsinusoidalendothelialcells)、肝星状细胞(hepaticstellatecells)和库普弗细胞(kupffercells)来创建人类肝组织结构，以维持肝特异性功能。此外，例如，可以通过在基质胶中打印神经干细胞并分化为不同的神经谱系数月来构建人脑组织。

在一些示例性方法中，通过微阵列点样器502将细胞501滴涂到柱-微孔204中。微阵列点样器502是一种能够滴涂少量液体(也称为“点”)的自动装置。在一些示例性方法中，微阵列点样器502可以能够将点打印到同一微柱芯片100上的多个柱-微孔204中。微阵列点样器可以能够将约20nl到约3000nl的细胞打印到柱-微孔204中。示例性的微阵列点样器包括可从三星和韩国mbd商业购得的s+微阵列，以及可从digilab公司购得的microsys、pixsys和celljet。

在一些示例性方法中，在滴涂细胞之前，可制备包含细胞、至少一种水凝胶和生长介质的细胞悬浮液。可选地，所述细胞悬浮液可以包括一种或多种生物分子、药物、dna、rna、蛋白质、细菌、病毒或其组合。例如，可以选择生物分子、药物、dna、rna、蛋白质、细菌、病毒或其组合来模拟特定的生物环境，例如特定的组织(肝、心、脑等)。

水凝胶通常是一种含有水的聚合物。例如，合适的水凝胶可以是藻酸盐(alginate)、甲基丙烯酸化藻酸盐(methacrylatedalginate)、壳聚糖、透明质酸、纤维蛋白原、胶原、甲基丙烯酸胶原、肽水凝胶、基质胶、肽胶(pepgel)和聚乙二醇。细胞可以通过各种机制，比如包括但不限于离子、光、酶和化学交联，被截留在水凝胶中。交联剂可包括促进水凝胶凝胶化的盐或酶。合适的交联机理的实例包括离子交联(例如，藻酸盐与氯化钡和氯化钙；肽水凝胶与盐)，亲和/共价键合(例如，功能化聚合物与链霉亲和素和生物素)，光聚合(例如，甲基丙烯酸化藻酸盐与光引发剂)和生物催化(例如，纤维蛋白原与凝血酶)。

细胞悬浮液浓度可以是约10000至20,000,000细胞/毫升，约500000至5000,000细胞/毫升，或者约1000,000至2000,000细胞/毫升。生长介质可为最终细胞悬浮液的约90w/v％至约99.9w/v％。水凝胶可为最终细胞悬浮液的约0.1w/v％至约10w/v％。

所述生长介质通常为被设计成用于支持细胞生长的液体。生长介质的合适例子可包括杜尔贝科的改良鹰培养基(dulbecco’smodifiedeaglemedium)(dmem)、罗斯威尔公园纪念研究所培养基(roswellparkmemorialinstitutemedium)(rpmi)和威廉e培养基(william’semedium)。生物分子可包括支持细胞或组织生长的分子，例如细胞外基质(ecms)、生长因子、化合物、细胞因子和碳水化合物。

在一些其他的示例性方法中，在用微阵列点样器502将细胞滴涂之前，用等离子体处理或用功能性聚合物涂覆柱-微孔204以使细胞斑附着和水凝胶凝胶化。

参考图6a-6d，在一些示例性方法中，可使用功能性聚合物处理柱-微孔然后将其浸没在含有悬浮在水凝胶602(比如藻酸盐)中的细胞的常规微量滴定板505中，而不是使用微阵列点样器502将细胞501滴涂到柱-微孔204中。当微柱芯片100上的柱-微孔204浸没603在水凝胶602中时，柱-微孔截留水凝胶604的一部分，因此当移出微孔芯片时，柱-微孔204中包含水凝胶604的一部分。在该方法中，截留在柱-微孔中的细胞体积可由柱-微孔基座205、侧壁206和狭隙207的表面积控制。

在一些示例性方法中，一旦柱-微孔204中包含所需的细胞，就可以对微柱板100进行培养。在一些示例性方法中，柱-微孔204可暴露于生长介质504中进行培养。如图6d所示，在另外一些示例性方法中，可以将柱-微孔浸没在含有用于细胞培养的生长介质504的常规微量滴定板505中。将柱-微孔204浸没在含有细胞生长介质的常规微量滴定板505中是对当前现有技术的改进，因为它仅需要通过微板清洗器滴涂器更换生长介质而不干扰细胞层。

参考图7-9，在一些示例性方法中，可通过将柱-微孔204浸没在含有生长介质504的灌注通道芯片701中来培养微柱芯片。例如，该方法可用于长期培养，并可模拟循环系统进行研究，比如研究器官-器官的相互作用。图7a-7d说明了灌注通道芯片701的一种实施方案。所述灌注通道芯片可包含一个或多个含有一个或多个通道703的隔室702。此外，灌注通道芯片701可使用多孔膜盒704将一个或多个隔室702分开。所述一个或多个隔室702可包含含有测试化合物、生物分子、药物、dna、rna、蛋白质、细菌、病毒或其组合的生长介质504，该生长介质504可流过或驻留在一个或多个通道703中。例如，所述灌注通道芯片701的一种实施方案可包含一个用于肝脏共培养的隔室、一个用于脑细胞共培养的隔室和一个用于模拟血脑屏障的多孔膜盒704。如图7c和7d所示，含有柱-微孔204或常规柱的微柱芯片100可以夹在灌注通道芯片701中，以使得柱上或柱-微孔204中的内容物可以与通道703中的生长介质504接触。如图9b所示，所述灌注通道芯片可包含柱插入孔901，柱或柱-微孔204可通过柱插入孔901插入。

参考图8，在另外一些使用灌注通道芯片701的示例性实施方案中，一个或多个微泵804可与灌注通道芯片集成以循环生长介质504。在另一些示例性实施方案中，生长介质可以从储液槽803进行循环。在另外一些示例性实施方案中，包含用于储存生长介质的储液槽803的储液槽芯片802可以与灌注通道芯片701集成。在另外一些示例性实施方案中，储液槽芯片802可包括用于滴涂可能需要的任何样品的样品注入孔801，所述样品包括但不限于细胞染色试剂、测试化合物、生长介质、生物分子、药物、dna、rna、蛋白质、细菌、病毒或其组合。

参考图22a和22b，在一些示例性方法中，细胞501可通过微阵列点样器502滴涂到微孔芯片的下微孔402中。在一些示例性方法中，细胞可以被包埋在水凝胶中，并且在一些示例性方法中，可以将多于一层细胞或细胞混合物打印到下微孔402中。在另外一些示例性实施方案中，可以用功能性聚合物处理下微孔402，以使细胞斑附着和水凝胶凝胶化。随后，可通过将细胞生长介质504滴涂到上微孔401中来培养细胞。

在一些示例性实施方案中，在创建微型生物构建体之后，可以添加至少一个生物样品。适宜的生物样品可包括生物分子、药物、dna、rna、细胞、生长因子、细胞外基质、蛋白质、病毒、细菌或其组合。可以选择至少一个生物样品来模拟特定的生物环境或条件。在一些示例性实施方案中，可以使用微阵列点样器502将至少一个生物样品直接打印到微型生物构建体上，无论该微型生物构建体是在柱-微孔204中还是在下微孔402中。在另外一些示例性实施方案中，可以使用微阵列点样器将至少一个生物样品打印到常规微量滴定板505的孔中；然后可以将包含微型生物构建体的柱-微孔204插入到包含生物样品或其他微型生物构建体的微量滴定孔中。

在本发明的微孔板104中创建微型生物构建体的一些示例性实施方案中，可以通过将微孔板与已经用至少一个生物样品或生物分子制备的常规微柱芯片夹在一起来添加生物样品或生物分子。同样地，在另外一些示例性方法中，通过培养细胞并且在本发明的微柱板100上创建微型生物构建体之后，可以通过将微柱板100与已经用至少一个生物样品或生物分子制备的常规微孔板夹在一起来添加至少一个生物样品或生物分子。

在一些示例性实施方案中，除了在本发明的柱或微孔或常规柱或微孔上附着细胞斑外，还可以通过使用反应性聚合物的功能化来附着固定抗体，以测量可溶性生物标记物。图17a显示了该方法的一种实施方案。在一些示例性实施方案中，柱-微孔204或常规柱的表面可涂覆反应性聚合物，包括但不限于马来酸酐与1-十八碳烯的交替共聚物(pma-od)或苯乙烯-马来酸酐共聚物。然后，可将标记有生物素的配体，例如聚l-赖氨酸(pll)，滴涂到涂覆柱的表面上。然后，在配体固定后，可以冲洗柱以去除任何未结合的配体。接下来，可将具有亲和标记的抗体，例如链霉亲和素或生物素，滴涂到该柱表面上以使其与固定于该柱表面上的配体相互作用，从而使抗体附着在该柱表面上。

图18a-18c显示了将固定化抗体附着到柱表面的示例性方法的表面化学。图18a说明了生物素附着在pll上的表面化学。图18b显示了通过链霉亲和素-生物素相互作用附着生物素-缀合抗体(biotin-conjugatedantibodies)进行夹心酶联免疫吸附试验(sandwichelisaassays)的表面化学。图18c显示了通过硫-smcc和硫醇反应附着马来酰亚胺-缀合抗体(maleimide-conjugatedantibodies)进行夹心酶联免疫吸附试验。硫-smcc是一种水溶性异双功能蛋白交联剂。硫-smcc蛋白交联剂一端含有胺基反应性硫-nhs酯，提高其水溶性，还含有用于与半胱氨酸或巯基(-sh)发生特异性反应的马来酰亚胺官能团。马来酰亚胺官能团不容易与赖氨酸或氨基(-nh2)反应，因此马来酰亚胺活化的缀合物可以很容易地制备供以后使用。图18b和18c中的所有产品，均可从赛默飞世尔科学(thermofisherscientific)商购获得。

参考图19，在一些示例性方法中，附着有固定化抗体的本发明柱或常规柱可用于通过使用夹心酶联免疫吸附试验检测细胞释放的分泌生物标记物。例如，在一些实施方案中，细胞可以被截留在水凝胶中并滴涂到柱-微孔204或常规柱中。然后，将可以释放被截留的细胞中的可溶性生物标志物(例如，细胞因子等抗原)的化合物滴涂到孔板上的孔中。接下来，可以将柱夹在含有化合物的孔板中，从而允许细胞释放可溶性生物标记物。然后，可将含有已用附着的固定化抗体制备的柱的柱板夹在含有可溶性生物标记物的孔板中。所述柱可以用对应于不同柱的各种抗体制备。然后，可以将柱移出，然后将该柱夹在含有带荧光标记的一抗(primaryantibodies)的孔板上，允许进行夹心酶联免疫吸附试验。夹心酶联免疫吸附试验方法为本领域所已知的方法。

参考图20，在一些示例性方法中，也可以使用本发明的柱芯片或常规柱芯片通过免疫荧光原位分析测量可溶性生物标记物。图20显示了用测试化合物调制3d-培养细胞并在柱状芯片上使用免疫荧光分析法测量细胞表面标记物变化的示例性方法。如酪胺基信号放大试剂盒的带有荧光标记的抗体，可用于标记目的蛋白质。

在另外一些示例性方法中，在制成微型生物构建体之后，可以通过细胞成像的方法来检验。例如，微型生物构建体可以用荧光染料(例如，钙黄绿素am(calceinam)、乙啡啶同二聚体-1(ethidiumhomodimer-1)、赫斯特33342(hoechst33342)、yo-pro-1、碘化丙啶、四甲基罗丹明甲酯(tmrm)、荧蒽-4am(fluo-4am)、mcb、硫醇绿染料)、荧光标记抗体(例如，酪胺信号放大试剂盒)或携带生物标记基因的重组病毒(例如，来自赛默飞世尔(thermofisher)的杆状病毒系统)进行染色。在一些示例性实施方案中，例如，可以使用高含量成像扫描仪对微型生物构建体成像。合适的成像设备包括从三星商业购买的s+扫描仪、从分子器件(moleculardevices)商业购买的genepix扫描仪、从赛默飞世尔(thermofisher)商业购买的细胞组学阵列扫描仪(cellomicsarrayscan)。在另外一些示例性实施方案中，可以使用不同的z焦点位置对细胞的各个层单独进行成像。微型生物构建体的小尺寸允许在不同的z焦点位置成像。

在制成细胞悬浮液之前或之后，可对细胞和微型生物构建体进行染色或以其他方式制备以促进成像，包括高含量成像。例如，细胞可以用荧光染料染色，以指示某些细胞过程。染料及其可能指示的细胞过程的实例为本领域已知，包括用于指示细胞活力和细胞毒性的钙黄绿素am和乙非啶同二聚体-1；用于指示细胞核功能变化的赫斯特33342(hoechst33342)；用于指示细胞凋亡或坏死的yo-pro-1/碘化丙啶；用于指示线粒体膜电位的四甲基若丹明甲酯酸铵(tmrm)；用于指示细胞内钙水平的荧蒽-4am(fluo-4am)；用于指示谷胱甘肽水平的单氯二胺(monochlorobimane)(mcb)和硫醇绿染料。细胞和微型生物构建体也可以被携带各种荧光生物标记基因的重组病毒染色。示例性重组病毒是杆状病毒，例如购自赛默飞世尔的杆状病毒表达系统。其他合适的染色方法可以为本领域可已知的染色方法。荧光生物标记物的实例包括蓝色荧光蛋白(bfp)、绿色荧光蛋白(egfp)、橙色荧光蛋白(morange)或红色荧光蛋白(mcherry)。

实施例1

微型生物构建体是通过使用微阵列点样器在含有本发明柱的384-柱板上打印几层具有细胞外基质和生长因子的光交联藻酸盐中的人类细胞类型而产生的。在本发明的柱的阵列中提供了数百种不同的仿生条件。凝胶化后，用含有生长介质的384-孔板夹住384-柱板，用于快速测试最佳微环境以创建人组织复制物。微型生物构建体随后经化合物测试，荧光染料染色，自动荧光显微镜扫描器官功能的高含量成像(hci)和药物毒性的预测评估。图10是微型生物结构的图像分析示例。

实施例2

参考下表1，对各种本发明的柱结构204进行了测试，以根据侧壁高度和狭缝数量分析可加载到柱-微孔中的样品体积。首先在本发明具有不同侧壁高度和狭缝数量的柱上涂覆0.01％的pma-od并干燥。接下来，将溶解在杜尔贝科(dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(dpbs)中的0.05mg/ml异硫氰酸荧光素(fitc)加入384-孔板中。然后将柱板夹在孔板中并摇动1小时。接下来，取出柱板，将其插入含50μldpbs的384-孔板中。然后用读板器(platereader)测量荧光强度，并利用校准曲线反算出柱-微孔中的fitc体积。结果如表1所示。

表1

实施例3

实施例3参考图11、12和表2。在一些实施方案中，本发明的柱-微孔204或微孔105的表面可被功能化以促进牢固细胞斑附着。例如，用马来酸酐与1-十八碳烯的交替聚合物(pma-od)涂覆具有本发明柱102实施方案(侧壁高度1.5mm，狭缝尺寸0.6mm，以及4个狭缝)的384-柱板，以使共价连接配体，包括聚-l-赖氨酸(pll)。pll带正电荷，使得离子可附着在带负电的藻酸盐上。将1500nl的25mm的cacl2溶液和0.0033％的pll打印在柱-微孔中并使其干燥。接下来，将1500nl含有藻酸盐的不同浓度的细胞悬浮液在柱-微孔中打印(0、0.5、1、2、4和6百万个细胞/ml)。然后将50μl的生长介质滴涂到384-孔板的微孔中。接下来，将含有不同浓度细胞悬浮液的柱夹在384-孔板中，过夜培养。培养后，取出柱，然后将该柱夹在包含5μlpresto和45μl生长介质的不同384-孔板中，分别放置1、2和3小时。然后用读板器测量荧光强度，以确定细胞活性。得到的校准曲线为y＝186.1x+343.0(r²＝0.974)。

表2

实施例4

实施例4参考图13a，13b和14。本发明的柱102的各种实施方案被用于模拟人类肝肿瘤。将hep3b人肝癌细胞悬浮于藻酸盐中并打印在包含2、3和4个狭缝的柱-微孔的60-柱板上。图13a是60-柱板图像，所述60-柱板具有夹在含有细胞生长介质的384-孔板上的藻酸盐中生物打印的hep3b细胞。图13b是在含有2、3和4个狭缝的柱-微孔中培养3周以上的生物打印海藻酸盐中hep3b细胞的图像。图像显示了在柱-微孔中心的一个肝肿瘤样类器官培养物。

图14是在本发明柱的一种实施方案中培养的彩色编码的生物打印人体组织的图像。用携带红色荧光蛋白(rfp)基因的慢病毒转导hep3b细胞，并将藻酸盐中的hep3b细胞悬浮液打印在60-柱板上，以监测细胞形态随时间的变化。图14是包含生物打印藻酸盐中hep3b细胞的60-柱板的图像，所述藻酸盐中hep3b细胞感染了携带用于原位细胞成像的rfp基因的慢病毒。红点表示在本发明的柱中表达rfp的活hep3b细胞。

实施例5

实施例5中参考图15和表3。在一些示例性方法中，可使用功能性聚合物处理柱-微孔204，然后将经处理的柱-微孔204浸没含有悬浮在水凝胶602(例如藻酸盐)中的细胞的常规微量滴定板505中，而不是使用微阵列点样器将细胞滴涂到柱-微孔中。为证明该实施方式，将1500nl25mm的cacl2和0.0033％的pll打印到本发明的384-柱板中具有不同的侧壁206高度和不同的狭缝207数量的各种实施方案的柱-微孔204中。然后，将20μl在0.75％藻酸盐和1mg/ml基质胶中的1,000,000细胞/ml悬浮液加入到384-孔板的孔中。然后将柱夹在含有细胞悬浮液的孔板中，取出，放在冰上4分钟。接下来，将50μl的生长介质添加到不同的384-孔板的孔中，然后将柱夹在含有生长介质的孔中培养2-4小时。接下来，将5μl的presto和45μl的生长介质滴涂到不同的384-孔板的孔中。然后将柱夹在含有presto的孔板中10分钟。接下来，由读板器读取荧光强度。表3提供了在本发明柱-微孔的各种实施方案中测量的体积。

表3

图16是含本发明柱实施方案的384-柱板上的包封在0.75％海藻酸盐和1mg/ml基质胶的混合物中的永生化人类神经祖细胞系(来自emdmillipore的rencell-vm)的图像。用0.75％海藻酸盐和1mg/ml基质胶混合物包封rencellvm细胞，然后夹在含有生长介质的微孔板中，培养2周。384-柱板上的每个细胞斑最初在1.5μl藻酸盐-基质胶混合物中含有67万个rencellvm细胞/ml(1000个细胞/斑)。图16中的比例尺为400μm。较亮的斑点表明用钙黄绿素am染色的活神经干细胞球体。

实施例6

实施例6参考图21。在使用本发明柱的一些示例性方法中，细胞可以在柱-微孔中逐层打印，不仅可以更好地模拟体内组织结构，而且还可以在本发明的柱上原位监测细胞活力、功能、迁移和形态变化。例如，在该示例性方法的一种实施方案中，可以用功能性聚合物，例如pma-od和交联剂，例如pll-cacl2涂覆柱-微孔204的表面。接下来，将含有化学吸引剂(例如，生长因子和细胞外基质)的水凝胶打印到柱-微孔204中。然后，在化学吸引层的顶部打印癌细胞(例如，hep3b细胞)。接下来，可将柱板夹在含有用于细胞培养的生长介质的孔板中。然后，利用荧光显微镜对微型生物构建体中的细胞进行成像，以评估癌细胞在3d空间中的迁移。

图21说明了使用本发明的柱板，使用包封在氧化的甲基丙烯酸化的藻酸盐(oma)中的hep3b细胞在3d结构中定量癌细胞迁移的示例性图像分析过程。通过用钙黄绿素am染色细胞并用自动荧光显微镜获取图像并计算获得的聚焦图像量和细胞的平均z位置以测量hep3b细胞从2％oma中向含有1.5mg/ml基质胶的底部oma层的迁移。利用有限傅立叶变换(fft)、带通滤波器和逆有限傅立叶变换(ifft)对离焦细胞图像进行处理，以去除离焦细胞，获得聚焦细胞图像。然后，对处理后的细胞图像进行色调分割(huesplit)以获得绿色荧光。接下来，计算细胞的平均z位置以利用图22中提供的方程评估癌细胞在3d结构中的迁移。这使得z轴上聚焦的hep3b细胞得以准确分析。这种方法还可以包括用携带荧光蛋白基因的慢病毒感染细胞，随时间的推移在不同的z-位置拍摄受感染细胞的图像，观察它们原位迁移至化学吸引剂。

实施例7

图17b显示了一种将抗体均匀地附着到本发明柱-微孔的方法的实施例。首先，含有本发明柱102的柱板可以涂覆0.01％的pma-od。接下来，可将0.005％的pll滴涂到孔板的孔中。然后，将柱板夹在孔板中。接下来，可以用蒸馏水冲洗柱板。然后，可将胺反应性生物素(硫-nhs-生物素(sulfo-nhs-biotin))滴涂到不同的孔板的孔中，可将柱板夹在该孔板中，然后取出柱板。接下来，将链霉亲和素滴涂另一个孔板的孔中，并将柱板夹在该孔板中。接下来，可将生物素化抗体滴涂到另一个孔板的孔中，并且可以将柱板夹在该孔板中。

本发明的方面已参照示例性实施方案进行了描述。在阅读和理解本说明书后，其他人将想到进行修改和改进。旨在包括所有这些修改和变化，只要它们落入所附权利要求或其等同物的范围内。