以聚缩醛为主链的刷状聚合物及其合成方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术、纳米医药及新材料领域，具体涉及以聚缩醛为主链的刷状聚合物的合成及其自组装及应用于制备对肺癌细胞具有增强细胞内吞特性的智能棒状载药胶束的用途。

背景技术：

传统化疗药物在肿瘤的治疗上取得很大成功，但有很多局限性限制了其临床疗效的进一步提高，如严重的毒副作用、选择性差、肿瘤细胞易对具产生耐药性等。智能纳米药物载体利用肿瘤组织的高渗透和长滞留效应(epr效应)，不仅能够延长载体体内循环时间，还可使药物高效运输到指定部位，有效提高药物疗效，减少正常组织器官损伤。智能纳米药物载体系统主要是基于肿瘤组织与人体正常组织的微环境差异，如肿瘤组织具有乏氧、酸性ph值、温度稍高、有大量生长因子及水解蛋白酶等特点。

亲水性酸可降解的聚合物，聚(1-羟甲基乙烯基羟甲基-甲缩醛)(phf)，可以通过多糖的彻底侧向切割获得。同时该聚合物也被证明是非生物反应性的、无毒的和完全降解的(biomacromolecules，2005，6(5)，2659-2670)。在药物传递过程中，由于缩醛基团的ph响应性，含有phf的智能纳米载体能在细胞外基质微环境(ph值7-7.5)中保持稳定，而当其被细胞内吞后，在细胞内囊泡室的酸性环境中则变得不稳定。

用于获取各种形貌颗粒的合成方法取得的巨大进步，为评估颗粒形貌在药物传递的各种重要生物过程中的影响铺平了道路。shrinivasvenkataraman等综合评价了当前已有的不同形貌的纳米结构对药物运输中重要生物过程的影响，发现细长颗粒具有优于球状粒子的固有优势：可以延长血液循环时间；能特定分布在肿瘤部位；并通过形貌对吞噬作用的影响避免过早被清除(advanceddrugdeliveryreviews，2011，63(14-15)，1228-1246)。苏州大学功能纳米与软物质研究院张秀娟课题组也发现与纳米球相比，纳米棒表现出更高的体外和体内抗癌功效(chemicalcommunications，2013，49(93)，10989-10991)。stephaniee.a.gratton等发现棒状颗粒在内化速率方面具有明显的优势，而且内化动力学不仅取决于有效的棒状长径比，也和粒子的绝对大小或体积有关(proceedingsofthenationalacademyofsciences，2008，105(33)，11613-11618)。

技术实现要素：

已有不少ph响应型的刷状聚合物被报道，但大多数情况下ph可断裂的基团都存在于侧链中，极少有主链可断链的刷状聚合物。因此，本发明提出了一种主链酸可降解的刷状聚合物，phf-g-(pcl-peg)。以该刷状聚合物构筑的棒状载药胶束可以用来包封和运输疏水药物阿霉素(dox)。当载药胶束到达溶酶体酸性环境时，由于聚缩醛主链在酸性条件下的水解，胶束解体，实现了dox的加速释放。此外，棒状形貌显著增强了细胞对载药胶束的摄取能力。本发明胶束的构建为实现“ph刺激-响应、增强细胞内吞”的新途径。本发明制备的刷状聚合物可以用于构筑棒状胶束，具有较好的释药性，较低的细胞毒性和增强的细胞吞噬性。

本发明提出了一种以聚缩醛为主链的刷状聚合物phf-g-(pcl-peg)，其特点是所述刷状聚合物的结构式如式(1)所示，

式(1)中：

n＝20-60

m＝10-30。

其中，phf的结构式如式(2)所示：

其中，pcl的结构式如式(3)所示：

其中，peg-nh2的结构式如式(4)所示：

本发明还提出了一种以聚缩醛为主链的刷状聚合物的合成方法，特点是所述方法包括以下步骤：(1)制备phf；(2)phf与ε-己内酯开环聚合，合成接枝聚合物phf-g-pcl；(3)以phf-g-pcl开环丁二酸酐得到侧链带有羧基的聚合物phf-g-pcl-cooh；(4)phf-g-pcl-cooh与peg-nh2脱水缩合得到所述以聚缩醛为主链的刷状聚合物phf-g-(pcl-peg)。

本发明进一步提出了将所述刷状聚合物通过纳米沉淀法自组装形成棒状胶束用作药物载体的应用。

其中，所述药物为脂溶性药物。优选地，所述脂溶性药物包括阿霉素、吉西他滨、sn38和紫杉醇。

其中，所述药物载体为ph响应型。

其中，所述药物载体用于增强肿瘤细胞的内吞特性。

其中，所述肿瘤细胞为肺癌细胞。

本发明利用聚缩醛对肿瘤微酸性环境的响应性，以及棒状形貌有利于增强细胞内吞的特点，以聚缩醛phf为主链合成了聚缩醛接枝聚己内酯-聚乙二醇刷状聚合物(phf-g-(pcl-peg))，进而构建其棒状载药胶束。详细评价了该棒状载药胶束对肿瘤微环境的ph响应行为、快速释药过程以及体外细胞摄取能力和细胞毒性。该ph响应行为及快速释药过程具体可描述为：棒状载药胶束经长效循环充分实现epr效应后富集于肺癌组织；棒状形貌增强了细胞对载药胶束摄取的能力，从而顺利进入细胞内部；棒状载药胶束在到达肿瘤细胞内溶酶体的酸性环境后，聚缩醛主链水解，胶束解体，dox从胶束疏水内核释放，实现药物在溶酶体内的定点释放。

本发明所涉及的以聚缩醛为主链的刷状聚合物自组装形成的phf-g-(pcl-peg)载药胶束的实施步骤如下：

第一步：聚缩醛刷状聚合物phf-g-(pcl-peg)的合成与表征

(1)合成phf；(2)phf与ε-己内酯开环聚合，合成接枝聚合物phf-g-pcl；(3)以phf-g-pcl开环丁二酸酐得到侧链带有羧基的聚合物phf-g-pcl-cooh；(4)phf-g-pcl-cooh与peg-nh2脱水缩合得到所述以聚缩醛为主链的刷状聚合物phf-g-(pcl-peg)，表征其结构；(5)合成用于对照研究的不含聚缩醛主链的两嵌段聚合物pcl-peg。

第二步：聚缩醛刷状聚合物棒状胶束及其载药胶束的制备及表征

通过纳米沉淀法自组装形成phf-g-(pcl-peg)胶束及其载药胶束，测定其临界胶束浓度；用透射电镜(tem)观测其形貌，用动态光散射仪(dls)测定粒径大小及分布；用紫外吸收法测定载药胶束的包封率和载药量。

第三步：聚缩醛刷状聚合物的降解及棒状载药胶束的释药性能

用gpc的方法对刷状聚合物phf-g-(pcl-peg)在模拟肿瘤溶酶体微环境ph值(ph5.0)及正常血液ph值(ph7.4)中的降解情况进行动态监测；用荧光法测定phf-g-(pcl-peg)载药胶束的释药性能。

第四步：phf-g-(pcl-peg)载药胶束的细胞吞噬

研究a549细胞对phf-g-(pcl-peg)载药胶束吞噬行为，以dox和不含聚缩醛的pcl-peg载药胶束作为对照。在37℃下培养4h后，用流式细胞仪测量细胞吞噬胶束样品的荧光值。

第五步：phf-g-(pcl-peg)载药胶束的细胞毒性研究

噻唑蓝(mtt)比色法检测phf-g-(pcl-peg)胶束和pcl-peg胶束，phf-g-(pcl-peg)载药胶束和pcl-peg载药胶束在37℃培养条件下a549细胞毒性。

本发明的有益效果在于：本发明制备的刷状聚合物可以自组装形成棒状载药胶束，具有较好的释药性，较低的细胞毒性和增强的细胞吞噬性。

附图说明

图1为phf-g-(pcl-peg)载药胶束示意图；

图2为刷状聚合物phf-g-(pcl-peg)的¹hnmr谱图；

图3为刷状聚合物phf-g-(pcl-peg)在不同ph介质中降解的gpc谱图；

图4为刷状聚合物phf-g-(pcl-peg)在ph5.0反应13天后降解产物的¹hnmr谱图；

图5为phf-g-(pcl-peg)胶束的粒径分布(dls图)及形貌图(tem图)；

图6为phf-g-(pcl-peg)载药胶束的粒径分布(dls图)及形貌图(tem图)；

图7为phf-g-(pcl-peg)载药胶束在不同ph缓冲溶液中的药物释放行为示意图；

图8为a549细胞在不同孵育时间下对phf-g-(pcl-peg)载药胶束的细胞吞噬行为荧光强度统计图；

图9为phf-g-(pcl-peg)胶束对a549细胞的细胞毒性；

图10为phf-g-(pcl-peg)载药胶束对a549细胞的细胞毒性。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例l、phf的合成

将葡聚糖(1.51g，9.32mmol，以最小重复单元分子量计算)加入含有30ml超纯水的圆底烧瓶中，高碘酸钠(4.69g，21.92mmol)溶解在35ml超纯水中，然后将高碘酸钠溶液在低于5℃的温度下缓慢加入上述圆底烧瓶中，反应3小时后过滤除掉残留的碘酸钠。然后滴加5mol/l氢氧化钠与滤液反应直至ph值达到8.0。再将硼氢化钠溶液(0.94g，24.74mmol，溶于10ml超纯水)缓慢加入调好ph值的烧瓶里反应2小时。最后，用1mol/l盐酸调节溶液的ph值约为6.5。反应液透析24小时，冻干得白色固体0.97g，产率78％。

所述phf的结构式如式(2)所示：

实施例2、phf-g-pcl的合成

在氮气保护下将phf(0.40g，2.99mmol，以最小重复单元分子量计算)和ε-己内酯(9.60ml，86.74mmol)溶于含有10ml二甲亚砜的圆底烧瓶中，然后加入催化剂当量的辛酸亚锡。将反应烧瓶的温度控制在约90℃并使其反应过夜。第二天反应瓶冷却至室温后，将溶液浓缩后滴加到20ml冷乙醚中得到沉淀产物。将沉淀固体用二氯甲烷-乙醚体系溶解-沉淀3次进行纯化，得到白色固体8.96g，产率84％。

所述phf-g-pcl的结构式如式(5)所示；

实施例3、phf-g-pcl-cooh的合成

先将phf-g-pcl(1.20g)和丁二酸酐(0.31g，3.10mmol)溶于10ml二氯甲烷中，再加入三乙胺(0.17ml，1.23mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.15g，1.23mmol)。反应在氮气保护下回流过夜。第二天反应瓶冷却至室温后，将溶液浓缩后滴加到20ml冷乙醚中得到沉淀产物。将沉淀固体用二氯甲烷-乙醚体系溶解-沉淀3次进行纯化，得到白色固体0.96g，产率76％。

所述phf-g-pcl-cooh的结构式如下式(6)所示；

实施例4、phf-g-(pcl-peg)的合成

将phf-g-pcl-cooh(1.00g)，二环己基碳二亚胺(0.52g，2.52mmol)和n-羟基琥珀酰亚胺(0.21g，1.83mmol)依次加入到含有20ml二氯甲烷中，室温反应0.5小时后过滤掉不溶物，再向滤液中滴加peg-nh2溶液(3.00g，1.50mmol，溶于5ml二氯甲烷)。室温反应3小时后用20ml乙醚沉淀，将所得沉淀的产物用二氯甲烷-乙醚体系溶解-沉淀3次进行纯化，得到白色固体0.98g，产率60％。

所述phf-g-(pcl-peg)的结构式如下式(1)所示，¹hnmr谱图如图2所示。

实施例5、对照聚合物pcl-peg的合成

在氮气保护下将peg-nh2(0.50g，0.25mmol)和ε-己内酯(0.46ml，4.31mmol)溶于含有10ml二甲亚砜的圆底烧瓶中，然后加入催化剂当量的辛酸亚锡。将反应烧瓶的温度控制在约90℃并使其反应过夜。第二天反应瓶冷却至室温后，将溶液浓缩后滴加到20ml冷乙醚中得到沉淀产物。将沉淀固体用二氯甲烷-乙醚体系溶解-沉淀3次进行纯化，得到白色固体0.74g，产率80％。

所述pcl-peg的结构式如下式(7)所示；

实施例6、phf-g-(pcl-peg)刷状聚合物的酸降解性能

将10mgphf-g-(pcl-peg)分别加入ph7.4和ph5.0的缓冲液中，置于37℃的恒温振荡器里。在第1，3，6，9和13天时分别取出少量样品，用gpc分析不同时刻聚合物分子量的变化，如图3所示，在ph5.0条件下，刷状聚合物分子量逐渐降低，而在ph7.4条件下几乎不变。

图4为刷状聚合物phf-g-(pcl-peg)在ph5.0反应13天后降解产物的¹hnmr谱图。phf的次甲基-o的ha在4.84ppm处的特征峰消失，表明聚缩醛主链的水解。

实施例7、phf-g-(pcl-peg)胶束的制备

采用纳米沉淀法自组装形成棒状胶束，实验方法如下：将20mg聚合物溶解在二甲亚砜/水体系(体积比为5-10)中，搅拌20分钟后，将溶液缓慢滴加到大量超纯水中，然后在室温下快速搅拌1小时后，溶液用超纯水透析除去二甲亚砜后，制得所述phf-g-(pcl-peg)胶束。tem观察其为棒状形貌，长径比为3，平均长度为200nm，与dls结果吻合，如图5所示。

实施例8、phf-g-(pcl-peg)载药胶束的制备

采用纳米沉淀法自组装形成棒状载药胶束，实验方法如下：取50mg聚合物，10mgdox·hcl和10μl三乙胺溶于二甲亚砜/水的体系(体积比为5-10)中，在室温下搅拌脱盐后，将其缓慢滴加到大量超纯水中，然后在室温下快速搅拌1小时后。将溶液用超纯水透析，并通过0.45μm针式过滤器过滤，制得所述phf-g-(pcl-peg)载药胶束。tem观察其为棒状形貌，平均长度为100nm，与dls结果吻合，如图6所示。

用紫外吸收法测定其载药量(dlc)和包封率(dle)，将制备的phf-g-(pcl-peg)载药胶束冻干成粉末后溶于dmso中，测定其在480nm处的紫外吸收值，与dox的标准工作曲线对照，计算公式如下：

载药量(dlc％)＝(胶束中dox的质量/聚合物的质量)×100％

包封率(dle％)＝(胶束中dox的质量/dox投料的质量)×100％

计算得到载药量和包封率分别为11.5％和64.9％，所述phf-g-(pcl-peg)载药胶束的示意图如图1所示。

实施例9、phf-g-(pcl-peg)载药胶束在不同ph介质中的释药行为

在每个透析袋里装有1ml胶束溶液(1mg/ml)，将它们分别浸入20ml不同ph值(ph5.0、ph6.5和ph7.4)的缓冲溶液中。然后在每个预设时刻用移液管吸取200μl溶液进行荧光强度的测定，同时并添加200μl新鲜的缓冲液。最后，用获得的荧光强度数据绘制药物累积释放曲线，如图7所示：a为phf-g-(pcl-peg)载药胶束在ph7.4介质中药物累积释放曲线；b为phf-g-(pcl-peg)载药胶束在ph6.5介质中药物累积释放曲线；c为phf-g-(pcl-peg)载药胶束在ph5.0介质中药物累积释放曲线；d为pcl-peg载药胶束在ph5.0介质中药物累积释放曲线。在ph7.4介质中，药物释放速度较慢，72h累积释放量仅约26％。随着介质ph值降低释药量明显增加，在ph5.0介质中，72h累积释放量已达到77％，而对照组pcl-peg载药胶束在ph5.0条件下，72h累积释放量仅约37％。

实施例10、phf-g-(pcl-peg)载药胶束的细胞吞噬行为

将a549细胞接种于6孔板上(每孔3×10⁵细胞)并放入co2恒温培养箱(37℃)孵育24小时。当孵育完成时，移去培养液并重新加入含有载药胶束(dox含量为2μg/ml)的新鲜培养液。再孵育4小时或8小时后，用胰酶消化贴壁细胞并离心收集，磷酸盐缓冲液清洗收集的细胞数次后转移到96孔板中，通过流式细胞仪测量各组实验的荧光值，如图8所示，phf-g-(pcl-peg)载药胶束的荧光值最大，表明该棒状载药胶束增强了细胞摄取的能力。

实施例11、phf-g-(pcl-peg)胶束及其载药胶束的细胞毒性研究

采用mtt比色法评价phf-g-(pcl-peg)胶束及其载药胶束对a549细胞的增殖抑制效果。实验方法为：将处于对数生长期的a549细胞接种在96孔板中(180μl完全培养液和3000细胞/每孔)，在37℃，co2恒温培养箱中孵育12小时。细胞贴壁后，向每孔中分别加入20μl含有不同浓度的phf-g-(pcl-peg)胶束或phf-g-(pcl-peg)载药胶束的新培养液。继续孵育72小时后，加入10μlmtt溶液(5mg/ml)继续孵育4小时。最后，加入50μl三联液(10％十二烷基硫酸钠+5％异丁醇+0.0lmol/l盐酸)，将其置于恒温培养箱中作用12个小时以充分溶解甲瓒晶体。用bio-tek酶标仪测定每孔中甲瓒溶液在570nm处的吸光度(od值)。细胞存活率活计算公式如下：

细胞存活率(％)＝(od实验组-od空白组/od对照组-od空白组)×100％

其中od实验组表示细胞与胶束孵育后的od值，od对照组表示细胞用完全培养液孵育后的od值，od空自组表示只有完整培养液没有细胞的od值。

如图9所示，phf-g-(pcl-peg)胶束和pcl-peg胶束都显示出无毒性。

如图10所示，phf-g-(pcl-peg)载药胶束细胞毒性与对照组pcl-peg载药胶束相比明显增高，且呈现浓度依赖关系。