本发明属于微流控芯片技术领域，具体涉及膜整合式微流控过滤芯片及其制备方法和用途。
背景技术：
微流控技术用于生物类样本的制备与富集研究已经走过十几年的历程，得益于生命科学、临床医学、新药筛选、检疫、卫生、食品、环境等领域对生物类样本分析技术的广阔市场需求，刺激了大量基于微流控的样本制备富集研究成果的产生，并有少数研究成果已经转化形成自动化和商品化的解决方案。与传统的离心方式或滤膜方式相比，其优势在于，采用微流控技术可以在封闭体系内一次性的获得高浓度的浓缩样本，减少了样本污染、人为操作造成的样本损失，方便实现与下游检测分析的自动化衔接。
而与非生物样本处理工艺不同的是，绝大多数生物类样本经过分离与富集后，需要保持自身的生物活性，同时还可能需要将样本引流至其他检测中。根据生物类样本特征，按照目标体积可以大致分为动植物细胞、真菌孢子、寄生虫卵囊、细菌、病毒、蛋白、核酸等等。早期相关研究，集中于利用微流控芯片设计和加工上的极大灵活性，根据样本中目标的理化特性或生物特性，通过构造出各种形态微结构，直接物理结构拦截细胞或利用特征流体间接分离出细菌等。但是，此类方法对于成分复杂的样本（如血液），样本存在大量干扰物质，会直接影响微结构的作用效果，甚至导致芯片功能的丧失。而对于细菌类粒径微小的目标物来说，若要进行物理结构的拦截，需要实现0.1-1微米精度的加工，对工艺要求极高，传统的芯片制作方法更是难以实现。近年来，研究者开始着眼于将各类新技术与微流控芯片整合，来实现更复杂的样本制备与富集过程，如基于吸附填料的生物样本核酸或蛋白的富集；基于流体力学或免疫生物学的血液中循环肿瘤细胞的分离；基于液-液萃取、固相萃取和分离的特征细胞代谢产物的分离；结合磁场、电场、声场等实现样本中细胞、细菌、真菌酵母的富集分离等。借助外部设备，各类相关应用在微流控芯片上得以实现。然而，这些新技术的商品化发展，严重受到了其高额技术成本的制约，导致其在实际应用中无法满足市场廉价易用的需求，致使只有少数产品脱颖而出，并仅能应用于高端消费的医学领域。对于真菌、细菌类样本为主的检验检疫、卫生、食品、环境等低消费领域来说，既需要高效能的技术提升领域技术水平，又要考虑到操作简单、成本低廉。
为了解决这类问题，大量研究将多孔膜被引入到微流控芯片中，依靠多孔膜提供的高密度细孔可物理拦截各类生物样本，其细小孔径可用于滤过细菌乃至病毒，性能完全超越需要高精度加工才能实现的微流控结构，同时降低了微流控芯片的加工成本。将多孔膜的亲水性、生物亲和性、超细过滤能力和微流控的液体操纵能力整合一体，使得微流控芯片不借助额外设备便可完成样本中生物类目标的拦截富集。绝大多数研究中，最简单有效的膜固定方法是直接将多孔膜夹于两层微流控基底之间，利用微流控基底管道与膜之间形成的腔室来储存样本，大量研究采用这种方法完成了样本中细胞的分离与富集，并直接在膜上开展各种试验。然而，这种方式，最大的问题是，当膜夹于基底时，由于膜厚度会使其边缘会与基底间产生缝隙。因此，大量研究采用机械力减少缝隙，但这并不从本质上解决问题，同时也使芯片使用变得繁琐。而以细胞为目标的分析试验通常采用这种方法的原因是，在膜与基底间的细小缝隙不足以让细胞通过，膜能够起到拦截的作用。然而，对于粒径更小的真菌或细菌来说，这种方法并不可靠，原因是膜边缘与基底间始终存在微小缝隙，在样本通过滤过拦截的过程中，会有部分细菌颗粒从缝隙漏出，特别是在目标浓度不高的情况下，这种现象导致滤膜不能完全发挥其高效的拦截作用，严重影响富集效率。在此应用中，膜与微流控芯片的有效整合，成为关键的技术难题。利用密封剂填充缝隙，一直是看似可行的方法，由于受到膜的亲水性以及微流控芯片微腔体的影响，当密封剂接触到膜或者微腔体时，会迅速浸润膜与腔体。随着膜边缘缝隙的填充，大部分膜与腔体同时被封死并丧失了基本功能，制作成功率极低。上述原因致使多孔膜整合微流控过滤芯片无法应用到细菌类样本的处理中，相关研究少之又少。为了解决这一问题亟需开发一种全新的多孔膜整合微流控过滤芯片及其制作方法使其能够克服以上的缺陷。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种低成本、效率高的微流控过滤芯片及其制备方法和用途。
本发明提供的微流控过滤芯片，是基于膜整合技术的，要解决的主要问题是如何简单、快速地将多孔膜完全整合在微流控芯片中，使之既保留多孔膜的高效滤过作用，又同时具有微流控芯片对微升流体的操控能力，解决微流控芯片对真菌孢子、细菌类样本的低成本、高效处理问题，从而拓展微流控芯片的应用范围。具体而言，就是利用微流控管道对密封剂加以操控，使之能够按照制作需要将芯片中多孔膜边缘的缝隙去除，使膜完全整合入芯片，解决芯片漏液问题。
本发明提供的膜整合式微流控过滤芯片（亦称微流控滤芯），是在现有的微流控芯片的刻有微流控通道的上、下基板之间由密封剂密封了一用于过滤的多孔膜组成，形成三层结构。
上述的微流控滤芯中，所述的多孔膜是指各类具有多孔结构的材料，如具有不规则孔形的纺织多孔膜、硝酸纤维膜、聚酯纤维等高分子基多孔膜，以及具有规则孔形的聚碳酸酯、聚四氟乙烯等高分子多孔膜。所述的密封剂是指在一定条件下，可通过化学交联或物理交联发生固化的高分子试剂，包括：温敏型试剂，如：聚二甲基硅氧烷（pdms）等，光敏型试剂，如聚丙烯酰胺等，硅酮胶，配方型胶水等。所述的基底是指以亚克力、玻璃、树脂、聚硅氧烷、金属为基板，其表面通过机械加工、模具注塑、模具浇筑等加工工艺形成微结构管道和腔体凹槽。所述的密封剂可以与基底材料交联或互溶。
本发明提供的上述微流控滤芯的制备方法，具体步骤如下：
步骤1.制作基底，基底分为上下两层。在上、下基底表面对应位置分别加工形成环形槽，当上、下基底对合后形成环形“密封试剂控制管道”；同时，在上层基底的环形槽区域中心加工1个通孔作为进样孔（即微流控芯片的进液孔），中心位置加工出微流控芯片的腔体凹槽（通道）；环形槽上打通加工出2至6个密封剂注入孔（例如，6个密封剂注入孔，编号a1-a6）和相同数量的排气孔（例如，排气孔，编号b1-b6），注入孔与排气孔沿管道交替排列（例如顺序：a1-b1-a2-b2-……-b6-a1）。下层基底的环形槽区域内加工1个或多个通孔作为出样孔；
步骤2.将多孔膜裁切成与基底中的环形密密封管道所围区域相符合的尺寸，并多孔膜裁的边缘处于环形密封管道中间。参见图2所示；例如，使其满足：r膜=r外-w密/2±w密/4，r膜指多孔膜半径，r外指环形密封管道外壁半径；w密指密封管道宽度；
步骤3.将裁切好的多孔膜夹于两片基底层之间形成三明治结构，两片基底层上的环形密封槽重合形成环形密封管道，膜边缘落于管道中央，依靠材料自身粘性或外力固定并压紧基底；
步骤4.从密封剂注入孔匀速注入密封剂，密封剂可浸润管道内的多孔膜，管道内空气从排气孔排出，待密封剂刚好流至排气孔时，立刻停止注液；
步骤5.采用密封剂固化方法迅速固化密封剂，如紫外、加热等迅速使密封剂固化，制得微流控滤芯。
上述的微流控滤芯的制作方法中，所述的外力固定并压紧基底的过程，可使用外部夹具夹住三明治结构，加适当压力，确保密封剂注入环形管道。
本发明提供的上述微流控过滤芯片的通用操作方法，具体步骤如下：
步骤1：根据实验要求，选择不同孔径的微流控过滤芯片对不同的检测目标进行拦截，应满足d目标>d多孔膜，d目标指检测目标直径，d多孔膜指多孔膜最大孔隙直径；
步骤2：样品由进样口注入微流控过滤芯片，真菌溶液、细菌溶液、虫卵溶液注入速度为15-30μl/s,细胞溶液注入速度为2-10μl/s，样品注入时间10s-10min；
步骤3：收集多孔膜拦截到的生物颗粒，用于进一步的检测分析。
生物颗粒的检测方法很多，其中pcr检测方法和荧光显微镜法应用比较广泛。
方法1：pcr检测方法。此方法首先使用裂解液对多孔膜拦截到的生物颗粒进行裂解。裂解完成后，使用特定的引物组对其进行鉴定，1-2h即可完成反应，实验结果可以通过凝胶电泳进行分析。最近，实时定量荧光pcr(rt-pcr)发展迅速，与常规pcr技术不同，rt-pcr不通过凝胶电泳进行扩增结果分析，而是通过荧光信号对pcr过程进行实时检测，因此与pcr检测方法相比，rt-pcr检测方法更加简便快捷。
方法2：荧光显微镜法。此方法是检测生物颗粒的另一种常用方法。收集在液体缓冲液或者其它介质溶液中的生物颗粒经过荧光染料染色后经过适宜波长入射光照射可发出荧光，因此可以通过在荧光显微镜完成计数。荧光显微镜法可以对所有活性真菌和细菌进行计数。此外，如果将荧光显微镜与装有图像分析系统的计算机相连接，就可以实现样品的高通量自动化计数。
本发明采用微流控“密封剂控制管道”的设计，实现了密封剂操控。利用密封剂对膜边缘缝隙的填充与对少部分膜边缘的浸润，以及封闭剂与基底的交联或互溶，完成膜与基底的完全整合，首次实现了在微流控芯片中最大化保留多孔膜有效滤过能力的目的。同时，利用基底表面微管道与膜形成的空腔实现微流控过滤芯片的构建。多孔膜材料种类繁多，孔径变化范围大，因此满足不同生物颗粒的不同需求。此外，在保证高捕获效率的基础上，多孔膜不会对生物颗粒造成损伤。该芯片既具有微孔滤膜的良好亲水性、超细颗粒拦截能力、优异的生物相容性，又具有微流控芯片对流体精细操控的优势，作为通用型模块更可与其他微流控功能单元联用，其制作方法简单，通用性强，可与各种设计结合使用。
上述的微流控滤芯可用于分离、分析、鉴别或鉴定等领域。
本发明的具体效果如下：
本发明利用液体控制管道的设计，对密封剂进行准确控制，实现了简单、高效、低成本、不依靠外部设备的膜与芯片基底的完全整合。利用这种新型微流控滤芯制备方法，能够完全消除膜与芯片基底间的缝隙，消除漏液现象，同时保证制作后90%以上的膜不被密封剂浸润封死，最大化保留膜的有效面积。能够使所得芯片既具有多孔膜高亲水性、高密度孔隙分布、高精度孔径的优点，有具有微流控芯片易加工、优异的生物相容性和流体操控能力的有点。使具有膜整合芯片具有高效富集细菌类样本的能力。
附图说明
图1.芯片基底、多孔膜组合关系示意图。其中，多孔膜夹于上下层基底之间，上、下层基底中间部位对应位置加工有环形密封剂控制槽，上、下层基底对合后形成环形密封剂控制管道，在上层基底中心部位加工有进样孔，在环形密封剂控制槽处加工有一个密封剂注入孔和若干个排气孔；在下层基底的环形密封剂控制槽内加工有若干个出样孔。
图2.多孔膜尺寸要求及安放位置示意图。其中，r膜=r外-w密/2±w密/4，r膜指多孔径；r外指密封管道环形外壁半径；w密指密封管道宽度；多孔膜边缘夹于密封管道处。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：基于聚二甲基硅氧烷（pdms）的膜整合式微流控滤芯的制备。
步骤1.采用pdms预聚体和固化剂制备以质量比选取2:1至20:1的任意比例混合，采用倒模法分别制备出带有密封剂控制管道图案的上下两层基底。同时，在上层基底操纵管道环绕区域中心加工1个通孔作为进样孔，中心位置加工出腔体凹槽，密封试剂操纵管道上打通加工出2至6个密封剂注入孔（编号a1-a6）和相同数量的空气排除孔（编号b1-b6），注入孔与排气孔沿管道交替排列（顺序：a1-b1-a2-b2-……-b6-a1）。下层基底的操纵管道环绕区域内加工1个或多个通孔作为出液孔；
步骤2.将0.1至12微米孔径的范围内的聚碳酸酯多孔膜裁切至指定尺寸，参照图2说明；
步骤3.参照图2将裁切好的膜夹于两层基底之间，压紧；
步骤4.制备密封剂，采用pdms预聚体和固化剂制备以质量比选取2:1至20:1的任意比例混合。从密封剂注入孔匀速注入密封剂，密封剂可浸润管道内多孔膜，并排出管道内空气，待密封剂刚好流至排气孔，立刻停止注液；
步骤5.将芯片置于50至140摄氏度高温处理，迅速固化密封剂，制得微流控滤芯。
实施例2：基于丙烯酸塑料（亚克力/pmma）的膜整合式微流控滤芯的制备。
步骤1.采用雕刻法或注塑法分别制备出带有密封剂控制管道图案的上下两层基底。同时，在上层基底操纵管道环绕区域中心加工1个通孔作为进样孔，中心位置加工出腔体凹槽，密封试剂操纵管道上打通加工出2至6个密封剂注入孔（编号a1-a6）和相同数量的空气排除孔（编号b1-b6），注入孔与排气孔沿管道交替排列（顺序：a1-b1-a2-b2-……-b6-a1）。下层基底的操纵管道环绕区域内加工1个或多个通孔作为出液孔；
步骤2.将0.1至12微米孔径的范围内的聚碳酸酯多孔膜裁切至指定尺寸，参照图2说明；
步骤3.参照图2将裁切好的膜夹于两层基底之间，压紧；
步骤4.采用紫外聚合型亚克力粘合剂，从密封剂注入孔匀速注入密封剂，密封剂可浸润管道内多孔膜，并排出管道内空气，待密封剂刚好流至排气孔，立刻停止注液；
步骤5.将芯片置于紫外灯辐射下10秒到5分钟，迅速固化密封剂，制得微流控滤芯。