一种低聚壳聚糖磁珠的、制备方法及其应用与流程

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种低聚壳聚糖磁珠、制备方法及其应用。

背景技术：

致病菌的污染是影响食品安全和人类健康的重要问题之一。据who统计，全球每年约数亿的腹泻病理，导致300万5岁以下儿童死亡。同时每年因致病菌污染食品而造成的直接或间接的经济损失达数千亿美元。而致病菌在传播过程中由于样品基质复杂、细菌含量低等原因，给细菌快速检测带来了巨大的困难。目前我国和世界上大多数国家针对痕量细菌的检测工作都是通过增菌培养的方式来提高检测灵敏度，但该过程容易造成二次污染，且非常耗时，一般需要16～48h，大大降低了检测结果的时效性和应对突发事件的能力。

壳聚糖是除纤维素外的第二大天然聚合物，价格低廉，无毒，具有较高的生物相容性和生物降解性能。cn103263895b、cn201610212609和cn201610585478等专利中记载的壳聚糖磁珠则是利用壳聚糖的表面基团或对其进行改性，然后检测重金属或丙烯酰胺等小分子化合物。研究表明，壳聚糖对细菌也具有一定的吸附能力。但是，单纯使用壳聚糖吸附细菌不能够快速与样品进行分离。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种低聚壳聚糖磁珠的、制备方法及其应用，解决现有的壳聚糖磁珠用于检测重金属或丙烯酰胺等小分子化合物以及单纯使用壳聚糖吸附细菌效率低的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：

一种低聚壳聚糖磁珠的制备方法，包括：将低聚壳聚糖溶液、fe3o4纳米磁珠和抗氧化剂混合均匀后加入交联剂，在25～65℃下搅拌，完成初次包裹；将初次包裹后的低聚壳聚糖磁珠再与低聚壳聚糖溶液、抗氧化剂混合，在25～65℃下搅拌，搅拌过程中至少一次加入交联剂，完成二次包裹；然后去除表面残留的低聚壳聚糖，得到低聚壳聚糖磁珠。

具体的，初次包裹中，fe3o4纳米磁珠与低聚壳聚糖的质量比为1～5：100。

具体的，二次包裹中，初步包裹后的低聚壳聚糖磁珠与低聚壳聚糖的质量比为5～10：100。

具体的，该制备方法具体包括以下步骤：

步骤一：将fe3o4纳米磁珠与低聚壳聚糖混合，加入抗氧化剂溶液作为溶剂，超声搅拌至分散均匀，然后加入交联剂，在400～800r/min，25～65℃下搅拌1～3h，最后用乙酸和纯水交替洗涤，去除残留的低聚壳聚糖，得到初次包裹的低聚壳聚糖磁珠；

步骤二：将初次包裹的低聚壳聚糖磁珠与低聚壳聚糖混合，加入抗氧化剂溶液，再次超声分散，在100～400r/min，25～65℃下搅拌3～5h，并每隔20～30min加入交联剂，然后磁分离，用乙酸溶液和纯水交替洗涤，去除残留的低聚壳聚糖，得到低聚壳聚糖磁珠。

具体的，所述的低聚壳聚糖的制备过程包括：将乙酰化程度在50％～95％的壳聚糖溶解在乙酸溶液中，在25～60℃超声，并伴随机械搅拌1～3h，在搅拌过程中每隔20～30min加入冰醋酸，维持溶液中醋酸浓度为1％～2％；然后至少一次的加入h2o2，每次搅拌10～30min，得到低聚壳聚糖；其中h2o2在溶液中的浓度为0.5％～5％。

优选的，所述的fe3o4纳米磁珠在被低聚壳聚糖包裹前表面经过硅烷基改性或油酸改性。

具体的，交联剂的加入量为0.5～2ml；所述的交联剂为戊二醛或1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液。

具体的，抗氧化剂的加入量为0.01～0.1g；所述的抗氧化剂为抗坏血酸或还原型谷胱甘肽。

本发明还公开了一种低聚壳聚糖磁珠，该磁珠通过上述制备方法制备得到；所述的磁珠包括fe3o4纳米磁珠和包覆在fe3o4纳米磁珠表面的低聚壳聚糖。

本发明还公开了上述制备方法制备的低聚壳聚糖磁珠用于吸附细菌的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明结合壳聚糖对细菌的吸附能力和磁性纳米材料的超顺磁性，制备了低聚壳聚糖磁珠，用于快速吸附并分离样品中的细菌。使用低聚壳聚糖制备的磁珠粒径小，对细菌的吸附效率高。

(2)本发明的经过两次包被的低聚壳聚糖磁珠，细菌吸附效率可达到100％。

(3)本发明所制备的低聚壳聚糖磁珠最大限度的保留了低聚壳聚糖的侧链-nh2，氨基具有较高的生物活性，可以与较多的生物活性物质发生反应，同时通过调整ph可以使其带正电荷，而细菌整体上带负电荷，因此可以通过正负电荷的吸引，对细菌进行富集。

(4)本发明使用分次加入h2o2的方式充分降解多聚壳聚糖，解决了壳聚糖制备磁珠过程中颗粒大小不均匀、粒径较大、磁响应性弱等不足，能够在30min内完成对样品中痕量细菌的吸附分离工作，大大提高了细菌检测工作效率和灵敏度，同时为实现自动化检测奠定了基础。

附图说明

图1是实施例1制备的低聚壳聚糖磁珠的形貌图。

图2是实施例1制备的低聚壳聚糖磁珠吸附细菌后的形貌图。

图3是实施例1制备的低聚壳聚糖磁珠的吸附效果对比，(a)104cfu沙门氏菌取100μl涂布结果，(b)实施例1制备的低聚壳聚糖磁珠吸附后取100μl上清涂布结果。

图4是fe3o4纳米磁珠表面经过不同处理制的低聚壳聚糖磁珠的吸附效果对比，(a)不经磁珠吸附直接涂布；(b)硅烷基改性制备的低聚壳聚糖磁珠吸附后涂布结果；(c)不经改性的低聚壳聚糖磁珠吸附后涂布结果；(d)放置2个月后的不经改性低聚壳聚糖磁珠吸附后涂布结果；(e)羧基磁珠制备的低聚壳聚糖磁珠吸附后涂布结果。

图5是包裹一次和包裹两次的低聚壳聚糖磁珠的吸附效果对比，(a)不经磁珠吸附直接涂布；(b)两次包裹的低聚壳聚糖磁珠吸附后涂布结果；(c)一次包裹的低聚壳聚糖磁珠吸附后涂布结果。

图6是不同水解方式制备低聚壳聚糖磁珠吸附效果对比，(a)不经磁珠吸附直接涂布；(b)nano2水解的低聚壳聚糖磁珠吸附后涂布结果；(c)h2o2水解的低聚壳聚糖磁珠吸附后涂布结果。

图7是细菌缓冲液在不同ph条件下低聚壳聚糖磁珠的吸附效果对比，(a)不经磁珠吸附直接涂布；(b)ph3.5条件下吸附后涂布结果；(c)ph4.5条件下吸附后涂布结果；(d)ph5.5条件下吸附后涂布结果；(e)ph6.5条件下吸附后涂布结果；(f)ph7.5条件下吸附后涂布结果。

以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。

具体实施方式

本发明结合壳聚糖对细菌的吸附能力和磁性纳米材料的超顺磁性，制备了低聚壳聚糖磁珠，具体包括以下步骤：

步骤一：将fe3o4纳米磁珠与低聚壳聚糖混合，加入抗氧化剂溶液作为溶剂，超声搅拌至分散均匀，然后加入交联剂，在400～800r/min，25～65℃下搅拌1～3h，最后用乙酸和纯水交替洗涤，去除残留的低聚壳聚糖，得到初次包裹的低聚壳聚糖磁珠；

步骤二：将初次包裹的低聚壳聚糖磁珠与低聚壳聚糖混合，加入抗氧化剂溶液，再次超声分散，在100～400r/min，25～65℃下搅拌3～5h，并每隔20～30min加入交联剂，然后磁分离，用乙酸溶液和纯水交替洗涤，去除残留的低聚壳聚糖，得到低聚壳聚糖磁珠。

其中，初次包裹中，fe3o4纳米磁珠与低聚壳聚糖的质量比为1～5：100。二次包裹中，初步包裹后的低聚壳聚糖磁珠与低聚壳聚糖的质量比为5～10：100。

其中，交联剂的加入量为0.5～2ml；交联剂为戊二醛或1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液。

其中，抗氧化剂的加入量为0.01～0.1g；抗氧化剂为抗坏血酸或还原型谷胱甘肽。

其中，本发明的低聚壳聚糖可以是市售，也可以通过以下方法制备，但优选本发明的制备方法，具体包括：首先将乙酰化程度在50％～95％的壳聚糖(市售)溶解在乙酸溶液中，在25～60℃超声，并伴随机械搅拌1～3h，在搅拌过程中每隔20～30min加入冰醋酸，维持溶液中醋酸浓度为1％～2％，使壳聚糖充分溶解；然后至少一次的加入h2o2，每次搅拌10～30min，进一步使壳聚糖充分降解，得到低聚壳聚糖；其中h2o2在溶液中的浓度为0.5％～5％。经过本发明制备方法制备的低聚壳聚糖充分降解，解决了壳聚糖制备磁珠过程中颗粒大小不均匀、粒径较大、磁响应性弱等不足。

本发明中的fe3o4纳米磁珠可以是裸磁珠，也可以是表面经过硅烷基改性、油酸改性、柠檬酸改性、羧基改性的磁珠，优选的，本发明中的fe3o4纳米磁珠在被低聚壳聚糖包裹前表面经过硅烷基改性或油酸改性。

通过下述实施例中低聚壳聚糖磁珠的形貌图综合能谱测定，本发明的制备方法制备的低聚壳聚糖磁珠包括fe3o4纳米磁珠和包覆在fe3o4纳米磁珠表面的低聚壳聚糖，

本发明制备方法制备的低聚壳聚糖磁珠可以用于快速吸附并分析样品中的细菌，用于后续检测，具体吸附过程一般为：将含有细菌的液体样品进行初步过滤，所用滤纸孔径为1～120μm(固体样品先经过无菌水均质化后在进行过滤)，滤液中加入tris-hcl，稀释，调节溶液ph至5.5～6.5，摇匀后加入本发明制备的低聚壳聚糖磁珠，轻微震荡吸附10～20min，磁分离，即得磁珠-细菌复合物。

以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

实施例1

将2g乙酰化程度为95％的壳聚糖溶解在50ml1％乙酸溶液中，300w，40℃超声，并伴随500rpm机械搅拌，搅拌子直径35mm，促进壳聚糖溶解，超声搅拌时间2h；在壳聚糖溶解过程中每隔20min加入150μl30％冰醋酸，维持醋酸浓度在1％左右；

待壳聚糖充分溶解，加入0.5mlh2o2，300rpm搅拌20min后，再次加入0.2mlh2o2，重复以上操作9次，得到充分降解的低聚壳聚糖。

初步包裹：将新鲜制备的20mg/ml油酸改性fe3o4纳米磁珠与低聚壳聚糖混合，低聚壳聚糖与磁珠的质量比为＝5：100，溶剂为0.05％的抗坏血酸水溶液，超声搅拌5min至分散均匀，然后加入1ml5％戊二醛交联剂，500rpm，40℃搅拌，2h。所得产物静置30min，磁分离，产物用1％乙酸和超纯水交替洗涤，去除残留的低聚壳聚糖。

二次包裹：将低聚壳聚糖与初步包裹的低聚壳聚糖磁珠按照10：100的质量比混合，再次经过5min超声分散，150rpm，40℃条件下持续搅拌3h，并每隔20min加入1ml5％戊二醛，然后磁分离，并用1％乙酸溶液和超纯水交替洗涤6次。最终得到低聚壳聚糖磁珠。如图1所示为本实施例得到的低聚壳聚糖磁珠的形貌图，从图1可以看出，所得低聚壳聚糖磁珠表面较为光滑，粒径约为500±20nm，粒径均匀。

将本实施例制备的低聚壳聚糖磁珠用于细菌的吸附：将沙门氏菌稀释至10⁶cfu/ml，取0.1ml菌液加入到10ml无菌水中(104cfu/ml)，用1mtris-hcl调ph至5.5，然后加入50μl本实施例制备的低聚壳聚糖磁珠，40rpm室温震荡吸附20min，磁分离，如图2所示，为本实施例磁珠吸附细菌的sem图。然后取100μl上清涂布，37℃过夜培养，检测发现磁珠无菌落生长，表明所有细菌均被磁珠吸附，且效率高达100％，吸附效果如图3(b)所示，无菌落生长。图3(a)所示为104cfu沙门氏菌取100μl涂布结果，作为对比组，对比发现，本实施例制备的磁珠对细菌的吸附率很高。

根据实施例1，分别将2g乙酰化程度为55％、70％、85％的壳聚糖溶解在50ml1％乙酸溶液中，后续制备过程同实施例1。得到的低聚壳聚糖磁珠的吸附效率，采用95％乙酰化壳聚糖制备的低聚壳聚糖磁珠无菌落生长，细菌吸附效率高达100％，远高于采用其他乙酰化程度的壳聚糖组。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：初次包裹时的搅拌温度为25℃，二次包裹时的搅拌温度为25℃。

将本实施例制备的低聚壳聚糖磁珠用于沙门氏菌的吸附，细菌吸附效率为79％左右。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：初次包裹时的搅拌温度为60℃，二次包裹时的搅拌温度为60℃。

将本实施例制备的低聚壳聚糖磁珠用于沙门氏菌的吸附，细菌吸附效率为86％左右。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：初次包裹时fe3o4纳米磁珠与低聚壳聚糖的质量比为2：100；二次包裹时初步包裹后的低聚壳聚糖磁珠与低聚壳聚糖的质量比为8：100。

将本实施例制备的低聚壳聚糖磁珠用于沙门氏菌的吸附，细菌吸附效率为82％。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：fe3o4纳米磁珠表面经过硅烷基改性。

将本实施例制备的低聚壳聚糖磁珠用于沙门氏菌的吸附，细菌吸附效率效果如图4(b)所示。说明经过硅烷基改性的fe3o4纳米磁珠制备的低聚壳聚糖磁珠对细菌的吸附效果较好。

实施例6

本实施例与实施例1的区别在于：交联剂采用1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液。

将本实施例制备的低聚壳聚糖磁珠用于沙门氏菌的吸附，细菌吸附效率效果同实施例1。

实施例7

本实施例与实施例1的区别在于：抗氧化剂采用还原型谷胱甘肽。

将本实施例制备的低聚壳聚糖磁珠用于沙门氏菌的吸附，细菌吸附效率效果同实施例1。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于：fe3o4纳米磁珠表面不经过改性处理。

将本对比例制备的低聚壳聚糖磁珠用于沙门氏菌的吸附，细菌吸附效率如图4(c)所示，基本与实施例1相同，但不经过改性处理的裸磁珠包被低聚壳聚糖后保存时间较短，如图4(d)所示为放置2个月后的不经改性低聚壳聚糖磁珠吸附细菌后上清液涂布的效果，可以看出，吸附效果没有实施例1和实施例5好。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于：fe3o4纳米磁珠表面经过羧基改性。

将本对比例制备的低聚壳聚糖磁珠用于沙门氏菌的吸附，细菌吸附效率如图4(e)所示，对细菌的吸附效果相较于实施例1差。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于：低聚壳聚糖溶液和fe3o4纳米磁珠仅经过初次包裹。

将本对比例制备的低聚壳聚糖磁珠用于沙门氏菌的吸附，细菌吸附效率如图5所示，且只经过一次包裹的低聚壳聚糖磁珠的吸附效率约为70％。从图5(a)为不经磁珠吸附直接涂布的效果，图5(b)为两次包裹的效果，图5(c)为一次包被的效果，可以明显看到，只经过一次包裹的低聚壳聚糖磁珠的吸附效率明显低于两次包裹。

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于：使用nano2对壳聚糖进行降解，具体为：待壳聚糖充分溶解后加入40mgnano2150rpm搅拌3h，得到充分降解的低聚壳聚糖。

将本实施例制备的低聚壳聚糖磁珠用于沙门氏菌的吸附，细菌吸附效率如图6所示，图6(a)为不经磁珠吸附直接涂布的效果，图6(b)为nano2降解后磁珠吸附后涂布的效果，图6(c)为h2o2法降解的涂布效果，可以明显看到，通过nano2降解获得低聚壳聚糖磁珠基本不能吸附细菌，nano2降解的过程中破坏了壳聚糖的活性基团。而本发明采用h2o2法降解的壳聚糖保留了大多数的活性基团，制备的低聚壳聚糖磁珠吸附后上清无菌落生长，表明所有细菌均被磁珠吸附，效率高达100％。

同实施例1，本发明还对低聚壳聚糖磁珠用于细菌的吸附过程中使用不同ph值的tris-hcl缓冲液的吸附性能进行测试，tris-hcl的ph值分别为3.5、4.5、6.5、7.5，吸附效率如图7所示。可以看出，当溶液最终ph在5.5时的吸附效率最高，为100％，如图7(d)所示；ph为6.5和7.5时的吸附效率为80％左右，ph为3.5和4.5时的吸附效率为40％左右。