以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质及其制备方法与流程

本发明涉及一种以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质及其制备方法，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。

背景技术：

抗体产品往往纯度要求较高，同时还必须保持生物活性，因此传统的分离过程往往难以满足要求。蛋白a或蛋白g亲和层析介质能够特异性结合抗体，但蛋白类亲和配基易脱落，重复使用次数低，且介质价格昂贵，使用成本极高，限制了规模化应用。传统的离子交换层析和疏水相互作用层析等方法虽然能够结合抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，纯化效果有限。因此，开发具有抗体选择性的非蛋白类配基是研发重点。

针对抗体分离的非蛋白配基主要有仿生亲和配基和多肽配基等，这些配基往往过于关注特异性和亲和力，造成抗体洗脱条件较为苛刻或者收率较低。混合模式层析是一种新型的生物分离技术，配基兼有多种功能基团，可以与目标蛋白产生疏水和静电等多种相互作用。混合模式介质的配基密度通常较高，吸附容量大，具有耐盐吸附特性，洗脱条件温和，特别适合于大规模的分离纯化，已在抗体等蛋白的分离纯化中得到应用。混合模式层析的关键是特殊设计的、组合多种相互作用的功能配基。专利cn101402671b、cn101899110b和cn101948535a报道了以巯乙基吡啶、巯甲基咪唑和巯基苯并咪唑为配基的混合模式层析介质从畜禽血液中分离免疫球蛋白，具有步骤简单、分离效率高、成本低廉的特点。专利ep2459308a1报道了以苯并噻唑类化合物作为配基的混合模式层析介质的制备过程，实现多种蛋白的分离纯化。专利us6919436b2和cn1972961b报道了苯并噻唑类化合物作为层析介质的分离配基，偶联到琼脂糖基质，用于血清或血浆等蛋白的分离纯化。wang等(j.chromatogr.b,2013,936:33)采用混合模式介质bestarosediamondmma、bestarosediamondmmc、mephypercel和ppahypercel介质从模拟血清中分离igg，其中bestarosediamondmma介质同时吸附igg和hsa，吸附选择性差；bestarosediamondmmc和ppahypercel介质存在抗体洗脱困难，不利于实际分离应用；mephypercel介质主要吸附igg，但仍结合少量hsa，igg的选择性一般。因此，开发性能更优良的混合模式介质，对于抗体的大规模分离纯化有着重要的意义。

针对抗体分离，筛选吡啶类、咪唑类、噻唑类和多芳香环类等小分子化合物配基库，进行了配基和igg亲和性表征，发现苯并噻唑基硫代羧酸类化合物对igg亲和性高、耐盐性强，是潜在的抗体分离新型混合模式配基。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质及其制备方法。

以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，配基为经烯丙基溴活化后偶联的苯并噻唑基硫代羧酸，所述的苯并噻唑基硫代羧酸为3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸、2-(苯并噻唑基硫代)乙酸或2-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸中的一种。

当苯并噻唑基硫代羧酸为3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸时，层析介质的结构组成为：

当苯并噻唑基硫代羧酸为2-(苯并噻唑基硫代)乙酸时，层析介质的结构组成为：

当苯并噻唑基硫代羧酸为2-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸，层析介质的结构组成为：

所述的层析介质的结构组成中仅给出了层析基质和一个配基分子结构，仅仅是示例说明，层析基质的表面和内部孔道表面具有大量的配基分子。

所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球，结构式如下：结构式仅给出一个-oh，仅仅是示例性说明，其表面具有大量的-oh。

所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。

所述的层析介质的配基密度为40-140μmol/ml。

所述的以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质的制备方法包括如下步骤：

1)将层析基质抽干后，加入0.2-1倍层析基质质量的20％(v/v)二甲基亚砜、0.1-1倍层析基质质量的烯丙基溴和0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8-48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；

2)将活化层析基质和0.1-0.5倍层析基质质量的n-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1-5小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质；

3)将溴代醇化的基质和0.1-1倍层析基质质量的己二胺以及0.1-1倍层析基质质量的0.5-1m碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的ph为10-12，25℃下150rpm摇床中反应8-48小时，得到氨基化的基质；

4)将氨基化的基质和0.1-0.3倍层析基质质量的苯并噻唑基硫代羧酸、0.4-2倍层析基质质量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、0.8-4倍层析基质质量的n,n-二异丙基乙胺的n,n-二甲基甲酰胺溶液混合，25℃下150rpm摇床中反应8-48小时，得到苯并噻唑基硫代羧酸偶联后的介质；

5)将苯并噻唑基硫代羧酸偶联后的介质抽滤，去离子水洗涤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下150rpm摇床中反应2-8小时，去离子水洗涤，得到以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质。

本发明研制的以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质，可以用于混合模式层析分离，具有以下优点：(1)抗体吸附容量大，处理能力强，higg静态吸附容量可达140mg/ml湿介质；(2)耐盐吸附性强，在较宽的电导率范围(0-100ms/cm)内，吸附容量基本保持不变；(3)洗脱方便，洗脱液ph至3.5附近，就可实现完全洗脱，避免过酸、过碱或高盐等对蛋白结构和活性产生不利影响；(4)介质性质稳定，采用烯丙基溴活化并偶联配基，所得介质的配基稳定，清洗再生方便。本发明所研制的新型混合模式层析介质，以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基，具有显著的混合模式吸附蛋白和层析分离特点，对抗体具有良好的吸附能力和选择性，可以用于抗体的规模化制备。

附图说明

图1是实施例2中偶联3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸的层析介质吸附igg的结合载量分布图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入2g20％(v/v)二甲基亚砜、1g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、1gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和2g己二胺以及1m碳酸钠缓冲(ph12)混合，25℃下150rpm摇床中反应48小时，得到氨基活化基质；取1g氨基活化基质，加入到2ml含3g3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸、60mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和37.5μln,n-二异丙基乙胺的n,n-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下150rpm摇床中反应12小时，去离子水洗涤，得到以3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸为配基的层析介质，配基密度为40μmol/ml。

实施例2

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g20％(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应3小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和3g己二胺以及1m碳酸钠缓冲(ph12)混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时；取1g氨基活化基质，加入到2ml含10g3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸、100mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和64μln,n-二异丙基乙胺的n,n-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下150rpm摇床中反应48小时，去离子水洗涤，得到以3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸为配基的层析介质，配基密度为140μmol/ml。在不同ph和nacl浓度下，测定了介质对人免疫球蛋白igg的结合载量，载量分布图见图1，横坐标为ph，纵坐标为nacl浓度，图中颜色和数值代表结合载量，载量单位为mg/ml介质，可以发现在ph5.0～9.0和0～500mmnacl浓度范围内，igg结合载量都大于100mg/ml介质，最高达到140mg/ml介质，说明吸附容量大，盐浓度对吸附影响小，耐盐吸附特性明显。

实施例3

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入6g20％(v/v)二甲基亚砜、6g烯丙基溴和4g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化25小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、3gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应3小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1.8g己二胺以及0.5m碳酸钠缓冲(ph11)混合，25℃下150rpm摇床中反应16小时；取1g氨基活化基质，加入到2ml含6g3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸、60mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和38μln,n-二异丙基乙胺的n,n-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应15小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下150rpm摇床中反应7小时，去离子水洗涤，得到以3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸为配基的层析介质，配基密度为60μmol/ml。

实施例4

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入3g20％(v/v)二甲基亚砜、2g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、1gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1g己二胺以及1m碳酸钠缓冲(ph12)混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时；取1g氨基活化基质，加入到2ml含2g3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸、20mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和12μln,n-二异丙基乙胺的n,n-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下150rpm摇床中反应5小时，去离子水洗涤，得到以3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸为配基的层析介质，配基密度为45μmol/ml。

实施例5

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g20％(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应3小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和3g己二胺以及1m碳酸钠缓冲(ph12)混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时；取1g氨基活化基质，加入到2ml含10g2-(苯并噻唑基硫代)乙酸、100mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和64μln,n-二异丙基乙胺的n,n-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下150rpm摇床中反应48小时，去离子水洗涤，得到以2-(苯并噻唑基硫代)乙酸为配基的层析介质，配基密度为140μmol/ml。

实施例6

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入2g20％(v/v)二甲基亚砜、1g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、1gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和2g己二胺以及1m碳酸钠缓冲(ph12)混合，25℃下150rpm摇床中反应48小时，得到氨基活化基质；取1g氨基活化基质，加入到2ml含1g2-(苯并噻唑基硫代)乙酸、60mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和37.5μln,n-二异丙基乙胺的n,n-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下150rpm摇床中反应12小时，去离子水洗涤，得到以2-(苯并噻唑基硫代)乙酸为配基的层析介质，配基密度为40μmol/ml。

实施例7

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入3g20％(v/v)二甲基亚砜、2g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、1gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1g己二胺以及1m碳酸钠缓冲(ph12)混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时；取1g氨基活化基质，加入到2ml含2g2-(苯并噻唑基硫代)乙酸、20mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和12μln,n-二异丙基乙胺的n,n-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下150rpm摇床中反应5小时，去离子水洗涤，得到以2-(苯并噻唑基硫代)乙酸为配基的层析介质，配基密度为45μmol/ml。

实施例8

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g20％(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应3小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和3g己二胺以及1m碳酸钠缓冲(ph12)混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时；取1g氨基活化基质，加入到2ml含10g2-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸、100mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和64μln,n-二异丙基乙胺的n,n-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下150rpm摇床中反应48小时，去离子水洗涤，得到以2-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸为配基的层析介质，配基密度为140μmol/ml。

实施例9

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入3g20％(v/v)二甲基亚砜、2g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、1gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1g己二胺以及1m碳酸钠缓冲(ph12)混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时；取1g氨基活化基质，加入到2ml含2g2-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸、20mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和12μln,n-二异丙基乙胺的n,n-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下150rpm摇床中反应5小时，去离子水洗涤，得到以2-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸为配基的层析介质，配基密度为45μmol/ml。