洗涤，并使用0. 01 % NaN3-PBS保存。
[0053] 3.装柱
[0054] 使用结合缓冲液制备浆液，以75 %沉降基质和25 %缓冲液的比例进行混合。以连 续性的操作向柱内倾入浆液。使用一个斜靠在柱内壁上的玻璃棒进行填柱操作，将有助于 减少气泡的产生。填柱后，关闭亲和柱下端的开口，并取下亲和柱的顶端部件。仔细操作， 使用缓冲液加入充填亲和柱的余下部分，以在亲和柱的顶端形成一个向上的弯液面。将顶 端筛板以一定的角度插入到亲和柱中，确保在筛板的下方没有空气。将筛板锁定在基质表 面适当的位置上，打开亲和柱下方的开口，用5倍柱床体积的无菌过滤的0. 01% NaN3-PBS 过柱，并使用0.01% NaN3-PBS保存，至此苯巴比妥和莱克多巴胺复合亲和柱已装填并平衡 完毕，可直接供使用。
[0055] 实例三：饲料中的苯巴比妥和莱克多巴胺的检测
[0056] I. 0饲料中的苯巴比妥和莱克多巴胺的检测
[0057] 饲料添加回收实验，分别添加20 μ g/kg，50 μ g/kg，100 μ g/kg三个浓度梯度。每 个实验做五组平行试验。
[0058] 2. 0饲料中的苯巴比妥和莱克多巴胺的提取：
[0059] 准确称取磨细试样25. Og于250mL具塞锥形瓶中，加入100.0 mL乙腈/0· 3mol/L NaHC03 (1: 1，v/v)溶液，以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取5. OmL滤液 于25mL容量瓶中，用pH7. 4PBS定容至25mL，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。
[0060] 将复合免疫亲和柱连接于10.0 mL玻璃注射器下。准确移取8. OmL样品提取液注入 玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min(l滴/秒） 流速缓慢通过复合免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以2-3mL/min (1-2滴/秒） 流速用10.0 mL水淋洗柱子1次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加 入2. OmL色谱级甲醇洗脱，流速为lmL/min~2mL/min (1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃 试管中，50°C下氮气浓缩吹干后，用流动相定容至0. 5mL，供HPLC分析。
[0061] 3.0高效液相色谱条件
[0062] 苯巴比妥
[0063] 色谱柱！Cloversil-C18, 4. 6 X 250mm
[0064] 流动相：甲醇：水=50:50 (v/v)
[0065] 流速：0· 8mL/min
[0066] 检测器：紫外检测器，波长254nm
[0067] 进样体积：50~IOOuL ;
[0068] 莱克多巴胺：
[0069] 色谱柱：Cloversil-C18, 4. 6 X 25Omm
[0070] 流动相：乙腈：0· 05%三氟乙酸=20 :80(v/v)
[0071] 流速：0· 8mL/min
[0072] 检测器：紫外检测器，波长224nm
[0073] 进样体积：5〇~IOOuL ;
[0074] 4. 0 定量
[0075] 用进样器吸取50 μ L标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标 准溶液的响应值（峰高或峰面积），分别得到标准溶液高效液相色谱图。参考谱图苯巴比妥 1，莱克多巴胺见图2
[0076] 5. 0 结果
[0077] 饲料添加回收率结果都在80-120%之间，CV均小于15%。结果表明该方法完全 满足饲料中苯巴比妥和莱克多巴胺检测的分析要求。结果分别见表1，表2。
[0078] 表1饲料中苯巴比妥添加回收率结果
【主权项】
1. 净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱，其特征在于，制备方法如下： a) 基质制备 称取Ig琼脂糖凝胶基质粉末，溶于lmmol/LHCl中，然后置于烧结玻璃过滤器中使用lmmol/LHCl洗绦 15min; b) 配体偶联 使用偶联缓冲液〇. 2mol/LNaHC03pH8. 3溶解待偶联的抗苯巴比妥单克隆抗体和抗莱 克多巴胺单克隆抗体，获得抗体溶液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗 体溶液中，充分混匀上述的混和物2-4h; c) 配体封闭 封闭所有残留的活性基团，转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0.lmol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h; d) 除去偶联后未偶联上的多余的配体 依次用0.lmol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.lmol/LTris-HCl缓冲液对经步骤c)处理 后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤，至少洗涤3个循环； e) 装柱 用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0. 01 %NaN3-PBS洗涤，并使用0. 01 %NaN3-PBS保存，然 后装柱。
2. 根据权利要求1所述净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱，其特征在于：所 述抗苯巴比妥单克隆抗体采用常规单克隆抗体制备方法制备。
3. 根据权利要求1所述净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱，其特征在于：所 述制备抗苯巴比妥单克隆抗体的抗苯巴比妥单克隆抗体细胞为细胞保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. 9203。
4. 一种净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括： a) 基质制备 称取Ig琼脂糖凝胶基质粉末，溶于lmmol/LHCl中，然后置于烧结玻璃过滤器中使用lmmol/LHCl洗绦 15min; b) 配体偶联 使用偶联缓冲液〇. 2mol/LNaHC03pH8. 3溶解待偶联的抗苯巴比妥单克隆抗体和抗莱 克多巴胺单克隆抗体，获得抗体溶液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗 体溶液中，充分混匀上述的混和物2-4h; c) 配体封闭 封闭所有残留的活性基团，转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0.lmol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h; d) 除去偶联后未偶联上的多余的配体 依次用0.lmol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.lmol/LTris-HCl缓冲液对经步骤c)处理 后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤，至少洗涤3个循环； e) 装柱 用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0. 01 %NaN3-PBS洗涤，并使用0. 01 %NaN3-PBS保存，然 后装柱。
5.利用权利要求1所述复合免疫亲和柱，进行苯巴比妥和莱克多巴胺检测的方法，其 特征在于：包括如下步骤： 用所述复合免疫亲和柱净化待测样液，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，流速为ImL/min~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供HPLC分析； 高效液相色谱条件 苯巴比妥 色谱柱：Cloversil_C18, 4. 6X250mm流动相：甲醇：水=50:50 (v/v) 流速：〇? 8mL/min 检测器：紫外检测器，波长254nm 进样体积：50~IOOuL; 莱克多巴胺： 色谱柱：Cloversil_C18, 4. 6X250mm流动相：乙腈：〇. 05%三氟乙酸=20 :80 (v/v) 流速：〇? 8mL/min 检测器：紫外检测器，波长224nm 进样体积：50~IOOuL; 定量 用进样器吸取50yL标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶 液的响应值，分别得到标准溶液高效液相色谱图。
【专利摘要】本发明公开了一种净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱及其制备方法与应用。本发明采用4％的柱状琼脂糖凝胶作为固相载体，琼脂糖凝胶与本发明制备的苯巴比妥抗体和市场上购买的莱克多巴胺抗体偶联形成免疫吸附剂，装柱制成免疫亲和柱。当含有苯巴比妥和莱克多巴胺的样品通过免疫亲和柱时，免疫吸附剂就会特异性的吸附苯巴比妥和莱克多巴胺，其他的杂质则流出免疫亲和柱，然后用甲醇将苯巴比妥和莱克多巴胺从柱子中洗脱下来，样品得到了很好的净化。建立免疫亲和柱净化-液相色谱法检测苯巴比妥和莱克多巴胺，使检测快捷，精确，安全。CGMCC NO.920320140505
【IPC分类】G01N1-34, B01D15-38, B01J20-281, G01N1-40
【公开号】CN104784973
【申请号】CN201510201533
【发明人】王国民, 陈冬东, 王伟, 唐柏彬, 马吉湘, 李贤良, 果旗, 里南, 董韬, 王雄, 周超, 郗存显
【申请人】重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 中国检验检疫科学研究院, 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心, 北京中检维康生物技术有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月24日