使用mes和mops作为流动相改性剂从多峰树脂洗脱生物分子的制作方法
【专利说明】使用MES和MOPS作为流动相改性剂从多峰树脂洗脱生物分 子
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年10月24日提交的美国申请序列号61/717, 880的优先权，其 通过提述以其整体并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及使用多峰（multimodal)树脂和包含Good' S缓冲液的洗脱缓冲液来纯 化或富集生物分子的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 多峰树脂（也称混合模式树脂）是包含至少两种不同的基团的层析介质，其中所 述基团与靶分子通过至少两种不同的机制相互作用。例如，多峰离子交换剂携带带电基 团（例如，带正电的氨基基团、带正电的季铵基基团、带负电的羧酸基团、带负电的磺酸基 团），所述带电基团可通过电荷-电荷相互作用与靶分子相互作用。这些多峰离子交换剂额 外携带其他可与靶分子通过不同作用模式（如疏水相互作用、范德华相互作用、偶极相互 作用、阳离子-π相互作用或氢键）进行相互作用的基团。
[0006] EP 2 167 526 Bl描述使用包含含有疏水部分和带负电部分的配体的多峰树脂纯 化凝血因子VIII。洗脱用包含高浓度的盐（>1.5Μ)、至少40% (w/v)的乙二醇、丙二醇或其 组合和钙离子的洗脱缓冲液实施。
[0007] US 2011/0160435 Al描述另一使用多峰树脂纯化凝血因子VIII的工艺。洗脱缓 冲液包含至少一种在PH6至8带正电的氨基酸。优选地，所述氨基酸选自下组：赖氨酸、精 氨酸和组氨酸，且所述氨基酸以高于0. 4M，特别是高于0. 5M的浓度使用。
[0008] US 2011/0166332 Al描述用于从液体蛋白制备物通过将所述制备物与多峰阴离 子交换剂接触来分离至少一种非聚集蛋白的方法。实验部分描述使用在20mM Tris、20mM H印es、20mM MES、50mM NaCl中包含IM甘氨酸的洗脱缓冲液及pH9. 0至pH4. 5的线性梯度 分离非聚集IgG。
[0009] 发明概述
[0010] 在第一方面，本发明涉及用于纯化或富集生物分子的方法，所述方法包括如下步 骤：
[0011] (a)提供包含所述生物分子的水溶液；
[0012] (b)将所述水溶液与多峰树脂接触；
[0013] (C)任选地用水性洗涤缓冲液洗涤所述多峰树脂；
[0014] (d)用水性缓冲溶液从所述多峰树脂洗脱所述生物分子，其中所述水性缓冲溶 液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：至少15mM的Good's缓冲液；总浓度为 0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组 氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪 氨酸或缬氨酸中的一种或多种；总浓度为0_400mM的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸 铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、 磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多 种；和O% -60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物；并
[0015] (e)收集包含生物分子的级分，由此获得纯化或富集形式的生物分子。
[0016] 在一个实施方案中，所述水性缓冲溶液包含15mM至2. 5mM的Good's缓冲液，如至 少20mM、50mM、100mM、150mM、200mM或更多的Good's缓冲液。在另一实施方案中，所述水性 缓冲溶液包含10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组 氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪 氨酸和缬氨酸中的一种或多种；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、 氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫 酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和1%-60% (v/v)的乙二 醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0017] 在一个实施方案中，在水性缓冲液中的所述Good' s缓冲液是MES、M0PS或Tris。
[0018] 第二方面，本发明涉及通过根据所述第一方面的方法可获得的纯化的生物分子， 如蛋白。
[0019] 第三方面本发明涉及制备物，其包含：
[0020] (a)生物分子，和
[0021] (b)水性缓冲溶液，所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组 成：至少15mM的至少一种Good's缓冲液；总浓度为0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、 天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；总浓度为 0-400mM的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、辛 酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、 氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和0%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或 乙二醇和丙二醇的混合物。
[0022] 在一个实施方案中，所述水性缓冲溶液包含15mM至2. 5mM的Good's缓冲液，如至 少20mM、50mM、100mM、150mM、200mM或更多的Good's缓冲液。在另一实施方案中，所述水性 缓冲液包含10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨 酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨 酸和缬氨酸中的一种或多种；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯 化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸 镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和1%-60% (v/v)的乙二醇 或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0023] 在一个实施方案中，在所述水性缓冲液中的所述Good' s缓冲液是MES、MOPS或 Tris0
[0024] 第四方面，本发明涉及水性缓冲溶液用于从多峰树脂解吸生物分子的用途，其中 所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：至少15mM的至少一种 Good' s缓冲液；总浓度为0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨 酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝 氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；总浓度为0_400mM的尿素、盐酸 胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、 氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸 钙和牛磺酸中的一种或多种；和0%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混 合物。
[0025] 例如，在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含15mM至2. 5mM的Good' s缓冲 液，如至少20mM、50mM、100mM、150mM、200mM或更多的Good' s缓冲液。在另一实施方案中， 所述水性缓冲液包含10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、 乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯 化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和1% -60% (v/ V)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0026] 在一个实施方案中，在所述水性缓冲液中的所述Good' s缓冲液是MES、MOPS或 Tris0
[0027] 第五方面，本发明涉及水性缓冲溶液用于增加吸附在多峰树脂上的生物分子回收 率的用途，其通过将（a)其上已吸附所述生物分子的多峰树脂与（b)水性缓冲溶液接触， 其中所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：至少15mM的至少一 种Good's缓冲液；总浓度为0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷 氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、 丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；总浓度为0_400mM的尿素、盐酸 胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、 氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸 钙和牛磺酸中的一种或多种；和0% -60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的 混合物。例如，所述用于增加吸附在多峰树脂上的生物分子的回收率的水性缓冲溶液可包 括至少15mM、至少IOOmM或至少200mM的Good' s缓冲液；10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰 胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、 苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；一种或多种 10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化 钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷 酸钙和牛磺酸；和1% -60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0028] 在一个实施方案中，将包含从所述多峰树脂回收的生物分子的溶液应用于超滤/ 渗滤（UF/DF)、切向流过滤（TFF)、微滤（MF)和疏水相互作用层析（HIC)。在一个实施方案 中，将包含从多峰树脂回收的生物分子的溶液应用于HIC。
[0029] 第六方面，本发明涉及制品，其包含：
[0030] (a)包装材料或容器；
[0031] (b)水性缓冲溶液，所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组 成：
[0032] -至少15mM的至少一种Good' s缓冲液；
[0033] -总浓度为0_400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷 氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
[0034] -总浓度为0_400mM的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、 氯化钠、柠檬酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯 化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸；和
[0035] _0%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物；和
[0036] (C)包含用于实施根据第一方面的方法的说明的数据载体。
[0037] 在一个实施方案中，在所述制品中的水性缓冲溶液包括至少15mM、至少IOOmM或 至少200mM的Good' s缓冲液；10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷 氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化铵、硫酸 铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸 钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和 1%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0038] 其他特征和优势将从附图和说明书以及从权利要求显而易见。
[0039] 图简述
[0040] 图1是由包含MES和精氨酸的洗脱缓冲液从多峰层析树脂Capto? Adhere (GE Healthcare)解吸阿加糖酶β的实验的产率的等高线图。等高线图是对于6. 25的pH值计 算。
[0041] 图2是由包含MOPS和精氨酸的洗脱缓冲液从多峰层析树脂Capto? A