L-精氨 酸，比照US 2011/0160435 Al实施例10)或高浓度盐（例如，最多2. 5M的NH4Cl或NaCl，比 照EP 2 167 526 Bl实施例6)的洗脱缓冲液。然而，精氨酸和其他添加剂呈现高导电性，其 对随后通常在多峰树脂层析后实施的纯化步骤（例如，离子交换步骤）不利。具体地，高导 电性可能需要大量稀释或延长的透析次数。此外，高浓度的盐可使生物分子（例如，蛋白） 的四级结构或甚至三级结构变性。如果盐是离液剂（例如，胍盐或高氯酸锂），则变性的风 险特别尚。
[0092] 根据第一方面的方法提供解吸生物分子受到仅包含低浓度的氨基酸（如 0-400mM，如10mM-300mM)和仅包含低浓度的盐或离液剂（如0-400mM，如10-300mM)的洗 脱缓冲液的影响的优势，由此降低生物分子变性的风险并促进随后的纯化步骤。该优势由 在洗脱缓冲液中增加 Good's缓冲液浓度至至少15mM、至少50mM、至少IOOmM或至少200mM 的值实现。Good' s缓冲液由于其在生物研宄中的用途和通常对生物分子具有温和至无影 响而众所周知。因此，本发明的纯化或富集方法相比传统应用的方法更加温和。
[0093] 综上所述，依据本发明生物分子（如蛋白，如酶）的解吸受15mM或更高浓度的 Good' s缓冲液（如50mM、100mM或200mM或更高）与400mM以下浓度的氨基酸的组合或 由15mM或更高浓度的Good' s缓冲液（如50mM、100mM或200mM或更高）与总浓度不超过 60% (v/v)的乙二醇和/或丙二醇的组合影响。当然，所述氨基酸和乙二醇可同时存在。
[0094] 在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸（例如，丙氨酸、精氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）或乙二醇或丙 二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。换而言之，这些实施方案中，如果所述水性缓冲溶液包含 一种或多种氨基酸，则乙二醇和丙二醇的浓度各为〇%。相反地，在这些实施方案中，如果所 述水性缓冲溶液包含乙二醇或丙二醇或两者，则所述一种或多种氨基酸的总浓度为〇mM。
[0095] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含0 % -60 % (v/v)(如1 % -50 % (v/v)、 5%-40% (v/v)、8%-30% (v/v)、10%-25% (v/v)、15%-20% (v/v))的乙二醇。
[0096] 在这些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种 氨基酸通常选自下组：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些 实施方案中不存在天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸和酪氨酸。在第一方面的那些实施方案中，其 中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种氨基酸选自下组：丙氨酸、半胱氨 酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些实施方案 中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和酪氨酸。在第一方面的那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一 种氨基酸，所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。换而言 之，在这些实施方案中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮 氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[0097] 在一个实施方案中，所述至少一种Good's缓冲液选自下组：MES、M0PS、Tris、ADA、 ACES、BES、Bicine、CAPS、CAPS0、CHES、HEPES、PIPES、TAPS 和 TES。在一个实施方案中，所 述至少一种Good' s缓冲液是MES，而在另一实施方案中，所述至少一种Good' s缓冲液是 MOPS0
[0098] 在一个实施方案中，所述生物分子是蛋白（如酶、结构蛋白、转运蛋白、信号蛋白、 跨膜蛋白、肽激素或抗体）或其片段，或核酸（例如，单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、单链 多核苷酸或双链多核苷酸）。核酸可为，例如，DNA、RNA或由DNA和RNA形成的杂交双链。 在一个实施方案中，所述生物分子是酶（例如，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构 酶或连接酶）。例如，在一个实施方案中，所述酶是水解酶，如糖苷酶（经常称为糖苷水解 酶）。在一个实施方案中，所述糖苷酶是α-半乳糖苷酶，如选自下组的α-半乳糖苷酶： 阿加糖酶α (例如，Shire, United Kingdom制造的Replagal1?)和阿加糖酶β (例如，由 Genzyme, Cambridge, MA制造的Fabmzyme⑧）。在一个实施方案中，所述α -半乳糖苷酶 是阿加糖酶β。在另一实施方案中，所述生物分子是肽激素，如促甲状腺激素（也称为TSH 或促甲状腺素）。TSH是由两个亚基组成的糖蛋白，所述两个亚基为：α亚基和β亚基。重 组形式的人TSH-α可从Genzyme Corp.以商标名"Thyrogen"获得。在另一实施方案中， 所述生物分子是抗体，如单克隆抗体。在一些实施方案中，所述生物分子是糖基化的蛋白。
[0099] 在第一方面的一个实施方案中，所述多峰树脂选自下组：Capto? Adhere、Capto? MMC、Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?、Pall MEP HyperCel?和 Eshmuno? HCX 介质。在本申请提交日于这些多峰树脂中使用的配体示于图4、5、6八、68、6(：和7。在一个实 施方案中，所述多峰树脂是Capto? Adhere。
[0100] 在第二方面中，本发明涉及通过根据第一方面的方法可获得或已获得的纯化的生 物分子。生物分子可由比本领通常已知的纯化或富集方法更温和的方法进行纯化或富集。 因此，预期纯化的生物分子相比通过现有技术的方法获得的纯化的生物分子处于更加天然 的状态。
[0101] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸（例如，丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）或乙二醇 或丙二醇或乙二醇和丙二醇的组合物。换而言之，在这些实施方案中，如果所述水性缓冲溶 液包含一种或多种氨基酸，则乙二醇和丙二醇的浓度各为0 %。相反地，在这些实施方案中， 如果所述水性缓冲溶液包含乙二醇或丙二醇或两者，则所述一种或多种氨基酸的总浓度为 OmM0
[0102] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含0 % -60 % (v/v)(如1 % -50 % (v/v)、 5%-40% (v/v)、8%-30% (v/v)、10%-25% (v/v)、15%-20% (v/v))的乙二醇。
[0103] 在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种 氨基酸通常选自下组：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所 述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、半胱氨 酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些实施方案 中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸， 所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[0104] 在一个实施方案中，所述至少一种Good's缓冲液选自下组：MES、M0PS、Tris、ADA、 ACES、BES、Bicine、CAPS、CAPS0、CHES、HEPES、PIPES、TAPS 和 TES。在一个实施方案中，所 述至少一种Good' s缓冲液是MES，而在另一实施方案中，所述至少一种Good' s缓冲液是 MOPSo
[0105] 在一个实施方案中，所述生物分子是蛋白（例如，酶、结构蛋白、转运蛋白、信号 蛋白、跨膜蛋白、肽激素或抗体）或其片段，或核酸（例如，单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、 单链多核苷酸或双链多核苷酸）。核酸可为，例如，DNA、RNA或由DNA和RNA形成的杂交 双链。在一个实施方案中，所述生物分子是酶（例如，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合 酶、异构酶或连接酶）。例如，所述酶是水解酶，如糖苷酶（经常称为糖苷水解酶）。在 一个实施方案中，所述糖苷酶是α-半乳糖苷酶，如选自下组的α-半乳糖苷酶：阿加 糖酶α (例如，Shire, United Kingdom制造的Replagal? )和阿加糖酶β (例如，由 Genzyme, Cambridge, MA制造的Fabrazyme? )。在一个实施方案中，所述α -半乳糖苷酶 是阿加糖酶β。在另一实施方案中，所述生物分子是肽激素，如促甲状腺激素（也称为TSH 或促甲状腺素）。TSH是由两个亚基组成的糖蛋白，所述两个亚基为：α亚基和β亚基。重 组形式的人TSH-α可从Genzyme Corp.以商标名"Thyrogen"获得。在另一实施方案中， 所述生物分子是抗体，如单克隆抗体。在一些实施方案中，所述生物分子是糖基化的蛋白。
[0106] 在一个实施方案中，所述多峰树脂选自下组：Capto? Adhere、Capto? MMC、Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?、Pall MEP HyperCel?和 Eshmuno? HCX 介质。在 本申请提交日于这些多峰树脂中使用的配体示于图4、5、6A、6B、6C和7。在一个实施方案 中，所述多峰树脂是Capto? Adhere。
[0107] 第三方面，本发明涉及制备物，其包含：
[0108] (a)生物分子；和
[0109] (b)水性缓冲溶液，所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组 成：
[0110] -至少15mM的至少一种Good's缓冲液，如15mM_2. 5M的至少一种Good's缓冲液， 如 50mM-2. 0M、75mM-l. 5M、100mM-l. 25M、200mM-l. 0M、300mM-900mM、400mM-750mM 的至少一 种Good's缓冲液；
[0111] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
[0112] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬 酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、 磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸；和
[0113] -〇 % -60 % (v/v)(如 1 % -50 % (v/v)、5 % -40 % (v/v)、8 % -30 % (v/v)、 10%-25% (v/v)或15%-20% (v/v))的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0114] 如上文第一方面的讨论部分所释，本文描述的水性缓冲溶液与本领域描述的洗脱 缓冲液相比涉及降低的生物分子变性风险。因此，预期根据第三方面的制备物包含相比本 领域描述的制备物中的生物分子处于更加天然状态的生物分子。
[0115] 在一些实施方案中，所述水缓冲该溶液包含至少一种氨基酸（例如，丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙