dhere (GE Healthcare)解吸阿加糖酶β的实验的产率的等高线图。等高线图是对于7.0的pH值计 算。
[0042] 图3是由包含MES和二醇的洗脱缓冲液从多峰层析树脂Capto? Adhere (GE Healthcare)解吸阿加糖酶β的实验的产率的等高线图。
[0043] 图4是Capto? Adhere的多峰配体。该分子最左边部分形成与支持介质的连接。
[0044] 图5是Capto? MMC的多峰配体。
[0045] 图 6 是 Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?和 Pall MEP HyperCel ?的多 峰配体。图6A给出与胺基（未显示）结合的Pall PPA HyperCel?的苯丙基取代物。图 6B给出与胺基（未显示）结合的HEA HyperCel?的正己基取代物。图6C展示Pall MEP HyperCel?的4-疏乙基-吡啶配体。
[0046] 图7是从Merck Millipore, Germany可获得的Eshimmo? HCX树脂的多峰配体。 [0047] 发明详述
[0048] 本发明基于如下发现，即通常用作缓冲剂的MES和MOP两者在破坏多峰相互作用 中出人意料地有效。因此，当从多峰层析树脂解吸生物分子时，通过使用MES、MOPS或其他 Good's缓冲液有可能降低精氨酸或具有高导电性的相关流动相改性剂的浓度，或有可能使 用没有或基本上没有精氨酸和相关流动相改性剂的洗脱缓冲液。此外，通过使用依照本发 明的增加浓度的MES、M0PS或其他Good' s缓冲液，有可能显著降低或甚至完全避免洗脱缓 冲液中离液剂（chaotropic agent)的存在。
[0049] 与多峰层析树脂结合的生物分子的解吸可由于组合了离子、氢键和疏水相互作用 的相互作用的复杂特性而具有挑战性。传统的流动相添加剂，如简单的盐（例如，NaCl) 和有机溶剂，由于其对单个模式的相互作用具有相反作用，因此对于生物分子的解吸可能 效果不佳。例如，NaCl的添加减弱离子相互作用但增强疏水相互作用，而对于有机溶剂 则相反。因此，需要特别的流动相改性剂以共同地破坏多峰相互作用。在文献中已报道 可使用精氨酸、狐、尿素和辛酸钠 （Arakawa 等，Protein Expression and Purification 63 2009 ρρ· 158-163,Kaleas 等，J.Chromatogr. A, 1217,2010 ρρ· 235-242 和 Holstein 等，Biotechnol.Bioeng·，109 Jan 2012)。
[0050] 上述流动相改性剂（例如，精氨酸或其他氨基酸）的溶液通常呈现高导电性，其 对于在多峰树脂层析后实施的随后的纯化步骤（例如，离子交换步骤）是不利的。更具体 地，高导电性可能需要大量稀释或延长的透析次数。此外，数种经常使用的流动相改性剂， 如果这些流动相的改性剂以高浓度存在，可使生物分子（例如，蛋白）的四级结构甚至三级 结构变性。如果流动相改性剂是离液剂如尿素或胍盐，则变性的风险很高。
[0051] 因此，理想的是减少精氨酸或其他具有高导电性的添加剂并鉴定呈现低导电性的 流动相改性剂。更理想的是在洗脱缓冲液中降低离液剂（如尿素、盐酸胍、硫氰酸胍）的浓 度并鉴定对生物分子发挥较弱作用或不具有变性作用的流动相改性剂。
[0052] 定义由于本文描述的特定的方法学、流程和试剂可发生变化，因此本发明不限于 这些本文描述的特定的方法学、流程和试剂。此外，本文所用术语仅为达到描述特定实施方 案的目的，并非意在限制本发明的保护范围，其仅通过附加的权利要求进行限定。除非另作 限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的 含义。
[0053] 本文所用术语如描述于 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations) "，Leuenberger, H. G. W, Nagel, B.和 Kdlbl，H.编 (1995) ,Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland 所定义。
[0054] 贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有需要，词语"包含"及变化如"包 含了 "和"含有"应理解为暗示包括陈述的整数或步骤或整数或步骤的组，而不排除任何其 他整数或步骤或整数或步骤的组。
[0055] 贯穿本说明书的文本引用了多个文件（举例来说：专利、专利申请、科学出版物、 制造者规格、说明书、GenBank登录号序列访问编号等）。本文的内容不能理解为对凭借发 明在先本发明没有资格早于所述公开内容的承认。本文引用的一些文件表征为"通过提述 并入"。在这些并入的参考文献的定义或教导和本说明书引用的定义或教导发生冲突的情 况下，采取本说明书的文本作为优先。
[0056] 术语"Good's缓冲液"最初指由Norman Good及其合作者在1966年选取和描述的 作为特别适用于生物研宄的十二种缓冲剂中的一种。在本说明书的上下文中，"Good' s缓 冲液"不仅涵盖最初描述的十二种缓冲剂还进一步涵盖结构上相关的缓冲剂。因此，如本文 所用的术语"Good' s缓冲液"包含下列化学化合物：ADA、ACES、BES、Bicine、CAPS、CAPS0、 CHES、HEPES、MES、MOPS、PIPES、TAPS、TES 和 Tris。
[0057] ADA是N-(2-乙酰胺基）亚氨基二乙酸的缩写。
[0058] ACES是N-(2-乙酰胺基）_2_氨基乙横酸的缩写。
[0059] BES是N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸的缩写
[0060] Bicine是N，N-双（2-羟乙基）甘氨酸的缩写。
[0061] CAPS是3-(环己基氨基）-1_丙磺酸的缩写。
[0062] CAPSO是3-(环己基氨基）-2_羟基-1-丙磺酸的缩写。
[0063] CHES是2_(环己基氨基）乙磺酸的缩写。
[0064] HEPES是4-(2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸的缩写。
[0065] MES是2-(N-吗啉代）乙磺酸的缩写。
[0066] MOPS是3- (N-吗啉代）丙磺酸的缩写。
[0067] PIPES是1，4-哌嗪二乙磺酸的缩写。
[0068] TAPS是N-[三（羟甲基）甲基]-3-氨基丙磺酸的缩写。
[0069] TES是2_[ (2-羟基-1，1-二（羟甲基）乙基）氨基]乙磺酸的缩写。
[0070] Tris是三（羟甲基）氨基甲烷的缩写。
[0071] Pall MEP HyperCel?是由与4-巯基乙基吡啶（4-MEP)连接的刚性纤维素基质 组成的层析吸附剂（参见图6C)。纤维素珠赋予高的多孔性、化学稳定性和低的非特异相 互作用。珠的平均直径为80 μ m至100 μ m。由混合模式或多模式的机制操作的Pall MEP HyperCel?也描述为疏水电荷诱导层析（HCIC)。HCIC基于电离的双模式配体的pH依赖性 行为。
[0072] Pall PPA HyperCel?是层析混合模式吸附剂。吸附剂的材料基于高多孔性交联 纤维素并包含苯丙胺基团作为配体（参见图6A)。
[0073] Pall HEA HyperCel?是层析混合模式吸附剂。吸附剂材料基于高多孔性交联纤 维素并包含己胺基团作为配体（参见图6B)。
[0074] Capto? Adhere是采用固定于多孔琼脂糖粒子上的配体N-苄基-N-甲基乙醇胺 的层析吸附剂。其可从GE Healthcare Life Sciences获得。该配体的详细化学结构示于 图4。
[0075] Capto? MMC是采用固定于多孔琼脂糖粒子上的衍生自N-苯甲酰基甲硫氨酸的配 体的层析吸附剂。其可从GE Healthcare Life Sciences获得。该配体详细的化学结构示 于图5。
[0076] Cshmunoat HCX介质是将（配体的）触须结构与基于亲水性聚乙烯醚的基质偶 联的混合模式树脂。更具体地，所述基础基质是移植有刚性聚乙烯醚亲水性聚合物的表面。 平均粒度（d5(l)是75 μ m至95 μ m。Eshmuno? HCX介质中采用的配体的详细化学结构示 于图 7。Eshnilin〇'、!i HCX 介质可从 Merck Millipore, Germany 或 EMD Millipore, USA 获 得。
[0077] α -半乳糖苷酶
[0078] α -半乳糖苷酶是从糖脂和糖蛋白水解末端α -半乳糖基部分的糖苷水解酶。其 由GLA基因编码。该酶是从糖脂和糖蛋白水解末端α-半乳糖基部分的同源二聚糖蛋白。 其主要水解神经酰胺三己糖苷，并且它可催化蜜二糖水解成为半乳糖和葡萄糖。
[0079] 此基因中的多个突变影响该酶的合成、加工和稳定性，这导致Fabry's病，一种由 分解代谢a -D-半乳糖基糖脂部分失败而导致的罕见的溶酶体贮积症和神经鞘脂贮积症。 两种酶的替代疗法可用于对α-半乳糖苷酶缺陷进行功能性补偿。阿加糖酶α和β都是 重组形式的人α-半乳糖苷酶A且都具有与天然酶相同的氨基酸序列。阿加糖酶α和β 在其寡糖侧链的结构上有所不同。制药公司Shire以商标名Replagal?制造阿加糖酶α 作为对于Fabry's病的治疗。制药公司Genzyme以商标名Fabrazyme?"+:产合成的阿加糖 酶β用于Fabry's病的治疗。
[0080] 除非清楚地相反指示，下列的每一个方面可与任何其他一个或多个方面结合。具 体地，除非清楚地相反指示，任何指示作为优选的或具有优势的特征可与任何其他一个或 多个指示作为优选的或具有优势的特征组合。本发明特别针对一些实施方案，在这些实施 方案中对特别优选的特征与一个或多个其他特别优选的特征进行了组合。
[0081] 在第一方面中，本发明涉及用于纯化或富集生物分子的方法，所述方法包括步 骤：
[0082] (a)提供包含所述生物分子的水溶液；
[0083] (b)将所述水溶液与多峰树脂接触；
[0084] (C)任选地用水性洗涤缓冲液洗涤所述多峰树脂；
[0085] (d)通过水性缓冲溶液从所述多峰树脂洗脱所述生物分子，其中所述水性缓冲溶 液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：
[0086] -至少15mM的至少一种Good's缓冲液，如15mM_2. 5M的至少一种Good's缓冲液， 50mM-2. 0M、75mM-l. 5M、IOOmM-L 25M、200mM-l. 0M、300mM-900mM、400mM-750mM 的至少一种 Good's缓冲液；
[0087] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
[0088] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬 酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、 磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸；和
[0089] -〇 % -60 % (v/v)(如 1 % -50 % (v/v)、5 % -40 % (v/v)、8 % -30 % (v/v)、 10% -25% (v/v)或15% -20% (v/v))的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物；并
[0090] (e)收集包含生物分子的级分，由此获得纯化或富集形式的生物分子。
[0091] 根据第一方面的方法与用于纯化或富集生物分子的之前的方法相比提供数个优 势。之前使用多峰层析的纯化或富集生物分子的方法通常采用包含高浓度精氨酸、甘氨酸 或其他氨基酸（例如，IM甘氨酸，比照US 2011/0166332 Al实施例1;或0.8mol/kg