一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体及其制备方法与应用的制作方法

一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】一种多用途聚赖氨酸荧光自组装载药纳米微球及其制备方法与应用。本发明采用纳米自组装技术制备了罗丹明标记的聚赖氨酸荧光纳米微球，并修饰了带有二硫键的叠氮基团侧链，进一步采用点击化学方法将炔基修饰的药物连接在荧光纳米微球上。本发明所制备的链接药物的聚赖氨酸纳米自组装微球可用于被修饰药物在动物以及细胞水平的示踪成像分析。同时利用该微球还可以用于捕获被修饰药物的结合蛋白，并通过裂解二硫键可释放出靶点结合蛋白及其关联蛋白，可用于药物作用靶点的研究。本发明提供了一种研究药物作用靶点的简便快捷的工具和方法，该方法集合药物示踪、靶点定位、靶点蛋白捕获及分离功能于一体，简便易行，在药物作用机制研究以及靶点发现方面有很好的应用前景。
【专利说明】一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体及其制备方 法与应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药【技术领域】，涉及一种连接有荧光示踪基团的聚赖氨酸纳米自 组装微球载体的制备工艺，并进一步采用点击化学技术共价偶联被修饰药物的方法。以及 利用本发明所制备的载药微球，对被修饰药物进行的整体动物和细胞水平的示踪成像分 析，药物靶点定位，靶点蛋白捕获分离方面的应用。

【背景技术】
[0002] ε -聚赖氨酸（P〇ly-L-lySine，PL)是由25?30个赖氨酸残基通过酰胺键依次连 接而成的同型单体直链状聚合物。聚赖氨酸为白色或淡黄色粉末，吸湿性强，略有苦味，不 受pH值影响。ε -聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，其具有抑菌谱广、水溶性大、热稳 定性好、可生物降解且对人和环境无毒害等优点，已经成为优良的食品防腐保鲜剂。ε -聚 赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体必需的氨基酸，也是世界各国允许在食 品中强化的氨基酸。因此ε-聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，安全性高于其他化学防腐剂， 其急性口服毒性为5 g/kg。ε_聚赖氨酸的抑菌谱广，对于酵母属中的尖锐假丝酵母、法红 酵母、产膜毕氏酵母、玫瑰掷孢酵母；革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌；以及革兰氏阴性菌中的产气节杆菌、大肠杆菌等引起食物中毒与腐败的菌 有强烈的抑制作用。分子量在3600?4300之间的ε-聚赖氨酸其抑菌活性最好，当分子 量低于1300时，ε-聚赖氨酸则失去抑菌活性。
[0003] 此外，由于ε -聚赖氨酸带正电，能与带负电的物质发生强烈的静电吸引力，易 通过生物膜且不易分解，可以有效降低药物阻力提高药物的转运效率。聚赖氨酸还具有 能促进细胞生长和粘附以及促进细胞发挥正常功能等作用，因此作为药物的缓释和靶向 载体ε-聚赖氨酸已被广泛用于生物医药领域。作为生物高分子材料骨架，中国专利（申 请号：2014100723354)公开了一种可溶解凝血酶纳米颗粒的制备方法，该纳米颗粒以凝血 酶为核心，外壳是由水溶性直链淀粉与聚赖氨酸交联形成的纳米粒子；中国专利（申请号： 2013107289643, 2013106763740)分别公开了 ε -聚赖氨酸水凝胶的制备方法，以及由该发 明衍生的伤口组织愈合材料；中国专利（申请号：2012101329801)提供了一种两亲性三嵌 段共聚物的纳米载体制剂，该共聚物由包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性 高分子化合物组成，在水溶液中可以自组装形成具有三层结构的纳米载体，并能有效负载 小分子疏水性药物、基因以及蛋白质或多肽。
[0004] 作为药物载体，中国专利（申请号：2013106705336)提供了一种作为疏水性药物的 载体的双敏感响应型聚合物纳米胶束，其成分为正丁胺-聚赖氨酸（叶酸/2, 3-二甲基马 来酸）-b_聚半胱氨酸；中国专利（申请号：2004100680618)公开了一种短肽修饰的聚赖氨 酸与聚乳酸共聚物纳米粒，该纳米粒包括药物和由精氨酰一甘氨酰一天冬氨酰序列短肽、 修饰的聚赖氨酸一聚乳酸共聚物纳米粒载体组成，可用于有机药物、水溶性药物或水不溶 性抗癌药物；中国专利（申请号：2004100466794)提供了一种应用"成胶现象"合成半乳糖 化海藻酸钠与多聚赖氨酸纳米胶的制备方法，所得到的肝靶向性纳米基因载体系统能为原 发性肝癌的靶向基因治疗提供材料；此外，中国专利（申请号：2013101802363)还公开了一 种双敏感可崩解式纳米囊泡药物载体，其中双敏感两亲性嵌段共聚物由还原敏感的二硫键 及pH敏感的碳氮双键桥连亲水性聚乙二醇和疏水性苄氧羰基保护的聚赖氨酸而成。该载 体制剂具有疏水双分子膜及亲水内腔，疏水双分子膜负载疏水药物，亲水内腔负载亲水药 物，可有效利用肿瘤细胞中的还原环境及酸性环境使得载体制剂崩解释放药物实现靶向释 药。
[0005] 作为荧光成像纳米材料的骨架，中国专利（申请号：2012102228846)公开了一种 功能性近红外荧光纳米微粒的制备方法。该纳米微粒平均粒径在15nm左右，以所装载的 近红外荧光染料作为发光中心，以壳聚糖、聚赖氨酸为基本骨架，经海藻酸钠自组装包裹 成壳制备而成；中国专利（申请号：201310470907X)还提供了一种信号放大型免疫荧光探 针的制备方法。该探针的制备方法包括：在缩合剂的存在下，对苯二胺和均苯三甲酸经 缩合反应得到多羧基大分子，多羧基大分子经活化后，依次加入抗体、聚赖氨酸进行反应， 再用荧光标记物标记制得所述的探针。该探针标记有较多荧光标记物，结构稳定，可用于 荧光免疫检测，具有检测灵敏度高、检测时间短、成本低等特点。此外，中国专利（申请号： 2013101802363)还公开了一种两亲性三嵌段聚多肽ICG胶束，该胶束包括了分散有吲哚菁 绿并由聚亮氨酸形成的内核，以及环绕内核由聚赖氨酸形成的中间层及部分穿插于所述中 间层的由聚乙二醇形成的外壳。该胶束具备良好的空间稳定性以及出色的荧光性能、光热 转换能力，可以实现对肿瘤细胞或组织进行光学成像和光热治疗。
[0006] 综上所述，目前国内外均以聚赖氨酸或共混其他高分子材料为骨架进行相关材料 的开发。但尚未见以聚赖氨酸自身为骨架，一方面通过酰胺键共价连接荧光分子(罗丹明)， 并通过自组装技术制备纳米颗粒，另一方面采用点击化学技术共价结合可释放药物分子； 同时可进行被修饰药物的体内外示踪成像分析，靶点定位以及靶点蛋白捕获分离，集合上 述功能用途为一体的聚赖氨酸纳米材料的报道。


【发明内容】

[0007] 本发明的目的是利用纳米自组装技术，通过引入荧光基团和可被裂解释药的二硫 键基团制备聚赖氨酸载药纳米微球，并利用聚赖氨酸的生物相容性实现被修饰药物在动物 组织和细胞内的示踪，以及靶点蛋白及其相关蛋白的捕获分离，提供一种多用途聚赖氨酸 荧光自组装纳米微球载体的制备方法与应用。
[0008] 本发明可解决现有技术难以实现的药物示踪和靶点捕获一体化的问题。并以含有 羟基或羧基的药物为例，通过丙炔酸酯化或丙炔胺的酰胺化修饰引入炔基，并通过和微球 上修饰的叠氮基团的点击化学反应将药物连接到微球载体上，运用同一纳米载药微球，分 别实现了药物体内代谢示踪、细胞内定位、以及靶点蛋白捕获分离等不同应用。
[0009] 本发明提供了一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，该载体是在骨架材 料上共价连接有荧光标记基团和药物分子制成；所述的骨架材料是由含有25?30个赖氨 酸残基通过酰胺键依次连接而成的同型单体聚合物；所述骨架材料上的赖氨酸残基同时修 饰了带有二硫键的叠氮基团侧链以及荧光标记物，能够通过自组装制备纳米微球，并能用 于药物分子的连接。
[0010] 所述的荧光标记基团是含有罗丹明的标记分子。具体是通过市售的罗丹明活化酯 (NHS-罗丹明），与聚赖氨酸的氨基以酰胺键的形式和纳米微球载体相连接。
[0011] 所述的带有二硫键的叠氮基团侧链，具体是通过市售的叠氮化试剂 (Sulfo-SADP)，其一端是活化酯，通过聚赖氨酸的氨基以酰胺键的形式与纳米微球载体相 连接。
[0012] 所述的药物分子，是炔基修饰的药物衍生物，通过丙炔酸与含有羟基的药物进行 酯化反应引入炔基，或通过丙炔胺与含有羧酸的药物进行酰胺化反应引入炔基，并进一步 通过点击化学的方法将其炔基修饰的药物衍生物与含有叠氮侧链纳米微球载体相连接。
[0013] 具体制备方法如下： 第1、向含有1%至5% Span-80的由汽油和四氯化碳组成的混合有机相(汽油和四氯化 碳的体积比可为1:3至3:1)中加入NHS-罗丹明溶解，并再加入溶解有0. 2%-2%的聚赖氨 酸的水相溶液。其中有机相和水相的比例为1:1至5:1，NHS-罗丹明的用量为聚赖氨酸的 0. 5%至10%。10, 000至20, 000转高速搅拌后得到乳化液。
[0014] 第2、将上述乳化液转移至分液漏斗中，分别加入上述体积比1:1至5:1的石油醚 以及水溶液，混合均匀后静置分层，收集水相，离心弃去沉淀，上清液即为自组装的聚赖氨 酸荧光纳米微球； 第3、向第2步得到的纳米微球溶液中加入叠氮化试剂Sulfo-SADP，室温搅拌反应0. 5 小时至5小时，得叠氮修饰的纳米微球，其中Sulfo-SADP的用量为聚赖氨酸用量的10%至 100% ； 第4、进一步将炔基修饰的药物缓慢滴入第3步得到的纳米微球溶液中，搅拌条件下加 入点击化学反应的催化剂，室温反应〇. 5小时至5小时，反应液经超滤浓缩，即为连接有药 物的荧光纳米微球。其中炔基修饰药物的用量为聚赖氨酸用量的10%至100% ;所述的炔基 修饰的药物，是采用丙炔酸与含有羟基的药物通过酯化的方式制备的丙炔酸酯，或采用丙 炔胺与含有羧基的药物通过酰胺化的方式制备的丙炔酰胺衍生物。
[0015] 此外，本发明还提供了上述聚赖氨酸荧光自组装纳米微球在药物示踪与靶点蛋白 捕获方面的应用。其中包括被修饰药物牛蒡子苷元的动物以及细胞水平的成像分析；以 及利用甘草次酸修饰的纳米微球捕获甘草次酸靶点蛋白的过程，包括通过纳滤分级截留分 离，裂解二硫键释放出靶点蛋白的具体步骤。
[0016] 本发明提供的纳米微球的应用之一：在药物示踪方面的应用。
[0017] 本发明首先制备了载有牛蒡子苷元的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球，并通过激光 粒度仪、透射电子显微镜分析了上述微球的粒径和形状；采用荧光光谱仪考察了其荧光特 性；并进一步通过激光共聚焦显微镜以及小动物活体成像技术评价了其在体和细胞水平的 分布情况。
[0018] 本发明提供的纳米微球的应用之二：靶点蛋白捕获方面的应用。
[0019] 本发明中所述的靶点蛋白捕获方面的应用，利用超滤分级截留分离捕获靶点蛋 白，包括以下步骤：孵育细胞、细胞裂解、离心、超滤除杂、洗涤、还原释放蛋白、超滤洗脱等 步骤(附图1)。具体操作如下： 向人肺上皮BEAS-2B细胞中加入连接甘草次酸的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球，培 养48小时后，经胰酶消化，超声破碎，离心，得到结合有靶标蛋白的聚赖氨酸纳米微球悬浊 液。将上述含有纳米微球的溶液加入到截留分子量为3 kD的超滤管中，离心弃去小分子， 将截留液加入到截留分子量为1〇〇 kD的超滤管中，离心弃去未结合的大分子蛋白，进一步 向截留液中加入二硫苏糖醇（DTT)溶液还原二硫键，再次加入到截留分子量为100 kD的超 滤管中，离心，收集滤液得到与甘草次酸结合的靶点蛋白以及相关蛋白。
[0020] 综上所述，本发明提供了一种研究药物分布以及作用靶点所需要的简便快捷的载 体工具和方法，该聚赖氨酸载药荧光纳米微球，集靶点定位，靶点蛋白捕获与分离功能于一 体，可用于药物作用机制的研究。
[0021] 本发明的优点和积极效果： 本发明提供了一种制备多用途聚赖氨酸荧光纳米自组装载药微球的新方法，并创新性 的同时引入罗丹明荧光标记和可被还原裂解的二硫键的叠氮基团，通过点击化学反应连接 炔基修饰药物。所制备的纳米自组装载药微球呈球形，粒度分散均匀，平均粒径为38 nm，具 有良好的胶体性质，最大发射波长为600 nm，可以有效避免生物样本自身的干扰，被突光检 测和示踪。同时该纳米微球生物相容性好，有利于穿过细胞膜，可以顺利地指示和捕获靶点 蛋白，并通过裂解二硫键可释放出靶点蛋白及其关联蛋白。该方法制备工艺简便易行，所制 备的载药纳米微球集靶点示踪定位，靶点蛋白捕获及分离功能于一体，可用于被修饰药物 的动物和细胞水平的成像分析，以及靶点蛋白分离鉴定，在药物作用机制的研究方面有很 好的应用前景。
[0022]

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1是实施例1，2和3,叠氮修饰的聚赖氨酸荧光纳米微球的合成路线图； 图2是实施例4,药物分子牛蒡子苷元的炔基化修饰以及与聚赖氨酸荧光纳米微球连 接路线示意图； 图3是实施例5,聚赖氨酸荧光纳米自组装载药纳米微球的形态学和荧光特性考察。其 中，A为纳米微球溶液中分散状况照片；B为纳米微球的胶体特性示意图；C为纳米微球粒 径分布图；D为纳米微球TEM透射电镜的整体照片；E为纳米微球TEM透射电镜的放大照片； F为罗丹明溶液和聚赖氨酸荧光纳米自组装微球胶体溶液的荧光发射光谱图； 图4是实施例6,药物分子甘草次酸的炔基化修饰以及与聚赖氨酸荧光纳米微球连接 路线不意图； 图5是实施例7,牛蒡子苷元载药的聚赖氨酸荧光纳米微球的细胞成像图和小鼠活体 成像示踪图片。A组为细胞加入实施例1所制备的聚赖氨酸荧光空白纳米微球的阴性对 照，其中，A1为细胞DAPI染色图片，A2为细胞荧光照片，A3为A1和A2的叠加照片；B组为 细胞加入实施例2所制备的牛蒡苷元修饰的聚赖氨酸荧光纳米载药微球的照片，其中，B1 为细胞DAPI染色图片，B2为细胞荧光照片，B3为B1和B2的叠加照片；C组为实施例2所 制备的聚赖氨酸荧光纳米载药微球的小鼠活体示踪图片；其中，C1为给药前0分钟，C2为 给药后60分钟的活体成像图片； 图6是实施例8,聚赖氨酸纳米载药微球捕获靶点蛋白的操作示意图； 图7是实施例8,实施例5所制备的甘草次酸载药纳米微球捕获靶点蛋白的SDS-PAGE 电泳检测图。其中，第1泳道为蛋白Marker ;第2泳道为细胞裂解蛋白样品；第3泳道为经 过3 kD超滤管超滤的滤过液；第4泳道为滤液中截留蛋白；第5泳道为DTT还原后，经过 100 kD超滤管超滤的截留液；第6泳道为DTT还原后，经过100 kD的超滤管超滤后的滤过 液。
[0024]

【具体实施方式】
[0025] 实施例1、聚赖氨酸高度荧光化修饰纳米微球的制备与叠氮化修饰 取5 g聚赖氨酸盐酸盐溶于500 mL纯水，上样于活化的001X7阳离子交换树脂 (2X80cm)脱盐，上样速度为1 mL/分钟。经1500 mL纯水平衡至流出液为中性后，用5%氨 水洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，浓缩干燥，得白色至淡黄色固体1. 9 g。
[0026] 取上述脱盐后的聚赖氨酸200 mg于10 mL纯水中，搅拌使其完全溶解得水相溶 液；同时分别将13 mL汽油、12 mL四氯化碳以及1. 25mL Span-80混合，搅拌均匀获得有机 相。向有机相中加入20 mg NHS-罗丹明（NHS_Rhodamine，Pierce 46406)，搅拌混勻，放置 备用。将上述水相迅速倒入有机相中，12, 000转搅拌30秒，重复3次，得到均匀的乳化液， 转移至分液漏斗中。分别加入50 mL石油醚，室温搅拌5分钟，再加入10 mL纯水，继续搅 拌5分钟，静置分层，收集水相，得到荧光纳米微球粗品。将粗品12, 000转离心10分钟， 弃去沉淀，上清液即为聚赖氨酸荧光化修饰的纳米自组装微球。
[0027] 取上述2 mL聚赖氨酸荧光纳米微球溶液，加入叠氮化试剂10 mg Sulfo-SADP (Pierce 21553)(0. 02 mmoL)，室温搅拌0.5小时，得带有二硫键并叠氮修饰的纳米自组装 聚赖氨酸纳米微球，4 °C保存备用。合成路线如图1所示。
[0028] 实施例2、聚赖氨酸荧光纳米微球的制备与叠氮化修饰 取上述实施例1脱盐后的聚赖氨酸50 mg溶于10 mL纯水中，得水相溶液；同时分别将 5mL汽油、15mL四氯化碳以及0.5 mL Span-80混合，搅拌均匀获得有机相。向有机相中加 入0. 1 mg NHS-罗丹明（NHS-Rhodamine，Pierce 46406)，搅拌溶解，放置备用。将上述水相 迅速倒入有机相中，20, 000转高速搅拌15秒，重复3次，得到均匀的乳化液，转移至分液漏 斗中。分别加入20 mL石油醚，搅拌5分钟，再加入10 mL纯水，继续搅拌5分钟，静置分 层，收集水相，得到荧光纳米微球粗品。将粗品12, 000转离心10分钟，弃去沉淀，上清液即 为聚赖氨酸荧光纳米自组装微球。取上述聚赖氨酸荧光纳米微球溶液2 mL，加入叠氮化试 剂50 mg Sulfo-SADP (Pierce 21553) (0· 1 mmoL)，室温搅拌5小时，得到叠氮化修饰的 纳米自组装聚赖氨酸纳米微球，4 °C备用。合成路线同图1。
[0029] 实施例3、聚赖氨酸荧光纳米微球的制备与高度叠氮化修饰 取上述实施例1脱盐后的聚赖氨酸20 mg溶于10 mL纯水中，得水相溶液；同时分别 将15 mL汽油、5 mL四氯化碳以及0.2mL Span-80混合，搅拌均匀获得有机相。向有机相中 加入 2 mg NHS-罗丹明（NHS-Rhodamine，Pierce 46406) (0.002 mmoL)，揽祥溶解，放置备 用。将上述水相迅速倒入有机相中，10, 〇〇〇转高速搅拌20秒，重复3次，得到均匀的乳化 液，转移至分液漏斗中。分别加入10 mL石油醚，搅拌5分钟，再加入10 mL纯水，继续搅 拌5分钟，静置分层，收集水相，得到荧光纳米微球粗品。将粗品12, 000转离心10分钟， 弃去沉淀，上清液即为聚赖氨酸荧光纳米自组装微球。取上述聚赖氨酸荧光纳米微球溶液 4 mL，加入叠氮化试剂 200 mg Sulfo-SADP (Pierce 21553)(0.4 mmoL)，室温搅拌 5 小时， 可得到高度叠氮化修饰的纳米自组装聚赖氨酸纳米微球，4 °C备用。合成路线同图1。
[0030] 实施例4、牛蒡子苷元的炔基化修饰以及与聚赖氨酸荧光纳米微球的连接 以含有酚羟基的药物牛蒡苷元为例，通过与丙炔酸的酯化反应进行药物的炔基化修 饰，进一步通过点击化学反应与实施例1所制备的叠氮化修饰的聚赖氨酸荧光纳米微球偶 联，合成路线见图2。具体实施如下： 向圆底烧瓶中分别加入〇. 372 g牛蒡子苷元（1 mmoL)，0. 198 g EDOHC1 (2 mmoL)， 以及5 mL预冷的CH2C12溶剂，磁力搅拌30分钟，溶解后再依次加入0. 116 g N-羟基琥珀 酰亚胺（NHS，2 mm〇L)，0. 140 g丙炔酸（2 mmoL)，保持冰浴反应4小时。待反应结束后， 向反应液中加入15 mL CH2C12稀释，然后依次用1M HC1，5% NaHC03溶液，以及饱和食盐水 洗涤。收集有机相，加入无水Na2S04干燥，过滤，减压蒸馏浓缩，得到油状物即为牛蒡子苷元 丙炔酸酯粗品。
[0031] 将粗品过硅胶柱纯化，得到白色固体粉末，称重得牛蒡子苷元丙炔酸酯0. 196 g， 产率约为 47%。=0.7 (PE / EtOAc 1:1);屮 NMR [CDC13, 400 MHz] 6.98-6.94 (m, 1H), 6.79-6.75 (m, 2H), 6.68-6.65 (m, 1H), 6.58-6.50 (m, 2H), 3.84(s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.76-3.74 (m, 2H), 2.97-2.95 (m, 2H), 2.83 (s, 1H), 2.66-2.48 (m, 4H)。
[0032] 取上述所得的5 mg牛蒡子苷元丙炔酸酯（0. 01 mmoL)溶于100 μ L二甲基亚 砜（DMS0)中，并将其缓慢滴入实施例1制备的1 mL叠氮修饰的聚赖氨酸自组装纳米微球 溶液中，最后加入点击化学反应的催化剂（〇. 2 mmol/L Tris-triazoleamine，1.0 mmol/L &^04和2.0 mmol/L抗坏血酸钠)，室温搅拌1小时。反应结束后加入到截留分子量为3 MilliporekD的超滤管中，3000转离心30分钟，弃去滤液，分别用0. 2 mmol/L磷酸盐缓冲 液2 mL洗涤2次，收集截留液，即为连接有牛蒡子苷元的高度荧光化修饰的纳米微球。
[0033] 实施例5、聚赖氨酸荧光纳米微球的形态学与荧光特征 上述实施例3所制备的牛蒡子苷元修饰的聚赖氨酸荧光纳米载药微球在水溶液中呈 现橙黄色，且分散均匀（图3 A)。通过线光源照射，能够明显看到丁达尔现象，证明是胶体溶 液，如图3 B所示。经激光粒度分析仪分析，其平均粒径为38 nm (图3 C)。采用TEM透射 电子显微镜进行观查，该聚赖氨酸纳米微球的粒径大小均匀，呈规则球状（图3 D)，进一步 放大观测显示其内部为空心状，如图3 E所示。
[0034] 采用荧光光谱仪分别对相同用量的罗丹明溶液和聚赖氨酸荧光纳米微球进行了 荧光光谱扫描，考察纳米自组装球的荧光特性。如图3F所示，在507nm的激发波长下，罗丹 明溶液的最大发射波长为590 nm，而聚赖氨酸荧光纳米微球的最大发射波长接近600 nm。 但二者的荧光强度明显不同，罗丹明溶液的荧光强度为625 a. u，而荧光纳米微球的荧光强 度为1149 a. u几乎增加了一倍。这是因为聚赖氨酸将荧光染料罗丹明较为集中地组装到 纳米微球的内部，微球内部的荧光量子效率提高导致荧光强度得到增强，符合近红外荧光 探针的基本要求，可有效避免生物样本的自身干扰，适合药物分子的示踪分析。
[0035] 实施例6、甘草次酸的炔基化修饰以及与聚赖氨酸荧光纳米微球的连接 以含有羧酸的药物甘草次酸为例，通过与丙炔胺的酰胺化反应进行药物的炔基化修 饰，进一步通过点击化学反应与实施例2所制备的高度叠氮化修饰的聚赖氨酸荧光纳米微 球偶联，合成路线见图4。具体实施如下： 向圆底烧瓶中分别加入0. 941 g甘草次酸（2 mmoL)，0. 460 g EDOHC1 (2. 4 mmoL)， 0. 324 g HOBt (2.4 mmoL)，以及5 mL预冷的CH2C12溶剂，磁力搅拌30分钟，溶解后滴加 三乙胺（TEA) 0.7g (约7 mmoL)，继续搅拌30分钟，加入0.165 g丙炔胺（3 mmoL)，保持 冰浴反应过夜。待反应结束后，向反应液中加入15 ml CH2C12稀释，然后依次用1M HC1，5% NaHC03溶液，以及饱和食盐水洗涤。收集有机相，加入无水Na2S04干燥，过滤，减压蒸馏浓 缩，得到油状物即为甘草次酸的丙炔酰胺衍生物粗品。
[0036] 进一步采用中压制备液相进行纯化，得到白色固体粉末，称重得丙炔酰胺化甘草 次酸产物 〇· 482 g,产率约为 48%。屮 NMR (400 MHz, CDC13) δ 5. 93 (t, / = 5. 0 Hz, 1H), 5.70 (s, 1H), 4.13 (ddd, /= 17.5, 5.4, 2.5 Hz, 1H), 4.03 (ddd, /= 17.5, 4.9, 2.5 Hz, 1H), 3.24 (dd, /= 10.5, 5.8 Hz, 1H), 2.80 (dt, /= 13.3, 3.3 Hz, 1H), 2.35 (s, 1H), 2.26 (t, / = 2. 5 Hz, 1H), 2.17 (dd, /= 12.2, 5.1 Hz, 1H), 2.11 - 2.00 (m, 2H), 1.96 (d, /= 10.4 Hz, 1H), 1.90 - 1.74 (m, 3H), 1.72 -1.58 (m, 4H), 1.51 - 1.43 (m, 2H), 1.42 - 1.37 (m, 6H), 1.25 - 1.18 (m, 1H), 1.18 - 1.12 (m, 9H), 1.05 - 1.00 (m, 4H), 0.96 (dd, /= 12.5, 4.7 Hz, 1H), 0.87 - 0.78 (m, 6H), 0.71 (d, /= 11.7 Hz, 1H) ;13C NMR (101 MHz, CDC13) δ ppm 200.18, 175.51, 169.09, 128.54, 79.78, 78.78, 71.67, 61.83, 54.95, 48. 04, 45. 37, 43. 54, 43. 19, 41. 77, 39. 16, 37. 35, 37. 08, 32. 76, 31. 90, 31. 44, 29.31, 28.40, 28.11, 27.28, 26.43, 23.35, 18.67, 17.48, 16.37, 15. 58〇
[0037] 取上述所得的甘草次酸丙炔酰胺衍生物100 mg(约0. 2 mmoL)溶于500 μ L DMS0 中，并将其缓慢滴入实施例2制备的4 mL叠氮修饰的聚赖氨酸自组装纳米微球溶液中， 最后加入点击化学反应的催化剂（2 mmol/L Tris_triazoleamine，15 mmol/L (]11304和30 mm〇l/L抗坏血酸钠)，室温搅拌2小时。反应结束后加入到截留分子量为3 kD的Millipore 超滤管中，3000转离心30分钟，弃去滤液，分别用0. 2 mmol/L磷酸盐缓冲液5 mL洗涤 3次，收集截留液，即为连接有甘草次酸药物的荧光纳米微球，可用于靶点蛋白的捕获与分 离。
[0038] 实施例7、聚赖氨酸荧光纳米微球应用于细胞与活体成像 分别取上述实施例1和2所制备的聚赖氨酸荧光纳米自组装微球30 μ?，加入到人肺 上皮BEAS-2B的培养细胞中，采用共聚焦显微镜TCS SP5观察，使用543 nm激发光，570 nm 发射光检测细胞内的载药纳米微球的分布状况。结果如图5A所示，没有连接药物的纳米 微球孵育3h后，将细胞用DAPI染色后，反复洗去游离的荧光染料，经观察只能看到细胞核 DAPI的蓝色荧光，几乎看不到罗丹明的红色荧光。而偶联有牛蒡子苷元的纳米微球，同样 经3小时孵育后，进行DAPI染色，并反复洗去游离的荧光染料，镜下观察发现细胞核呈蓝 色，而胞浆内有着很强的红色荧光，但细胞膜和细胞核内均没有罗丹明的明显红色荧光（图 5B)。结果表明，本专利所发明的载药纳米微球具有良好的生物相容性，可以有效地进入靶 细胞内，为进一步靶点蛋白的捕获与富集提供了可行性。
[0039] 为了进一步观测所制备的载药纳米微球在小鼠体内的示踪变化，取昆明小鼠并尾 静脉注射100 μ?实施例2所制备的荧光纳米微球，并采用小动物活体成像系统观测纳米微 球在小鼠体内的分布情况。结果如图5C所示，与给药前0分钟的对照组相比，给药60分 钟后小鼠的腹腔下部有着明显的罗丹明荧光聚集，表明载药聚赖氨酸荧光纳米微球经过小 鼠体液循环之后，被代谢并转移到了小鼠的膀胱中。
[0040] 实施例8、甘草次酸靶点蛋白的捕获与SDS-PAGE电泳分析 将培养的人肺上皮BEAS-2B细胞铺于六孔板中，待融合度达到80%以上，密度达到105 以后，分别加入实施例5所制备的连接甘草次酸的聚赖氨酸荧光纳米微球100 μ?。采用 DMEM完全培养基继续培养48小时；经胰酶消化30秒，收集细胞并将细胞悬浮于PBS中，冰 浴中超声处理，破碎细胞。4°C，10, 000转离心10分钟，弃去细胞碎片以及未破碎的细胞， 取上清得到包含有靶点蛋白的聚赖氨酸纳米微球的混合溶液（图6,步骤1)。
[0041] 将上述混合溶液加入到截留分子量为3 kD的Millipore超滤管中，3000转离心， 经生理盐水混悬并再次离心弃去小分子，分别收集滤液1和截留液（图6,步骤2);将截留液 加入到截留分子量为100 kD的Millipore超滤管中，3, 000转离心，经生理盐水混悬并再 次离心弃去纳米微球未结合的大分子蛋白，分别收集滤液2和截留液（图6,步骤3);向截留 液中加入100 mM的DTT溶液100 μ?，静置15分钟后再次加入到截留分子量为100 kD的 Millipore超滤管中，3, 000转离心，收集滤液3和截留液4 (图6,步骤4);具体操作步骤 如图6所示。
[0042] 分别收集上述的滤液和截留液，并采用10%SDS_PAGE电泳对捕获效果进行分析。 结果如图7所示：第1泳道是蛋白Marker，第2泳道为细胞裂解液样品；经过3 kD的超滤 管超滤，滤液中几乎没有明显的蛋白条带，如第3泳道所示；而将截留液再上100 kD的超滤 管，滤液中可以检测到大量的蛋白条带，表明是未与纳米微球结合的细胞可溶性蛋白（第4 泳道）；将截留液加入DTT还原之后，经过100 kD的超滤管，得到的滤液即为与甘草次酸结 合的靶点蛋白以及相关蛋白(第6泳道);而剩余的截留液，包括没有通过滤膜的纳米微球中 几乎检测不到可溶性蛋白（第5泳道)。
[0043] 本实施例表明，本发明公开的聚赖氨酸荧光纳米自组装载药球，不但可以进行靶 点蛋白的示踪定位，还可以进行靶点蛋白的捕获富集，在药物作用机制的研究方面有很好 的应用前景。
【权利要求】
1. 一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，是在骨架材料上共价连接有荧光标 记基团和药物分子制成；所述的骨架材料是由含有25?30个赖氨酸残基通过酰胺键依次 连接而成的同型单体聚合物；所述骨架材料上的赖氨酸残基同时修饰了带有二硫键的叠氮 基团侧链以及荧光标记物，能够通过自组装制备纳米微球，并能用于药物分子的连接。
2. 根据权利要求1所述的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，其特征在于所述的荧光 示踪标记基团是含有罗丹明的标记分子。
3. 根据权利要求2所述的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，其特征在于所述的含有 罗丹明的荧光标记分子是通过罗丹明的活化酯，与聚赖氨酸的氨基以酰胺键的形式进行连 接。
4. 根据权利要求1所述的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，其特征在于所述的带有 二硫键的叠氮基团侧链，其一端是活化酯，通过聚赖氨酸的氨基以酰胺键的形式与纳米微 球载体相连接。
5. 根据权利要求1所述的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，其特征在于所述的药物 分子，是炔基修饰的药物衍生物，并能够通过点击化学的方法将其与纳米微球载体的叠氮 基团侧链相连接。
6. 权利要求1所述聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体的制备方法，其特征是该方法的 具体制备如下： 第1、向含有1%至5% Span-80的由汽油和四氯化碳组成的混合有机相中加入NHS-罗 丹明，其中汽油和四氯化碳的体积比可为1:3至3:1，溶解后再加入含有0. 2%-2%聚赖氨酸 的水溶液，10, 〇〇〇至20, 000转高速搅拌后得到乳化液；其中有机相和水相的比例为1:1至 5:1，NHS-罗丹明的用量为聚赖氨酸的0. 5%至10% ; 第2、将上述乳化液转移至分液漏斗中，分别加入上述体积比1:1至5:1的石油醚以及 水溶液，混合均匀后静置分层，收集水相，离心弃去沉淀，上清液即为自组装的聚赖氨酸荧 光纳米微球； 第3、向第2步得到的纳米微球溶液中加入叠氮化试剂Sulfo-SADP，室温搅拌反应0. 5 小时至5小时，得叠氮修饰的纳米微球； 其中Sulfo-SADP的用量为聚赖氨酸用量的10%至100% ; 第4、进一步将炔基修饰的药物缓慢滴入第3步得到的纳米微球溶液中，搅拌条件下加 入点击化学反应的催化剂，室温反应〇. 5小时至5小时，反应液经超滤浓缩，即为连接有药 物的荧光纳米微球；其中炔基修饰药物的用量为聚赖氨酸用量的10%至100%。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于第4项所述的炔基修饰的药物，是采用丙炔 酸与含有羟基的药物通过酯化的方式制备的丙炔酸酯，或采用丙炔胺与含有羧基的药物通 过酰胺化的方式制备的丙炔酰胺衍生物。
8. 权利要求1所述的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体的应用，用于被修饰药物在动 物组织以及细胞水平的示踪成像分析，以及靶点定位研究。
9. 权利要求1所述的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体的应用，用于在组织与细胞水 平捕获靶点蛋白，通过裂解二硫键能够释放出靶点蛋白及其关联蛋白。
【文档编号】B82Y5/00GK104146964SQ201410391369
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年8月11日
【发明者】白钢, 崔庆新, 侯媛媛, 姜民 申请人:南开大学