专利名称：对虾白斑杆状病毒的诊断试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及水产养殖生物病毒的诊断试剂盒及其检测方法，更具体涉及对虾白斑杆状病毒的诊断试剂盒及其检测方法。
1993年以来，我国虾病爆发性流行，引起养殖的对虾大面积死亡，经济损失惨重。研究表明，其主要是由一种新的没有包涵体的C型杆状病毒一对虾白斑杆状病毒所致。该病毒可以感染我国所有人工养殖的对虾种类，感染性强，发病快，死亡率高，给对虾养殖业带来极大的危害；据报道，其它国家和地区也有类似情况。目前，对对虾病毒病尚无有效的治疗方法，避免与病毒病源接触被认为是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速诊断。目前的诊断方法主要有多聚链反应(PCR)、核酸探针技术和酶联免疫吸附技术。PCR技术虽然灵敏度高，但费用昂贵，只有少数有经济实力的单位可使用。核酸探针技术对技术条件要求高，检测时间长，广大虾农掌握此技术难度很大，难以推广；酶联免疫吸附技术虽可在养虾场应用，但由于此法所需的多克隆抗体和单克隆抗体制备麻烦、费用高，限制了该技术的应用和发展。
早期快速诊断对虾白斑杆状病毒是目前对虾养殖的主要预防措施和减少虾农损失的有效途径，因此，快速、方便的诊断试剂盒及其检测方法是广大虾农急切盼望的。
本发明的目的是提供一种由噬菌体抗体展示技术制备的能识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1，以及以此为主体设计的对虾白斑杆状病毒的诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒可批量生产、成本低，操作简单、方便，能在实验室或养虾现场用于对虾白斑杆状病毒的检测；该检测方法可快速、方便地检测出对虾待测样品是否感染对虾白斑杆状病毒。
本发明的一种对虾白斑杆状病毒的诊断试剂盒由下列部件构成(1)、1号小管，内装能识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1，为大肠杆菌培养液冻干粉或大肠杆菌周质空间提取液冻干粉。
(2)、2号小管，内装抗单链抗体E-tag的兔抗鼠免疫球蛋白IgG/辣根过氧化物酶与脱脂奶粉/PBS的混合物。
(3)、3号小管，内装纯化对虾白斑杆状病毒。
(4)、4号小管，内装二氨基联苯胺。
(5)、5号小管，内装10x三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH 7.6(6)、6号小管，内装H2O2(7)、7号小管，内装重铬酸钾。
(8)、8号小管，内装吐温-20(9)、9号小袋，内装硝酸纤维素膜。
(10)、10号小袋，内装PBS盐类组合。
(11)、11号小袋，内装脱脂奶粉。
(12)、长方体盒子。
(13)、1块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，泡沫板的一边有8个孔，孔的大小正好可放入上述1～8号小管。
对虾白斑杆状病毒的检测装置的各部件按下列方式安置1～8号小管顺序放在泡沫板的8个孔中，9～11号小袋放在泡沫板的另一边。
对虾白斑杆状病毒的检测方法按下列步骤进行1)将待测样品对虾血淋巴液点于硝酸纤维素膜上。
2)将膜放入4％脱脂奶粉/PBS中，于室温放置0.5～3分钟。
3)再将膜浸入0.025mol/L重铬酸钾溶液中，室温放置9～11分钟，使对虾血淋巴中的氧化酶类失活。
4)用PBS将膜洗2～5次。
5)将膜与含有单链抗体A1的大肠杆菌培养液，在室温下保温5～15分钟。
6)用0.1％吐温-20/PBS将膜洗2～5次，再用PBS洗2～5次。
7)将膜与4％脱脂奶粉/PBS 1∶8000倍稀释的抗单链抗体E-tag的免抗鼠IgG/辣根过氧化物酶在室温下保温5～15分钟。
8)将膜用吐温-20/PBS洗2～5次，再用PBS洗2～5次。
9)将二氨基联苯胺和H2O2加入到50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-Hcl)，PH 7.6中，制成底物溶液，再将膜放入底物溶液中，反应5～15分钟，有褐色斑点即为病毒阳性。
其中1号小管中A1单链抗体的DNA序列如下GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAAGTTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTTATCCTGACAATGGTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGAATAACAGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGTGGTGGTAACCCCTGGGTACTGGGGTCAAGGCACCACTCTCTCCGTGTCACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTAGACGTCGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGNTATCNACAGAAACCAGGGCGATCTCCTAAAACACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCA其制备方法为首先从感病斑节对虾的血淋巴液中分离纯化白斑杆状病毒，将抗体片段的基因克隆到丝状噬菌体N-末端第三蛋白基因区域，表达的融合蛋白在噬菌体尾尖表面展示。具有抗原结合活力的抗体片段若由重链和轻链的可变区域组成，由一可弯曲的小肽连接成为氨基酸单链的形式，称为单链抗体。单链抗体片段的获得是通过PCR技术对免疫过或未免疫的小白鼠脾脏mRNA进行反转录和扩增，克隆到噬菌体表达载体上。具有抗原结合活力的噬菌体抗体可直接利用抗原亲和性从重组噬菌体抗体文库中淘选，通过再感染大肠杆菌及菌体扩增培养，可获得本发明所述的单链抗体A1。
其具体制备方法包括如下步骤1、采用蔗糖密度梯度超速离心法，用电镜检测，从感病斑节对虾的血淋巴液中分离纯化白斑杆状病毒。
2、用蛋白量为20～150μg纯化的完整对虾白斑杆状病毒粒子注射小鼠，用Titremax佐剂或福氏佐剂或氢氧化铝等常用佐剂，经17～26天进行二次或三次免疫，再经3～5天用酶联免疫印迹法和酶联免疫吸附法测定抗体效价，取抗体效价最高的小鼠脾脏，从中提取mRNA。
3、将此mRNA反转录为cDNA，再用对应于重链和轻链抗体可变部位DNA的引物通过PCR技术将抗体的重链和轻链的可变片段的DNA扩增。
4、用一编码可弯曲小肽的DNA小片段将重链和轻链DNA片段连接起来组成单链抗体DNA，再用对应单链抗体DNA的引物用PCR技术将整个片段扩增。
5、将单链抗体DNA片段两端的限制性内切酶位点(Sfi I和Not I)酶切，再与具同样酶切位点的噬菌体表达载体连接，电转移至大肠杆菌中，可获得较高效价的噬菌体抗体cDNA文库。
6、用吸附在朔料管壁上的对虾白斑杆状病毒对上述噬菌体抗体文库进行1～4次淘选，用酶联免疫吸附法筛选可得到抗原结合专一性的阳性克隆，该阳性克隆分泌的单链抗体可专一性识别对虾白斑杆状病毒。
7、选取具有较强ELISA信号的菌株，用于制备可溶性单链抗体，可得到专一识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1。
本发明的优点与效果单链抗体A1可直接用于诊断对虾白斑杆状病毒，适合对虾病毒病的早期检测，其制备方法比多克隆抗体和单克隆抗体要简便和便宜的多，且可大量制备。以单链抗体A1为主体设计的病毒检测试剂盒，实现了感染对虾白斑杆状病毒快速、简便、灵敏的检测需要，1小时内可检测100个样品，大大快于PCR和DNA杂交检测方法。
实施例1对虾白斑杆状病毒的诊断试剂盒，该试剂盒由下列部件组成(1)、1号塑料小管，内装能识别对虾白斑杆状病毒的A1单链抗体，用3ml大肠杆菌培养液冻干粉或100μl大肠杆菌周质空间提取液冻干粉。
(2)、2号塑料小管，内装0.5μl抗单链抗体E-tag的兔抗鼠免疫球蛋白IgG/辣根过氧化物酶(Pharmarcia公司购得)与脱脂奶粉/PBS混合的冻干粉。
(3)、3号塑料小管，内装纯化对虾白斑杆状病毒，冻干粉2μg。
(4)、4号塑料小管，内装二氨基联苯胺(DAB，华美公司购得)，固体6mg。
(5)、5号塑料小管，内装10X三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，pH 7.6，1ml(6)、6号塑料小管，内装10μl H2O2(7)、7号塑料小管，内装重铬酸钾，固体37mg。
(8)、8号塑料小管，内装吐温-20，0.1ml液体。
(9)、9号塑料小袋，内装50mm×80mm两片硝酸纤维素膜(国产)。
(10)、10号塑料小袋，内装PBS盐类组合3g。
(11)、11号塑料小袋，内装脱脂奶粉1g。
(12)、长方体盒子(11×7×3.5cm)。
(13)、1块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，泡沫板的一边有8个孔，孔的大小正好可放入上述1～8号小管。
对虾白斑杆状病毒的检测装置的各部件按下列方式安置1～8号小管顺序放在泡沫板的8个孔中，9～11号小袋放在泡沫板的另一边。
实施例2对虾白斑杆状病毒的检测方法，该方法按下列步骤进行(以下所用的塑料小管和塑料小袋的号均指实施例1中的号码)1、将3号塑料小管中的冻干粉溶于5ml纯净水中与5μl待测样品对虾血淋巴液分别点在9号塑料小袋中的硝酸纤维素膜上的不同位置，干后再放回9号塑料小袋中。
2、将300ml纯净水加入10号塑料小袋中，使PBS盐类完全溶解；再取25ml PBS加入11号塑料小袋中，制成4％脱脂奶粉/PBS。取5ml 4％脱脂奶粉/PBS放入9号塑料小袋中，于室温下保温1分钟，将液体倒出。
3、将7号塑料小管中的重铬酸钾溶于5ml纯净水中，再加入9号塑料小袋中，使硝酸纤维素膜浸入10分钟，使对虾血淋巴液中的氧化酶类失活。
4、用10ml PBS将膜清洗，将液体倒出，这样反复清洗3次。
5、将1号塑料小管中的单链抗体溶于3ml纯净水中，再将其加入9号小袋中，与膜在室温下保温10分钟。
6、将8号塑料小管中的吐温-20溶于100ml PBS，用其15ml×3将膜洗3次，再用10ml×3PBS洗三次。
7、将2号塑料小管中的二抗溶于3ml纯净水中，再将其加入7号小袋中，与膜在室温下保温10分钟。
8、将膜用吐温-20/PBS洗3次，再用PBS洗3次。
9、将5号塑料小管中的液体稀释10倍至10ml，再将其与4号和6号塑料小管中之物混合，制成底物溶液，再将膜放入底物溶液中，反应10分钟，有褐色斑点即为病毒阳性。
权利要求
1.一种对虾白斑杆状病毒的诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒由下列部件构成(1)、1号小管，内装能识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1，为大肠杆菌培养液冻干粉或大肠杆菌周质空间提取液冻干粉；(2)、2号小管，内装抗单链抗体E-tag的兔抗鼠免疫球蛋白IgG/辣根过氧化物酶与脱脂奶粉/PBS的混合物；(3)、3号小管，内装纯化对虾白斑杆状病毒；(4)、4号小管，内装二氨基联苯胺；(5)、5号小管，内装10X三羟甲基氨基甲烷一盐酸(Tris-HCl)，pH 7.6；(6)、6号小管，内装H2O2；(7)、7号小管，内装重铬酸钾；(8)、8号小管，内装吐温-2O；(9)、9号小袋，内装硝酸纤维素膜；(10)、10号小袋，内装PBS盐类组合；(11)、11号小袋，内装脱脂奶粉；(12)、长方体盒子；(13)、1块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，泡沫板的一边有8个孔，孔的大小正好可放入上述1～8号小管；对虾白斑杆状病毒的诊断试剂盒各部件按下列方式安置1～8号小管顺序放在泡沫板的8个孔中，9～11号小袋放在泡沫板的另一边。
2.一种使用对虾白斑杆状病毒诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，该检测方法顺序按下列步骤进行(1)、将待测样品对虾血淋巴液点于硝酸纤维素膜上；(2)、将膜放入4％脱脂奶粉/PBS中，于室温放置0.5～3分钟；(3)、再将膜浸入0.025mol/L重铬酸钾溶液中，室温放置9～11分钟，使对虾血淋巴中的氧化酶类失活；(4)、用PBS将膜洗2～5次；(5)、将膜与含有单链抗体A1的大肠杆菌培养液，在室温下保温5～15分钟；(6)、用0.1％吐温一2O/PBS将膜洗2～5次，再用PBS洗2～5次；(7)、将膜与4％脱脂奶粉/PBS 1∶8000倍稀释的抗单链抗体E-tag的兔抗鼠IgG/辣根过氧化物酶在室温下保温5～15分钟；(8)、将膜用吐温-20/PBS洗2～5次，再用PBS洗2～5次；(9)、将二氨基联苯胺和H2O2加入到50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-Hcl)，PH 7.6中，制成底物溶液，再将膜放入底物溶液中，反应5～15分钟，有褐色斑点即为病毒阳性。
全文摘要
本发明提供了一种对虾白斑杆状病毒的诊断试剂盒及其检测方法,以单链抗体A1为主体设计的病毒检测试剂盒,实现了感染对虾白斑杆状病毒快速、简便、灵敏的检测需要,其检测方法利用诊断试剂盒可在1小时内快速、简便、灵敏地检测100个对虾样品,大大优于PCR和DNA杂交检测方法。
文档编号G01N33/569GK1356550SQ00131230
公开日2002年7月3日 申请日期2000年12月8日 优先权日2000年12月8日
发明者戴和平, 高宏, 赵新颜, 戴玲芬, 张宪孔, 赵若虹, 韩明申, M Hanmingsen) (Seam, 高坤山 申请人:中国科学院水生生物研究所