专利名称：：Ⅱ型胶原酶联免疫检测分析方法
技术领域：
：本发明涉及免疫检测分析领域，具体涉及到一种Ⅱ型胶原酶联免疫检测分析方法。众所周知，Ⅱ型胶原是一种大分子蛋白，主要存在于人体的透明软骨中，软骨中80-90％的结构成分是Ⅱ型胶原，当骨性关节炎发生时，关节软骨降解，软骨中Ⅱ型胶原丢失并释放进入血液，导致血液中Ⅱ型胶原浓度增加，当前世界范围内老年人口逐年增加，随着社会的老龄化，骨性关节炎患者发病率呈明显上升趋势，目前，对于骨性关节炎的早期诊断，软骨降解的变化规率及关节炎手术后效果的判断等许多方面的国内外的研究都非常欠缺，其原因就是没有一种稳定性、敏感性及特异性都较高的测定软骨胶原含量的检测方法，近些年来，国内外学者对Ⅱ型胶原含量的测定也进行了一些研究，1993年，美国杂志《免疫方法学》第159期上公开了一种用竞争酶联法测定Ⅱ型胶原，从理论上探讨了Ⅱ型胶原测定的方法，但是，这种方法仅限于对细胞培养基中抗原的含量以及关节软骨样品中抗原含量的测定，而且测定结论对于了解关节软骨中软骨降解的病理变化规律，探讨早期诊断指标及关节病变的严重程度，只能起到在理论上分析研究的作用，应用范围较窄，如作为指导改进治疗方法的依据，则还不够全面和充分。在酶联免疫分析中，对于各类的抗原测定，通常采用的是双抗体夹心法，即选用两种不同的单克隆抗体对样品抗原进行夹心测定，这种测定方法需要选配同种异型两株抗二型胶原的抗体，比较复杂，当仅有一株抗体时这种方法就不能应用，使用范围受到限制。本发明的目的是提供一种具有较高稳定性、灵敏度及特异性的Ⅱ型胶原酶联免疫检测分析方法，利用该方法可以只用一株单克隆抗体就可夹心进行血清中Ⅱ型胶原含量的测定。本发明是利用多种试剂对酶联免疫用96孔板采用免疫学抗原检测原理对血清样品Ⅱ型胶原测定，本发明的目的是通过下述方法来实现的，其特点在于包括下列步骤(1)包板用Ph9．6，50mMol／l的碳酸盐缓冲液稀释鼠抗人Ⅱ型胶原Ⅱ-4C11单克隆抗体，浓度为4ug／ml，将抗体包被液加入酶联板中200ul／孔，放37℃1小时，或放4℃过夜。(2)洗板将板内包被液弃去，用洗板机每孔加入洗液300ul，洗板3次；如人工洗板，则洗板5次，每次放置5分种。(3)封板每孔加入灭活正常兔血清封板液200ul，放室温(25℃左右)2小时。(4)洗板同步骤(2)(将板放入0-4℃冰箱待用)。(5)加样将人或动物样品及质控血清用分析缓冲液稀释50倍，然后取100ul分别加入每孔，放37℃孵育2小时。(6)洗板同步骤(2)。(7)加入抗体将鼠抗人Ⅱ型胶原Ⅱ-C4ll单克隆抗体用50mM，PH7．4的分析缓冲液稀释成3ug／ml，向板中每孔加入100ul，放37℃孵育1小时。(8)洗板同步骤(2)。(9)用50mM，PH7．4的分析缓冲液将酶标羊抗鼠IgG做1∶1000的稀释，向板中每孔加入100ul，放37℃孵育0．5小时。(10)洗板同步骤(2)反复3次。(11)取等体积A，B底物液混均，每孔加入200ul，放室温15-20分种。(12)加入终止液，每孔50ul。(13)用酶免测定仪在450nm波长处测定吸光率。在上述步骤中，其中封板液的配制，采用灭活正常兔血清将正常兔血清放62℃20分种，加入0．05M固体Tris，0．15M氯化纳(NaCL)及2M氯化氢(HCL)，将Ph调至8．0，制成封板液。底物液的配制(1)Ph5．0柠檬酸-磷酸缓冲液(A液)0．1M柠檬酸24．3ml；0．2M磷酸氢二钠(Na2HPO4)25．7ml；50ml双蒸水，30％过氧化氢(H2O2)50ul。(2)配制TMB溶液(B液)；25mg3’3’5’5’四甲基联苯胺(TMB)溶于4ml二甲基桠枫中，再加入96ml50mmol／LPh2．4柠檬酸。用时取等体积A，B底物液混均。在采用上述方法，对骨性关节炎患者及正常人的血清样品进行Ⅱ型胶原的半定量测定或者是对骨性关节炎手术前后血清样品进行Ⅱ型胶原的测定，以及对豚鼠血清样品中Ⅱ型胶原的测定，其结果是通过吸光率测定得出多组吸光度数值，从而间接得出Ⅱ型胶原的含量，并通过多组数值的对比分析，就可了解软骨降解的病理变化规律及关节病的严重程度，并可作为改进治疗方法的依据。由于本发明首次利用血清进行Ⅱ型胶原酶联免疫测定，并且只使用一株单克隆抗体进行对胶原的夹心测定使得在仅有一株单抗的有限条件下也可对Ⅱ型胶原进行半定量的检测，扩大了检测的应用范围，同时由于对血清能够进行Ⅱ型胶原含量测定，不但较准确地反映出手术前后软骨病理变化规律，也可以正确评价手术效果，即有重要的理论价值，又有广泛的实际应用意义。下面结合实施例详述本发明。一、实验材料准备1．血清样品A．骨性关节炎患者血清65例正常人对照组血清24例B．骨性关节炎手术前血清24例骨性关节炎手术后血清24例C．骨性关节炎患者截骨术前，截骨术后半年、一年的血清样品各11份。D．豚鼠血清样品包括1月龄(正常软骨)组，3月龄(破坏软骨)8月龄(重度破坏软骨)组，每组10例。2．酶联免疫标准用96孔板。3．试剂制备(1)鼠抗人Ⅱ型胶原Ⅱ-4Cll单克隆抗体一株。(2)配置Ph9．6，50mMol／l碳酸盐包被缓冲液碳酸钠Na2CO31．59g；碳酸氢钠NaHCO32．93g；加双蒸水1000ml，放4℃保存。(3)配置Ph7．4的磷酸盐缓冲液为洗板液(PBST)氯化钠(NaCL)2g；磷酸二氢钾(KH2PO4)0．2g；磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)2．9g；氯化钾(KCL)O．2g；加双蒸水1000ml；加吐温(Tween)20；0．5ml(加量要准)，放4℃保存。(4)封板液配制，采用灭活正常兔血清，将正常兔血清放62℃20分钟，加入0．05M固体Tris，0．15M氯化纳(NaCL)及2M氯化氢(HCL)，将Ph调至8．0，制成封板液备用。(5)配置50mMol／lPh7．4的分析缓冲液(PBS)氯化钠(NaCL)2g；磷酸二氢钾(KH=PO4)0．2g，磷酸氢二纳(Na2HPO412H2O)2．9g；氯化钾(KCL)0．2g；牛血清白蛋白(BSA)2g及9g氯化钠(NaCL)，加双蒸水至1000ml；放4℃保存。(6)羊抗鼠IgG的制备首称用盐析法纯化出正常鼠血清中的IgG，再按常量免疫法制备出羊抗鼠抗血清，取出抗血清后，再用盐析法分离纯化出羊抗鼠IgG，放-20℃保存。(7)酶标羊抗鼠IgG的制备，采用改良过碘酸钠法标记。加入BSA补到10mg／ml蛋白浓度，再分管低温保存备用。(8)底物液配制A液(Ph5．0柠檬酸-磷酸缓冲液)0．1M柠檬酸24．3ml；0．2M磷酸氢二钠(Na2HPO4)25．7ml；50ml双蒸水；30％过氧化氢(H2O2)50ul。B液(TMB溶液)25mg3’3’5’5’四甲基联苯胺溶于4ml二甲基桠枫中再加入96ml50mmol／LPh2．4柠檬酸。用时取等体积A、B底物液混均。(9)终止液2N氯化氢(HCL)。操作步骤采用本发明方法步骤(1)-(13)进行操作，其中在步骤(5)中加入不同的经50倍稀释的各组血清样品，分别进行Ⅱ型胶原的测定，得出不同的测试数据，见下表表1正常人与骨性关节炎患者血清指标比较<tablesid="table1"num="001"><table>项目正常人(n=24)患者总数(n=65)A组(n=9)B组(n=12)C组(n=33)D组Ⅱ型胶原(OD450)2．48±0．873．37±1．002．8±1．183．95±1．153．45±0．862．96±1．03</table></tables>表2骨性关节炎手术前后血清指标的比较表311例截骨术的骨性关节炎患者手术后半年、一年与述前显著性比较<tablesid="table2"num="002"><table>项目术前术后半年术后一年Ⅱ型胶原3．87±0．813．70±0．763．39±0．86</table></tables>表4在雌性豚鼠原发性骨性关节炎动物模型中的应用(不同阶段关节软骨与正常软骨的比较)<tablesid="table3"num="003"><table>项目1月龄，电镜下正常软骨(一组)3月龄，电镜下重度破坏软骨(二组)8月龄，电镜下重度破坏软骨(三组)Ⅱ型胶原OD4500．74±0．1621．306±0．551．193±0．37</table></tables>通过表1中的数值可看出患者及实验动物血清中Ⅱ型胶原含量反映出的吸光度数值比正常人的数值明显增加，对于豚鼠动物的测定结果也证实了这个结论，而对于手术后患者血清中Ⅱ型胶原含量的吸光度数值则明显低于手术前的患者，对于这些结论则证明了本发明具有较高的稳定性，灵敏度及特异性，其灵敏度在本实验使用的血清经50倍稀释后，正常人范围OD450值在A3．35-1．61之间，而特异性在本方法与Ⅰ型胶原的反应为0．1％，精密度指标为测定的批内变异系数为6．3％，批间变异系数为9．8(n)，证明了本方法有很好的可重复性，稳定性高。权利要求1．一种Ⅱ型胶原酶联免疫检测分析方法，其特征在于包括下列步骤(1)包板用Ph9．6，50mMol／l的碳酸盐缓冲液稀释鼠抗人Ⅱ型胶原Ⅱ-4C11单克隆抗体，浓度为4ug／ml，将抗体包被液加入酶联板中200ul／孔，放37℃1小时，或放4℃过夜；(2)洗板将板内包被液弃去，用洗板机每孔加入洗液300ul，洗板3次；如人工洗板，则洗板5次，每次放置5分种；(3)封板每孔加入灭活正常兔血清封板液200ul，放室温(25℃左右)2小时；(4)洗板同步骤(2)(将板放入0-4℃冰箱待用)；(5)加样将人或动物样品及质控血清用分析缓冲液稀释50倍，然后取100ul分别加入每孔，放37℃孵育2小时；(6)洗板同步骤(2)；(7)加入抗体将鼠抗人Ⅱ型胶原Ⅱ-C411单克隆抗体用50mM，PH7．4的分析缓冲液稀释成3ug／ml，向板中每孔加入100ul，放37℃孵育1小时；(8)洗板同步骤(2)；(9)用50mM，PH7．4的分析缓冲液将酶标羊抗鼠IgG做1∶1000的稀释，向板中每孔加入100ul，放37℃孵育0．5小时；(10)洗板同步骤(2)反复3次；(11)取等体积A，B底物液混均，每孔加入200ul，放室温15-20分种；(12)加入终止液，每孔50ul；(13)用酶免测定仪在450nm波长处测定吸光率。2．根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于所述封板液的配制为采用灭活正常兔血清将正常兔血清放62℃20分种，加入0．05M固体Tris，0．15M氯化纳(NaCL)及2M氯化氢(HCL)，将Ph调至8．0。3．根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于所述的底物液的配制为(1)Ph5．0柠檬酸-磷酸缓冲液(A液)0．1M柠檬酸24．3ml；0．2M磷酸氢二钠(Na2HPO4)25．7ml；50ml双蒸水，30％过氧化氢(H2O2)50ul；(2)配制TMB溶液(B液)25mg3’3’5’5’四甲基联苯胺(TMB)溶于4ml二甲基桠枫中，再加入96ml50mmol／LPh2．4柠檬酸。全文摘要本发明公开了一种Ⅱ型胶原酶联免疫检测分析方法,利用一株单克隆抗体通过抗体包板、洗板、封板、加样、再加入同一株抗体、加入酶标二抗及底物液后加入终止液,测定吸光率等程序步骤,对关节炎患者或动物的血清进行Ⅱ型胶原吸光度的测定,通光多组测定值与正常值进行比较,就可得出Ⅱ型胶原含量的半定量结果,从而就可了解软骨降解的病理变化规律,正确评价手术效果,具有广泛的应用意义。文档编号G01N33/535GK1289924SQ0013013公开日2001年4月4日申请日期2000年10月16日优先权日2000年10月16日发明者赵丹惠,李成文,张艳,姚力申请人:北京市创伤骨科研究所