专利名称：P－选择蛋白、p－和e－选择蛋白复合物的晶体结构及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及P-选择蛋白的凝集素和EGF样(LE)域的晶体和三维结构，均与SLeX复合的P-选择蛋白LE和E-选择蛋白LE的晶体和三维结构，以及与通过酪氨酸硫酸化和SLeX修饰的功能PSGL-1肽复合的P-选择蛋白LE的晶体和三维结构。这些结构对于设计和选择可干扰炎症过程中白细胞的细胞滚动(cellular rolling)的试剂至关重要。
背景技术：
选择蛋白是一个细胞表面糖蛋白家族，负责白细胞向炎症部位募集(recriutment)的早期粘附事件及其向淋巴组织的迁移(Kansas，1996和Vestweber和Blanks，1999综述)。作为多步过程的一部分(Springer，1994)，选择蛋白促进白细胞在血管壁上的最初粘附(粘连)及随后的滚动，由于暴露于局部产生的化学因子，白细胞被激活。整联蛋白介导的白细胞的牢固粘附先于白细胞向下面组织的渗出。P-选择蛋白(CD62P)和E-选择蛋白(CD62E)受炎症刺激影响在血管内皮表面诱导。P-选择蛋白也由活化的血小板表达，在被炎症介质诱导后，在几分钟内从胞内储藏所移位到细胞表面。E-选择蛋白被转录调节并在血管内皮激活数小时内出现。L-选择蛋白(CD62L)是选择蛋白家族的第三个成员，在白细胞上组成型表达。除了在炎症中的作用外，L-选择蛋白还介导淋巴细胞在由血管向淋巴组织迁移过程中与特化的高内皮微静脉的附着。
选择蛋白共有许多结构和功能性质。它们含有高度同源的N端钙依赖的(C-型，Drickamer，1988)凝集素域、表皮生长因子(EGF)样域、数量不等的补体调节样单元、跨膜域和胞内区。公认选择蛋白结合主要通过凝集素域与对面细胞上的聚糖配体之间的弱蛋白质-碳水化合物相互作用介导。已经描述了大量不同的聚糖结构能支持和/或抑制选择蛋白结合。然而，唾液酰LewisX(SLeX，NeuNAc2，3Gal1，4[Fuc1，3] GlcNAc)四糖展示的表位和相关结构似乎是所有3种选择蛋白共有的生理相关识别成分(Foxall等人，1992)。不同结构的表观高亲和力(或亲合力)的特异糖蛋白反受体的分离提示用于识别的其它因子。包括GlyCAM-1(Lasky等人，1992)、MAdCAM-1(Berg等人，1993)、CD34(Baumheuter等人，1993)、ESL-1(Levinovitz等人，1993)和PSGL-1(Moore等人，1992；Sako等人，1993)。然而，只有有限的证据表明，这些高度糖基化的蛋白质实际上提高细胞或组织特异的糖基化能力(即产生SLeX-样聚糖的能力)，而不是特异糖蛋白的表达，最终导致选择蛋白反应性。一个明确的例外是PSGL-1，它是实际上由白细胞的所有亚类表达的一种粘蛋白样同型二聚体糖蛋白(Yang等人，1999，McEver和Cummings，1997综述)。预计P-选择蛋白识别将依赖于PSGL-1粘蛋白样区内的聚糖的SLeX-样修饰，它是定位于粘蛋白域之外的多肽骨架的阴离子、N-端部分的一个必需结合表位(Pouyani和Seed，1995；Sako等人，1995；Wilkins等人，1995)。大量研究证实，将该多肽决定簇靶定PSGL-1内能大大减弱P-选择蛋白介导的结合和体内炎症反应(McEver和Cummings，1997；Yang等人，1999)。而且，最近对PSGL-1遗传缺陷小鼠的研究显示，P-选择蛋白介导的白细胞滚动和炎症募集明显缺陷(Yang等人，1999)。因此，PSGL-1是选择蛋白反受体的一个例子，其中多肽和SLeX-修饰聚糖成分是生理相关结合所需的。
根据它们在脉管系统内遇到的剪切应力影响下作为细胞粘附和滚动介质的独特功能，为表征选择蛋白相互作用的内在的生物物理和分子基础进行了大量工作。选择蛋白与其配体结合和解离具有快速的结合动力学(Alon等人，1997；Alon等人，1995)，这一特性似乎部分负责它们介导短暂粘连和细胞滚动现象的能力。似乎也涉及其它因素，包括选择蛋白相互作用的机械(Alon等人，1995；Puri等人，1998)和独特结构特性(Chen等人，1997)，但是由于缺乏与生理配体复合的选择蛋白的高分辨率分子结构，它们仍未完全表征。为了克服这种限制已经进行了大量努力，但迄今为止仍未完成。以前曾经描述了含有凝集素和EGF域(lec/EGF)的E-选择蛋白构建体的X-射线晶体结构(Graves等人，1994)，结合定点诱变研究(Kansas，1996)提示位于凝集素域内的推断的SLeX结合部位。用与寡甘露糖结合的同源大鼠血清甘露糖结合蛋白(MBP-A)的X-射线晶体结构(Weis等人，1992)作为指导，根据SLeX的游离或结合溶液结构的分子停靠(docking)(Poppe等人，1997，和此处的参考文献)，提出了SLeX与E-选择蛋白晶体结构结合的模型(Graves等人，1994；Kogan等人，1995；Poppe等人，1997)。然而，还没有确定与SLeX-样糖配体复合的E-选择蛋白或其它选择蛋白的结构，来证实这些假说。实际上，在本发明之前，由于用来形成选择蛋白晶体的高浓度钙的阻断作用，不能获得这种晶体。
迄今为止，突变后含有E-选择蛋白残基的MBP-A(K3突变体)与SLeX和有关聚糖共复合的晶体结构(Ng和Weis，1997)是选择蛋白如何与其配体结合的唯一直接信息。总而言之，这些模型和实验确定的结构支持这样一种SLeX结合模式Fuc部分的两个羟基与凝集素域结合钙连接，其它的结合作用也许由Gal的羟基和NeuNAc的羧酸部分介导。然而，该模型和MBP-A K3突变体/SLeX晶体结构在结合部位内SLeX的方向和分子接触的同一性上不同。
对高亲和力P-选择蛋白/PSGL-1相互作用的结构基础的了解也是不完全的，识别取决于碳水化合物和多肽成分的发现使其更加复杂。诱变研究集中于PSGL-1的N端，证实P-选择蛋白同时识别PSGL-1多肽阴离子区内的一个或多个硫酸酪氨酸残基和可能位于该区的含SLeX的O-聚糖(Pouyani和Seed，1995；Ramachandran等人，1999；Sako等人，1995；Wilkins等人，1995)。尽管预计推断的SLeX结合部位在选择蛋白之间类似，并且也许参与PSGL-1的SLeX成分与P-选择蛋白的结合，但是介导与PSGL-1多肽相互作用的P-选择蛋白域的身份和结构基础还不清楚。在对于白细胞向炎症部位补充方面也许十分重要的嗜中性粒细胞-嗜中性粒细胞相互作用中，L-选择蛋白也识别PSGL-1(Kansas，1996；Vestweber和Blanks，1999)。这种相互作用也受PSGL-1多肽N端突变的影响(Ramachandran等人，1999)，提示P-选择蛋白和L-选择蛋白有共同的结合条件。相反，还没有证实E-选择蛋白与PSGL-1或其它显示SLeX的反受体的结合需要多肽成分。
发明概述本发明提供P-选择蛋白的凝集素和EGF样(LE)域(“P-选择蛋白LE”)的晶体，以及由P-选择蛋白LE晶体的X-射线衍射数据得出的P-选择蛋白LE的三维结构。具体而言，P-选择蛋白LE的三维结构由图2所示的结构坐标定义，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。P-选择蛋白LE三维结构的结构坐标可用于大量用途，包括但不限于P-选择蛋白LE的不同活性部位(包括SLeX结合部位)的显示、鉴定和表征。这些活性部位结构然后可用于设计可与P-选择蛋白LE相互作用的试剂，以及与SLeX、PSGL-1或有关分子复合的P-选择蛋白LE。
本发明也提供与SLeX复合的P-选择蛋白LE的晶体，以及由P-选择蛋白LE∶SLeX晶体的X-射线衍射数据得出的P-选择蛋白LE和SLeX的三维结构。具体而言，P-选择蛋白LE和SLeX的三维结构由图3所示的结构坐标定义，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。P-选择蛋白LE和SLeX的结构坐标可用于大量用途，包括但不限于P-选择蛋白、SLeX和P-选择蛋白LE∶SLeX复合物的不同活性部位(包括SLeX结合部位)的显示、鉴定和表征。这些活性部位结构然后可用于设计可与P-选择蛋白LE、SLeX相互作用的不同试剂，以及与SLeX、PSGL-1或有关分子复合的P-选择蛋白LE。
本发明还提供与SLeX复合的E-选择蛋白的凝集素和EGF(LE)域(“E-选择蛋白LE”)的晶体，以及由E-选择蛋白LE∶SLeX晶体的X-射线衍射数据得出的E-选择蛋白LE和SLeX的三维结构。具体而言，E-选择蛋白LE和SLeX的三维结构由图4所示的结构坐标定义，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。E-选择蛋白LE和SLeX的三维结构坐标可用于大量用途，包括但不限于E-选择蛋白LE、SLeX和E-选择蛋白LE∶SLeX复合物的不同活性部位(包括SLeX结合部位)的显示、鉴定和表征。这些活性部位结构然后可用于设计可与E-选择蛋白LE、SLeX相互作用的不同试剂，以及与SLeX、PSGL-1或有关分子复合的E-选择蛋白LE。
另外，本发明提供了与通过酪氨酸硫酸化和SLeX修饰的功能性PSGL-1肽复合的P-选择蛋白LE的晶体结构，以及由P-选择蛋白LE∶PSGL-1肽晶体的X-射线衍射数据得出的P-选择蛋白LE和PSGL-1肽的三维结构。具体而言，P-选择蛋白LE和PSGL-1肽的三维结构由图5所示的结构坐标定义，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。P-选择蛋白LE和PSGL-1肽的结构坐标可用于大量用途，包括但不限于P-选择蛋白LE、PSGL-1肽和P-选择蛋白LE∶PSGL-1复合物的不同活性部位(包括SLeX和PSGL-1结合部位)的显示、鉴定和表征。这些活性部位结构然后可用于设计可与P-选择蛋白LE、PSGL-1相互作用的不同试剂，以及与SLeX、PSGL-1或有关分子复合的P-选择蛋白LE。
本发明也涉及SLeX结合蛋白或肽的活性部位，优选地P-选择蛋白LE的SLeX结合部位，它包括根据图3的氨基酸残基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。此外，除了上述结构坐标外，该活性部位还包括根据图3的氨基酸残基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。SLeX活性部位可对应于P-选择蛋白LE在与一种试剂(优选地SLeX)结合状态或未结合状态的构型。
本发明还涉及SLeX结合蛋白或肽的活性部位，优选地E-选择蛋白LE的SLeX结合部位，它包括根据图4的氨基酸残基TYR48、GLU80、ASN82、ASN83、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。此外，除了上述结构坐标外，该活性部位还包括根据图4的氨基酸残基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。SLeX活性部位可对应于E-选择蛋白LE在与一种试剂(优选地SLeX)结合状态或未结合状态的构型。
另外，本发明提供了PSGL-1结合蛋白或肽的活性部位，优选地P-选择蛋白LE的PSGL-1结合部位，它包括根据图5的氨基酸残基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和结合锶的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。此外，除了上述结构坐标外，该活性部位还包括根据图5的氨基酸残基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。PSGL-1活性部位可对应于P-选择蛋白LE在与一种试剂(优选地PSGL-1或PSGL-1肽)结合状态或未结合状态的构型。
另外，本发明还提供一种鉴定可与P-选择蛋白LE相互作用的试剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图2、图3或图5的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生P-选择蛋白LE的三维模型；(b)用该三维结构设计或选择一种试剂。
另外，本发明还提供一种鉴定含有SLeX结合部位的分子或分子复合物的激活剂或抑制剂的方法，包括下列步骤(a)利用(i)根据图3的残基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，或(ii)根据图4的氨基酸残基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生含有SLeX结合部位的分子或分子复合物的三维模型；(b)用步骤(a)产生的三维模型进行计算机拟合分析，选择或设计候选激活剂或抑制剂。在另一个实施方案中，根据图3的相对结构坐标还包括氨基酸残基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。在另一个实施方案中，根据图4的相对结构坐标还包括氨基酸残基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
本发明还提供一种鉴定含有PSGL-1结合部位的分子或分子复合物的激活剂或抑制剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图5的氨基酸残基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和结合锶的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生含有PSGL-1结合部位的分子或分子复合物的三维模型；(b)用步骤(a)产生的三维模型进行计算机拟合分析，选择或设计候选激活剂或抑制剂。在另一个实施方案中，根据图5的相对结构坐标还包括氨基酸残基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
另外，本发明还提供一种鉴定可与SLeX相互作用的试剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图3或图4的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生SLeX的三维模型；(b)用该三维结构设计或选择可与SLeX相互作用的试剂。
另外，本发明还提供一种鉴定可与PSGL-1相互作用的试剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图5的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生PSGL-1肽的三维模型；(b)用该三维结构设计或选择可与PSGL-1相互作用的试剂。
本发明也提供利用上述方法鉴定的试剂、激活剂或抑制剂。抑制或以其它方式干扰选择蛋白介导的白细胞在血管组织上滚动的小分子或其它试剂可用于治疗与异常炎症反应有关的疾病，如哮喘和牛皮癣。
最后，本发明提供一种方法，用于获得E-选择蛋白型分子与可配位钙的化合物的结晶复合物。该方法包括下列步骤(a)在钙离子和PEG存在下，使结晶的E-选择蛋白型分子与可配位钙的化合物接触，形成E-选择蛋白型分子与可配位钙的化合物的结晶复合物；(b)在浓度降低的钙离子和足够浓度的PEG和离子盐存在下，接触结晶复合物，获得最终的结晶复合物，它们在冷却后，适于根据最终结晶复合物的X-射线衍射阐明E-选择蛋白型分子和可配位钙的化合物的三维结构。
通过下列描述，本发明的其它目的将是显然的。
附图简述
图1A、1B和1C显示PSGL-119ek肽的解析和BIAcore亲和力分析。
图1A通过阴离子交换层析解析的PSGL-1 19ek肽谱。参见峰标记的定义文本。插图主要PSGL-1 19ek肽SGP-3的结构。＜Q表示N端Gln残基环化为焦谷氨酸盐，代表Tyr残基的硫酸化。编号肽序列中的划线标出与肠激酶接头区结合的非PSGL-1来源的残基。
图1B-1和1B-2溶液相P-LE与固定PSGL-1构建体结合的典型BIAcore传感图。P-LE(800nM浓度)注射到sPSGL(图1B-1)和SGP-3(图1B-2)上。注射P-LE的修饰较少的SGP-3形式的结合信号(未显示)与结合动力学的结果相同。同时注射溶液相SGP-3可抑制P-LE与sPSGL和SGP-3的结合(点线)，但注射不含酪氨酸硫酸化或糖基化的合成肽不抑制(短划线)，两者浓度均为20μM。所有曲线都反映了从总结合中减去非特异结合产生的特异结合。
图1C-1-图1C-6通过BIAcore分析对可与固定sPSGL和纯化19ek肽反应的溶液相P-LE的结合亲和力测定。第一行，从左到右sPSGL(图1C-1)、SGP-3(图1C-2)和SGP-2(图1C-3)。第二行，从左到右SGP-1(图1C-4)、GP-1(图1C-5)和SP-1(图1C-6)。指定浓度的P-LE与固定配体(测定总结合信号)和不含配体的对照细胞(测定非特异结合)反应。显示了P-LE每一浓度的平衡反应(Req)。在检测的每一P-LE浓度时，从总结合信号(菱形)中减去非特异反应(三角形)测定特异结合信号(正方形)。KD和标准差(显示)用BIA评价软件(BIAcore)通过特异结合曲线的线性拟合确定，是3-10次不同实验的结果。利用线性拟合测定的KD与斯卡查德图的线性回归分析确定的值(未显示)十分一致。
图2列出了通过P-选择蛋白LE晶体的X-射线衍射获得的P-选择蛋白LE的原子结构坐标。“原子类型”是指测量其坐标的原子。“残基”是指测量的每个原子是它的一部分的类型或残基，即氨基酸、辅因子、配体或溶剂。“x，y和z”坐标是指测量的每个原子在单位细胞内的位置()的笛卡尔坐标。“Occ”是指占用率。“B”是指“B值”，它是原子在原子结构中如何运动的量值(2)。“MOL”是指用于鉴定晶体中每个分子的片段标识。“MOL”、“MOLA”、“MOLB”、“MOLC”和“MOLD”是指P-选择蛋白LE的每个分子，“SOLV”是指水分子，“MPDS”是指MPD分子，“CALS”是指钙离子。由于结构杂乱，P-选择蛋白的Lys17(MOLA)、Lys17(MOLC)和Asn57(MOLC)显示为丙氨酸。
图3列出了通过P-选择蛋白LESLeX晶体的X-射线衍射获得的P-选择蛋白LE和SLeX的原子结构坐标。图题如图2所述，不同之处是“MOL”、“A”、“B”、“C”和“D”是指P-选择蛋白LE的每个分子，和SLeX，MDP分子和钙离子不标记为“MOL”。然而，SLeX、MDP分子和钙离子视为“残基”。由于结构杂乱，P-选择蛋白的Lys17(MOLA)、Lys17(MOLC)和Asn57(MOLC)显示为丙氨酸。
图4列出了通过P-选择蛋白LESLeX晶体的X-射线衍射获得的E-选择蛋白LE和SLeX的原子结构坐标。图题如图2所述，不同之处是“MOL”、““SOLV”是指水分子，E-选择蛋白LE、SLeX和钙不标记为“MOL”。然而，E-选择蛋白LE、SLeX和钙视为“残基”。
图5列出了通过P-选择蛋白LE∶PSGL-1肽晶体的X-射线衍射获得的P-选择蛋白LE和PSGL-1肽的原子结构坐标。除了图5不包括“MOL”图题之外，图题如图2所述。然而，P-选择蛋白LE的每个分子、PSGL-1肽、水和MPD视为“残基”。由于结构杂乱，P-选择蛋白的Asn57(MOLA)、Lys58(MOLA)、Asn71(MOLA)、Arg22(MOLB)、Asn57(MOLB)、Lys58(MOLB)、Glu72(MOLB)、Met125(MOLB)和Arg157(MOLB)显示为丙氨酸。
图6A、6B和6C列出了P-选择蛋白(图6A)、E-选择蛋白(图6B)和PSGL-1(图6C)的氨基酸序列。用来形成晶体构建体的序列片段以下划线标出。
发明详述在此使用时，下列术语和短语具有以下所述的含义除非另外说明，“选择蛋白”是一个细胞表面糖蛋白家族，负责白细胞向炎症部位募集的早期粘附事件及其向淋巴组织的迁移，包括P-选择蛋白、E-选择蛋白和L-选择蛋白，和具有选择蛋白活性的类似物。P-选择蛋白优选地具有图6A所示的氨基酸序列，包括保守置换。E-选择蛋白优选地具有图6B所示的氨基酸序列，包括保守置换。“E-选择蛋白型分子”包括完整的E-选择蛋白分子及其部分，如凝集素和/或表皮生长因子(EGF)样域，优选地是如下定义的“E-选择蛋白LE”。
“LE域”是选择蛋白的凝集素和表皮生长因子(EGF)样域，在此使用时，“P-选择蛋白LE”是P-选择蛋白的凝集素和EGF样域，而“E-选择蛋白LE”是E-选择蛋白的凝集素和EGF样域。P-选择蛋白LE和E-选择蛋白LE的氨基酸序列分别示于图6A和6B中(下划线)，包括保守置换。
“SLeX”是唾液酰LewisX(SLeX，NeuNAc2，3Gall，4[Fuc1，3]GlcNAc)四糖，包括与SLeX有类似结构和活性的“SLeX类似物”。“SLeX结合蛋白或肽”是可与SLeX结合并含有SLeX结合部位的蛋白质或肽，包括但不限于P-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白LE和E-选择蛋白LE。“含有SLeX结合部位的分子或分子复合物”包括(i)P-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白LE、E-选择蛋白LE，(ii)P-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白LE或E-选择蛋白LE与SLeX的复合物，(iii)P-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白LE或E-选择蛋白LE与其它分子的复合物，(iv)含有SLeX结合部位的其它分子或分子复合物。
“PSGL-1”是具有PSGL-1活性的分子，包括如下定义的“PSGL-1肽”。PSGL-1的氨基酸序列示于图6C中，包括其保守置换。“PSGL-1肽”是通过酪氨酸硫酸化和SLeX修饰的肽，包括图1A所示的肽结构(表示为SGP-3)，包括其保守置换。“PSGL-1结合蛋白或肽”是可与PSGL-1结合并具有PSGL-1结合部位的蛋白质或肽，包括但不限于P-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白LE和E-选择蛋白LE。“含有PSGL-1结合部位的分子或分子复合物”包括(i)P-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白LE、E-选择蛋白LE，(ii)P-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白LE或E-选择蛋白LE与PSGL-1的复合物，(iii)P-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白LE或E-选择蛋白LE与其它分子的复合物，(iv)含有PSGL-1结合部位的其它分子或分子复合物。
除非另外指出，“蛋白质”或“分子”包括蛋白质、蛋白质域、多肽或肽。
“结构坐标”是对应于分子或分子复合物中一个原子与其它原子的空间关系的笛卡尔坐标。结构坐标可以利用X-射线结晶学技术或NMR技术获得，或者可以利用分子置换分析或同源性模建获得。有多种软件程序可以用图形表现一组结构坐标，获得分子或分子复合物的三维图像。本发明的结构坐标可以通过数学操作，如倒置或整数加减，根据图2、图3、图4或图5所示的原始坐标进行修改。因此，可以认为本发明的结构坐标是相对的，决不只限于图2、图3、图4或图5的实际x，y，z坐标。
“试剂”包括蛋白质、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或药物。
“均方根差”是平均值方差的算术平均值的平方根，是表示此处所述结构坐标的偏差或变异的术语。本发明包括含有所述氨基酸残基的保守置换，在规定的均方根差内产生相同结构坐标的所有实施方案。
熟练技术人员应当明白，P-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白LE、E-选择蛋白LE、PSGL-1和PSGL-1肽的氨基酸残基的编号方式可能不同于此处所述，并且可能含有产生与图2、图3、图4或图5所示相同的三维结构的某些保守氨基酸置换。通过观察相关氨基酸序列或利用商品同源性软件程序(例如，MODELLAR，MSI，San Diego，CA)能容易地确定其它同种型或类似物中相应的氨基酸和保守置换。
“保守置换”是通过具有类似的极性、立体排列或属于与置换残基相同的类别(例如疏水、酸性或碱性)等方式，在功能上与置换的氨基酸残基相当的氨基酸置换，包括对于利用该结构鉴定和设计可与P-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白LE、E-选择蛋白LE、SLeX、PSGL-1、PSGL-1肽、P-选择蛋白LE∶SLeX复合物、E-选择蛋白LE∶SLeX复合物、P-选择蛋白LE∶PSGL-1肽复合物以及含有SLeX或PSGL-1结合部位的其它蛋白质、肽、分子或分子复合物相互作用的试剂、用于分子置换分析和/或同源性模建，对P-选择蛋白LE、E-选择蛋白LE、SLeX、PSGL-1肽、P-选择蛋白LE∶SLeX复合物、E-选择蛋白LE∶SLeX复合物和P-选择蛋白LE∶PSGL-1肽复合物的三维结构没有重要影响的置换。
“活性部位”是指分子或分子复合物中的区域，由于其形状和电荷电位，易于通过不同共价和/或非共价结合力与另一种试剂(包括但不限于蛋白质、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或药物)相互作用或结合。因此，本发明的活性部位可能包括，例如SLeX或PSGL-1与P-选择蛋白LE或E-选择蛋白LE的实际结合部位，以及与SLeX或PSGL-1的实际结合部位相邻或接近的辅助结合部位，它在与一种特定试剂相互作用或结合后，通过直接干扰SLeX或PSGL-1的实际结合部位或间接影响P-选择蛋白LE或E-选择蛋白LE的立体构象或电荷电位，可影响P-选择蛋白LE或E-选择蛋白LE的活性，从而阻止或减少SLeX或PSGL-1在SLeX或PSGL-1实际结合部位处与P-选择蛋白LE或E-选择蛋白LE的结合。在此使用时，“活性部位”也包括P-选择蛋白LE和E-选择蛋白LE的类似物残基，它们在结合配体(如SLeX或PSGL-1)存在下显示可见的NMR微扰(perturbation)。尽管这些显示可见NMR微扰的残基可能不必直接接触或立即接近配体结合残基，但它们可能是对于合理药物设计方案至关重要的P-选择蛋白LE和E-选择蛋白LE残基。
本发明第一次提供了结晶的P-选择蛋白LE。在一个具体实施方案中，P-选择蛋白LE含有图6A所示的氨基酸残基(下划线标出)，包括保守置换。本发明的晶体有效衍射X-射线，可用于确定P-选择蛋白LE的结构坐标，其特征在于是空间群为P21的片状，晶胞参数为a＝81.0，b＝60.8，c＝91.4，β＝103.6°。此外，结晶P-选择蛋白LE的结晶不对称晶体单元含有4个P-选择蛋白LE分子。
本发明也提供含有P-选择蛋白LE和SLeX的结晶复合物。在一个具体实施方案中，P-选择蛋白LE的氨基酸残基如图6所示(下划线标出)，包括保守置换。本发明的结晶复合物有效衍射X-射线，可用于确定P-选择蛋白LE与SLeX的复合物的结构坐标，其特征在于是空间群为P21的片状，晶胞参数为a＝81.1，b＝60.5，c＝91.4，β＝103.3°。此外，本发明的结晶复合物在不对称晶体单元中含有1个P-选择蛋白LE∶SLeX复合物分子。
本发明还提供含有E-选择蛋白LE和SLeX的结晶复合物。在一个具体实施方案中，P-选择蛋白LE的氨基酸残基如图6B所示(下划线标出)，包括保守置换。本发明的结晶复合物有效衍射X-射线，可用于确定E-选择蛋白LE与SLeX的复合物的结构坐标，其特征在于是空间群为P212121的杆状，晶胞参数为a＝34.5，b＝72.4，c＝77.6。此外，本发明的结晶复合物在不对称晶体单元中含有1个E-选择蛋白LE∶SLeX复合物分子。
本发明还提供含有P-选择蛋白LE与PSGL-1肽的结晶复合物。本发明的结晶复合物有效衍射X-射线，可用于确定P-选择蛋白LE与PSGL-1肽的复合物的结构坐标，其特征在于是空间群为I222的双棱锥形，晶胞参数为a＝63.4，b＝96.8，c＝187.3。此外，本发明的结晶复合物在不对称晶体单元中含有1个P-选择蛋白LE∶PSGL-1肽复合物分子。
在本发明的晶体或晶体复合物形成后，为了获得结晶分子或分子复合物的原子坐标，能用多种方法采集X-射线衍射数据。借助于特别设计的计算机软件，能利用这些结晶数据产生分子或分子复合物的三维结构。用来产生和精化结晶分子或分子结构的三维结构的不同方法为本领域技术人员周知，包括但不限于多波长反常色散(MAD)、多同晶置换、倒晶格空间溶剂补偿(flattening)、分子置换和单同晶置换与反常色散(SIRAS)。
因此，本发明也提供由P-选择蛋白LE晶体的X-射线衍射数据得出的P-选择蛋白LE的三维结构。具体而言，P-选择蛋白LE的三维结构由图2所示的结构坐标定义，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。P-选择蛋白LE三维结构的结构坐标可用于大量用途，包括但不限于P-选择蛋白LE的不同活性部位(包括SLeX结合部位)的显示、鉴定和表征。这些活性部位结构然后可用于设计可与P-选择蛋白LE相互作用的试剂，以及与SLeX、PSGL-1或有关分子复合的P-选择蛋白LE。
另外，本发明也提供由P-选择蛋白LE∶SLeX晶体的X-射线衍射数据得出的P-选择蛋白LE和SLeX的三维结构。具体而言，P-选择蛋白LE和SLeX的三维结构由图3所示的结构坐标定义，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。P-选择蛋白LE和SLeX的结构坐标可用于大量用途，包括但不限于P-选择蛋白LE、SLeX和P-选择蛋白LE∶SLeX复合物的不同活性部位(包括SLeX结合部位)的显示、鉴定和表征。这些活性部位结构然后可用于设计可与P-选择蛋白LE、SLeX相互作用的试剂，以及与SLeX、PSGL-1或有关分子复合的P-选择蛋白LE。
本发明还提供由E-选择蛋白LE∶SLeX晶体的X-射线衍射数据得出的E-选择蛋白LE和SLeX的三维结构。具体而言，E-选择蛋白LE和SLeX的三维结构由图4所示的结构坐标定义，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。E-选择蛋白LE和SLeX的结构坐标可用于大量用途，包括但不限于E-选择蛋白LE、SLeX和E-选择蛋白LE∶SLeX复合物的不同活性部位(包括SLeX结合部位)的显示、鉴定和表征。这些活性部位结构然后可用于设计可与E-选择蛋白LE、SLeX相互作用的试剂，以及与SLeX、PSGL-1或有关分子复合的E-选择蛋白LE。
另外，本发明提供由P-选择蛋白LE∶PSGL-1肽晶体的X-射线衍射数据得出的P-选择蛋白LE和PSGL-1肽的三维结构。具体而言，P-选择蛋白LE和PSGL-1肽的三维结构由图5所示的结构坐标定义，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。P-选择蛋白LE和PSGL-1肽的结构坐标可用于大量用途，包括但不限于P-选择蛋白LE、PSGL-1和P-选择蛋白LE∶PSGL-1肽复合物的不同活性部位(包括PSGL-1和SLeX结合部位)的显示、鉴定和表征。这些活性部位结构然后可用于设计可与P-选择蛋白LE、PSGL-1相互作用的试剂，以及与SLeX、PSGL-1或有关分子复合的P-选择蛋白LE。
本发明也涉及SLeX结合蛋白或肽的活性部位，优选地P-选择蛋白LE的SLeX结合部位，它包括根据图3的氨基酸残基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。此外，除了上述结构坐标外，该活性部位还包括根据图3的氨基酸残基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。SLeX活性部位可对应于P-选择蛋白LE在与一种试剂(优选地SLeX)结合状态或未结合状态的构型。
本发明还涉及SLeX结合蛋白或肽的活性部位，优选地E-选择蛋白LE的SLeX结合部位，它包括根据图4的氨基酸残基TYR48、GLU80、ASN82、ASN83、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。此外，除了上述结构坐标外，该活性部位还包括根据图4的氨基酸残基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。SLeX活性部位可对应于E-选择蛋白LE在与一种试剂(优选地SLeX)结合状态或未结合状态的构型。
另外，本发明提供了PSGL-1结合蛋白或肽的活性部位，优选地P-选择蛋白LE的PSGL-1结合部位，它包括根据图5的氨基酸残基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和结合锶的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。此外，除了上述结构坐标外，该活性部位还包括根据图5的氨基酸残基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。PSGL-1活性部位可对应于P-选择蛋白LE在与一种试剂(优选地PSGL-1或PSGL-1肽)结合状态或未结合状态的构型。本发明的范围内也包括，为了利用结构坐标进行药物设计，锶可以替换为钙。
本发明的另一方面涉及一种鉴定可与P-选择蛋白LE的结合或活性部位相互作用的试剂的方法。具体而言，该方法包括下列步骤(a)利用根据图2、图3或图5的相对结构坐标，±不超过1.5、优选地不超过1.0、最优选地不超过0.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生P-选择蛋白LE的三维模型；(b)用该三维结构设计或选择一种试剂。可以利用评估推断的活性部位与鉴定的试剂之间的“拟合”的多种计算机软件程序，通过计算机拟合分析，鉴定该试剂，方法包括(a)利用同源性模建或活性部位的原子结构坐标，产生分子或分子复合物的推断的活性部位的三维模型，(b)确定推断的活性部位与鉴定的试剂之间的结合程度。推断的活性部位的三维模型可以用本领域周知的大量方法中的任一种产生，包括但不限于同源性模建以及利用结晶或波谱数据产生的原始数据的计算机分析。用来产生这些三维模型和/或进行必要的拟合分析的计算机程序包括但不限于GRID(牛津大学，牛津，英国)；MCSS(Molecular Simulations，San Diego，CA)；AUTODOCK(Scripps Research Institute，La Jolla，CA)；DOCK(加利福尼亚州立大学，San Francisco，CA)；Flo99(Thistlesoft，MorrisTownship，NJ)；Ludi(Molecular Simulations，San Diego，CA)；QUANTA(Molecular Simulations，San Diego，CA)；Insight(Molecular Simulations，San Diego，CA)；SYBYL(TRIPOS，Inc.，St.Louis.MO)；和LEAPFROG(TRIPOS，Inc.，St.Louis.MO)。
可以进一步评价通过计算机拟合分析鉴定的这种试剂对p-选择蛋白LE活性的影响，方法包括使鉴定的试剂与P-选择蛋白LE接触，并测定该试剂对P-选择蛋白LE活性的影响。根据该试剂对P-选择蛋白LE的活性部位的作用，它可以作为P-选择蛋白LE活性的抑制剂或激活剂。例如，可以进行酶测定并分析结果，来确定该试剂是P-选择蛋白LE和SLeX的抑制剂(即可降低或阻止P-选择蛋白LE与SLeX间结合亲和力的试剂)还是P-选择蛋白LE和SLeX的激活剂(即可提高P-选择蛋白与SLeX之间结合亲和力的试剂)。为了评价鉴定的试剂对选择蛋白相关疾病(如炎症)的可能的治疗效果，还可以进行其它试验。
本发明不限于鉴定可与P-选择蛋白LE活性部位相互作用的试剂，而且也涉及一种方法，用于鉴定含有SLeX结合部位或PSGL-1结合部位的任何分子或分子复合物的激活剂或抑制剂，包括但不限于P-选择蛋白、E-选择蛋白、E-选择蛋白LE、P-选择蛋白LE∶SLeX复合物和E-选择蛋白LE∶SLeX复合物。
在一个实施方案中，本发明提供一种鉴定含有SLeX结合部位的分子或分子复合物的激活剂或抑制剂的方法，包括下列步骤(a)利用(i)根据图3的残基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±不超过1.5、优选地不超过1.0、最优选地不超过0.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，或(ii)根据图4的氨基酸残基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±不超过1.5、优选地不超过1.0、最优选地不超过0.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生含有SLeX结合部位的分子或分子复合物的三维模型；(b)用步骤(a)产生的三维模型进行计算机拟合分析，选择或设计候选激活剂或抑制剂。在另一个实施方案中，根据图3的相对结构坐标还包括氨基酸残基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。在另一个实施方案中，根据图4的相对结构坐标还包括氨基酸残基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。在获得或合成候选激活剂或抑制剂后，候选激活剂或抑制剂可与分子或分子复合物接触，并且可以确定候选激活剂或抑制剂对该分子或分子复合物的影响。优选地，为了确定候选激活剂或抑制剂对分子或分子复合物结合SLeX的影响，在SLeX(或含有SLeX的分子或分子复合物)的存在下，使候选激活剂或抑制剂与分子或分子复合物接触。
在另一个实施方案中，本发明还提供一种鉴定含有PSGL-1结合部位的分子或分子复合物的激活剂或抑制剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图5的氨基酸残基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和结合锶的相对结构坐标，±不超过1.5、优选地不超过1.0、最优选地不超过0.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生含有PSGL-1结合部位的分子或分子复合物的三维模型；(b)用步骤(a)产生的三维模型进行计算机拟合分析，选择或设计候选激活剂或抑制剂。在另一个实施方案中，根据图5的相对结构坐标还包括氨基酸残基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5，优选地不超过1.0，最优选地不超过0.5。在获得或合成候选激活剂或抑制剂后，候选激活剂或抑制剂可与分子或分子复合物接触，并且可以确定候选激活剂或抑制剂对该分子或分子复合物的影响。优选地，为了确定候选激活剂或抑制剂对分子或分子复合物结合PSGL-1或PSGL-1肽的影响，在PSGL-1或PSGL-1肽的存在下，使候选激活剂或抑制剂与分子或分子复合物接触。另外，本发明的范围内也包括，为了利用结构坐标进行药物设计，锶可以替换为钙。
另外，图3或图4所示的SLeX的结构坐标，图5所示的PSGL-1肽的结构坐标，能用于鉴定或设计分别可与SLeX和PSGL-1相互作用的试剂。就此而言，本发明提供一种鉴定可与SLeX相互作用的试剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图3或图4的相对结构坐标，±不超过1.5、优选地不超过1.0、最优选地不超过0.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生SLeX的三维模型；(b)用该三维结构设计或选择可与SLeX相互作用的试剂。然后能合成或获得鉴定的试剂，然后与SLeX(或含有SLeX的分子或分子复合物)接触，以确定该试剂对SLeX活性的影响。
另外，本发明还提供一种鉴定可与PSGL-1相互作用的试剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图5的相对结构坐标，±不超过1.5、优选地不超过1.0、最优选地不超过0.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生PSGL-1肽的三维模型；(b)用该三维结构设计或选择可与PSGL-1相互作用的试剂。然后能合成或获得鉴定的试剂，然后与PSGL-1或PSGL-1肽(或含有PSGL-1或PSGL-1肽的分子或分子复合物)接触，以确定该试剂对PSGL-1或PSGL-1肽活性的影响。
在美国专利号5,834,228、5,939,528和5,865,116以及PCT申请号PCT/US98/16879、公开的WO 99/09148中进一步公开了多种分子分析和合理药物设计技术，其内容在此引用作为参考。
本发明也涉及利用上述方法鉴定的试剂、激活剂或抑制剂。这些试剂、激活剂或抑制剂可以是蛋白质、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或药物。抑制或以其它方式干扰选择蛋白介导的白细胞在血管组织上滚动的小分子或其它试剂可用于治疗与异常炎症反应有关的疾病，如哮喘和牛皮癣。
另外，本发明也涉及一种确定结构未知的分子或分子复合物的三维结构的方法，包括下列步骤获得结构未知的分子或分子复合物的晶体，由结晶的分子或分子复合物获得X-射线衍射数据。然后将该分子或分子复合物的X-射线衍射数据与本发明的上述任一种晶体的已知三维结构相比较。然后，利用分子置换分析，使由本发明的晶体测得的已知三维结构“符合”结晶分子或分子复合物的X-射线衍射数据。此外，也可用波谱数据或同源性模建产生该分子或分子复合物的推断的三维结构，并根据由本发明的任一种晶体获得的已知三维结构的构象，精化推断的结构。
最后，本发明提供一种方法，用于获得E-选择蛋白型分子与可配位钙的化合物(如SLeX)的结晶复合物。该方法包括下列步骤(a)在钙离子和PEG存在下，使结晶的E-选择蛋白型分子与可配位钙的化合物接触，形成E-选择蛋白型分子与可配位钙的化合物的结晶复合物；(b)在浓度降低的钙离子和足够浓度的PEG和离子盐存在下，接触结晶复合物，获得最终的结晶复合物，它们在冷却后，适于根据最终结晶复合物的X-射线衍射阐明E-选择蛋白型分子和可配位钙的化合物的三维结构。
在该方法中，“E-选择蛋白型分子”可以是完整的E-选择蛋白分子及其部分，如凝集素和/或表皮生长因子(EGF)样域，优选地是E-选择蛋白LE。可与钙配位的化合物优选地是SLeX。在步骤(a)中，结晶的E-选择蛋白型分子可通过本领域周知的方法制备。当结晶的E-选择蛋白型分子是E-选择蛋白LE时，结晶的E-选择蛋白LE优选地如以下实施例1所述制备。该方法中钙离子的来源优选地是，而PEG优选地是PEG-1000到PEG-2000，最优选地是PEG-4000。离子盐可以是本领域周知的多种离子盐，优选地是。
该方法的一个重要方面是减少步骤(b)中的钙离子，或者使用有效的钙浓度，这可阻止或降低钙在抑制可配位钙的化合物结合E-选择蛋白型分子中的作用，从而可形成最终晶体复合物，它适于根据最终结晶复合物的X-射线衍射阐明E-选择蛋白型分子和可配位钙的化合物的三维结构。也就是说，钙的浓度应当足够低，使得配位钙的化合物与E-选择蛋白型分子上的结合部位结合。例如，如果配位钙的化合物是SLeX，则设想步骤(a)中的钙离子浓度可以是20mM-300mM，而步骤(b)中的钙离子浓度较低(即100μM-20mM)。在步骤(a)和(b)中，鉴于钙浓度降低或较低，PEG的浓度应当足以保持晶体的完整性，优选地约15％-60％(w/v)PEG。步骤(b)中离子盐的浓度约为10mM-500mM。当配位晶体的化合物是SLeX时，步骤(a)中的接触可以进行约10-20小时，优选地约15小时。步骤(b)中的接触进行约0.5-3小时，优选地约1小时。
步骤(a)和(b)组合也在本发明的范围内，在这种情况下，在足够浓度的钙离子、PEG和离子盐存在下，结晶E-选择蛋白型分子与配位钙的化合物接触，形成(E-选择蛋白型分子与可配位钙的化合物的)结晶复合物，它适于根据最终结晶复合物的X-射线衍射阐明E-选择蛋白型分子与配位钙的化合物的三维结构。如果步骤(a)和(b)组合，则设想钙离子、PEG和离子盐的浓度分别为约100μM-20mM、15％-60％(w/v)和10mM-500mM。
参照下列非限制性实施例，本发明更易于理解。下列实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方案，决不应视为限制本发明的范围。实施例11.实验方法构建体和蛋白质/肽制品的产生。通过间插肠激酶切割序列(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)与IgG1的CH2-CH3区融合的P-选择蛋白(P-LE)和E-选择蛋白(E-LE)的凝集素-EGF(LE)域(153个氨基酸)在CHO细胞中表达，并通过蛋白A sepharose(Pharmacia)层析法从条件培养基中回收。用肠激酶消化二聚体Fc构建体产生单体选择蛋白LE域(LaVallie等人，1993)，在串联的大豆胰蛋白酶抑制剂-琼脂糖(Sigma)和蛋白A(Perseptive Biosystems)柱上通过层析法除去酶和残余的Fc域。选择蛋白LE域在37℃下以25毫单位N-聚糖酶/mg蛋白质的比例去糖基化48小时，通过阴离子交换和疏水作用层析纯化。通过真空浓缩使LE域达到10-30mg/ml。P-LE和E-LE经质谱法(MS)确定是正确的，通过凝胶过滤HPLC确定为单体，通过表面胞质团共振(BIAcore)确定具有功能(见下文)。
以前(Goetz等人，1997)描述了一种可溶性构建体(19ek.Fc)，其含有PSGL-1的N端19个氨基酸，它们通过含一个有肠激酶切割序列的9氨基酸接头与IgG1的Fc区融合。纯化并用肠激酶消化19ek.Fc，如上对于LE构建体所述回收单体PSGL-1 19ek肽。通过SuperQ阴离子交换层析使用0-500mM 的梯度将异源19ek肽纯化为单个成分。通过蛋白水解和糖苷消化之前和之后的MS、通过NMR、通过组成分析确定其结构(J.Rouse，D.Tsao和R.Camphausen，发表的数据)。
P-LE/19ek肽结合研究。在25℃下在BIAcore 2000和3000仪器上进行表面胞质团共振，使用链霉亲和素包被的传感芯片(BIAcore)和调节为1mM 和的HBS-P缓冲液(BIAcore；10mMHEPES(pH7.4)，150mM 和0.005％聚山梨酸酯20(v/v))。19ek肽和sPSGL--PSGL-1的完整二聚胞外域的岩藻糖基转移酶-VII修饰形式(Croce等人，1998)，用磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)在Lys残基处生物素化。生物素化后，为了分离功能物质，sPSGL与固定P-选择蛋白反应(Sako等人，1995)。一种对应于SGP-3多肽部分的合成肽(AnaSpec，Inc.)也类似地生物素化。用HBS-P缓冲液将生物素化的试剂包被于传感芯片上。糖基化的P-LE和E-LE根据实验确定的消光系数(280nm)定量，以40μL/分钟注射到19ek肽、sPSGL和对照表面上。在P-选择蛋白和E-选择蛋白中和性单克隆抗体、10mMEDTA和可溶性19ek肽存在下进行对照实验，证实结合特异性(R.Camphausen，未发表的数据)。去糖基化的P-LE和E-LE与完整的糖基化形式相似地结合。
结晶与数据采集。除非另外指明，所有衍射数据均用在5.0KW下运行的Rigaku RU200发生器室内采集，其配备Yale/MolecularStructure Corp.聚焦镜和RAXIS II或RAXIS IV图像板面积检波器。
P-LE的片状晶体由含有10mg/ml蛋白质、100mM (pH8.5)、150mM 、12mM 、10％(v/v)2，4-甲基戊烷二醇(MPD)和10％(w/v)PEG 6000的溶液在18℃下通过蒸汽扩散形成。这些晶体转移到100mM (pH8.5)、75mM 、10mM、10％(v/v)MPD和11％(w/v)PEG 6000中，然后转移到用MPD稀释5％(v/v)的相同缓冲液中2小时。用MPD第二次5％稀释后，晶体浸泡13小时，之后在保持于液氮温度下的液体丙烷中骤冻。利用相同方法，但是向终浸泡溶液中加入8mM SLeX，获得与SLeX(SLeX-β-O-甲基，Toronto Research Chemicals)复合的P-LE。P-LE晶体的空间群为P21，晶胞参数为晶胞参数为a＝81.0，b＝60.8，c＝91.4，β＝103.6°。在SLeX中浸泡的晶体的最大分辨率降为3.4，镶嵌性(mosaicity)提高到1.5°，得到的晶胞参数为a＝81.1，b＝60.5，c＝91.4，β＝103.3°。处理衍射数据并用DENZO/SCALEPACK(HRLResearch，Inc.)换算，得到表1所示的统计数字。
由含有30mg/ml蛋白质、100mM HEPES(pH7.5)、10mM、200mM 和15％(w/v)PEG 6000的溶液在18℃下通过蒸汽扩散获得E-LE的棒形大晶体。晶体生长几周，利用大引晶法(macroseeding)使其更可再生。对于与SLeX的复合物，将E-LE晶体转移到含有100mM HEPES(pH7.5)、200mM 、30％(w/v)PEG 4000和15mM SLeX的溶液中，25℃15小时。最初温育后，将晶体转移到100mM (pH7.4)、300mM 、2mM 、30％(w/v)PEG 4000和15mM SLeX中，再过1小时，之后如上所述骤冻。E-LE/SLeX晶体属于空间群P212121，晶胞参数为a＝34.5，b＝72.4，c＝77.6。衍射数据如上所述处理。
通过向蒸汽扩散结晶液滴中重复大引晶获得P-LE/PSGL-1 19ek肽(SGP-3)复合物的大晶体，测量可达0.5×0.5×0.3mm。由8mg/mlP-LE、2倍摩尔过量的SGP-3、10mM 、100mM HEPES(pH7.0)、150mM 、4mM 、50mM 、5％(w/v)PEG6000和33％(v/v)MPD生长晶体。由含有50％MPD但不含或PEG 6000的相似缓冲液中获得较早的小种晶。将晶体转移到100mM HEPES(pH7.0)、10％PEG 6000、30％MPD、100mM 和50mM 中15小时，之后骤冻。通过向最终浸泡缓冲液中加入0.5mM乙酸汞24小时，之后骤冻，获得汞衍生的晶体。复合物晶体的空间群为I222，晶胞参数为a＝63.4，b＝96.8，c＝187.3。晶体为双棱锥形。原始衍射数据用Brookhaven National Labs station X4A采集，用RAXIS IV记录衍射数据。汞衍生数据在室内采集。所有数据都如上所述减少，得到表1中的统计数字。
结构确定和精化。发现与SLeX复合的E-LE的晶体基本上与以前报道的(Graves等人，1994)同晶形，在结晶不对称单元中有一个拷贝的E-LE。利用CNS内的刚体精化(Brunger等人，1998)获得最初相位，得到结合SLeX的清楚的电子密度。利用BUSTER(Bricogne，1993)进一步改进这些图，利用QUANTA(Molecular Simulations，Inc.)使结合SLeX的模型拟合。所有进一步的精化都在CNS中进行，得到一个最终模型，其中86％的残基在Ramachandran图的最有利的区域中，总共含有1510个原子、186个水分子、一个钙离子和一个拷贝的SLeX。统计数字示于表1。
应用公开的E-选择蛋白lec/EGF构建体模型(PDB保藏编号1ESL)以分子置换解析P-LE的结构。用程序AMORE(CCP4，1994)定位所有4个拷贝的P-LE。用上述方法建立并精化该模型。1个拷贝的P-LE具有比其它3个更低的电子密度，但利用非结晶对称，精化极好地进行，得到表1中的统计数字。在精化结束时，第4个拷贝的P-LE的平均B因子为63.7，与之相比，其它3个拷贝为44.2。最终模型含有4个拷贝的P-LE，81％的残基在Ramachandran图的最有利的区域中，总共含有5418个原子、134个水分子、2个MPD分子和4个钙离子。
浸泡于SLeX中的P-LE晶体基本上与上述P-LE结构同晶形。在CNS中刚体精化后，3个结合的SLeX分子有清楚的密度。由于晶体接触，第4个结合部位部分封闭，从而解释了在SLeX中浸泡后分辨率的降低。在CNS中有限精化之前，用QUANTA模建结合的SLeX，并重新拟合蛋白质残基。这产生最终模型，71％的残基位于最有利的Ramachandran区中，总共含有5455个原子、3个SLeX分子、4个钙离子和2个MPD分子。
通过分子置换解析与PSGL-1 19ek肽SGP-3复合的P-LE结构的所有尝试均告失败。利用Patterson技术定位重原子位点，并用SHARP精化(de la Fourtelle和Bricogne，1997)。这些相位产生较少但质量足够的图，允许P-LE结构的2个凝集素域的定位和2个EGF域的独立定位。这些图也表明在与P-LE/SLeX复合物相同的位置处存在结合SLeX分子，和无法解释的额外密度。重原子相位与BUSTER中的模型相位结合，产生清楚的最大熵图，它允许以QUANTA拟合SGP-3多肽和SLeX部分。该结构如上所述精化，得到表1中的统计数字，和Ramachandran图的最有利的区域中84％的残基。最终模型含有2个P-LE/SGP-3复合物、3263个原子、2个锶离子、224个水分子、2个钠离子和7个结合MPD分子。
2.结果与讨论P-选择蛋白凝集素/EGF域的X-射线晶体结构。我们得到了含有N端凝集素和EGF域的P-选择蛋白构建体(称为P-LE)。尽管E-选择蛋白lec/EGF晶体结构(Graves等人，1994)表明，凝集素与EGF域之间有最小的相互作用，推断的SLeX结合部位极好地从凝集素-EGF域连接中去除，但我们选择保留EGF域，因为研究表明它可能具有功能作用(Gibson等人，1995；Kansas等人，1994)。P-LE通过间插肠激酶切割序列与IgG1的Fc区融合。该构建体被称为P-LE.Fc，易于从条件培养基中纯化，并在肠激酶消化后产生单体P-LE域。CHO细胞中表达的P-LE含有3个N-连接的聚糖，它们在结晶之前酶促除去。获得空间群为P21的P-LE晶体，在结晶不对称单元中含有4个分子，衍射为2.4的分辨率。用E-选择蛋白lec/EGF晶体结构坐标作为搜索模型，通过分子置换解析该结构。
P-LE晶体结构采取基本上与E-选择蛋白lec/EGF结构相同的总体构象。这符合选择蛋白之间这些域62％的序列同一性，使得C主链的RMS差异只有0.7。P-LE的凝集素和EGF域通过小界面相互作用，使得与E-选择蛋白构建体的相似性更加显著，因为这种关系也得到保持。EGF域中几个环的运动与域间角的较小活动一起，导致两种结构之间的许多次要差异。在晶体中不同P-LE拷贝之间，域间角也略微不同，因此可能是晶体包装力的作用。
诱变和结构研究(Kansas，1996)提示，推断的SLeX结合部位在P-LE与E-选择蛋白lec/EGF结构之间显著保守。该部位的共同特征，和选择蛋白功能金属依赖性的推测的基础，是Glu-80、Asn-82、Asn-105和Asp-106的侧链和Asp-106的主链羰基配位(coordinate)的一个钙离子。两个水分子也连接P-LE内的钙，其中一个被Asn-83的侧链稳定。因为在E-选择蛋白lec/EGF结构(未显示)中也存在P-LE该区域中的8个结合水(0.8)，SLeX结合部位的相似性更加显著。然而在主要由E-选择蛋白中的Arg-97改变为P-选择蛋白中的Ser-97所定义的一个区域中，结合部位不同。在E-选择蛋白lec/EGF结构中，Arg-97在Tyr-94上堆积，从而显示该区域中的带正电的表面，而在P-LE中，Tyr-94不被较小的Ser-97残基阻碍，因此能介导疏水作用。E-选择蛋白lec/EGF构建体中的Arg-97与Asp-100形成氢键，它在P-LE中是丙氨酸残基。与该区相邻的是Lys-99，在E-选择蛋白lec/EGF中，它从结合部位朝向外面。P-LE中的相当残基是朝向结合部位的丝氨酸残基。
与SLeX复合的P-和E-选择蛋白lec/EGF域的晶体结构。我们设法获得与SLeX复合的P-LE的晶体结构，我们预期能通过将SLeX浸泡于预先形成的P-LE晶体中获得。我们也希望了解E-选择蛋白的SLeX结合亲和力比P-选择蛋白约高10倍的结构基础(Poppe等人，1997)，如果推断的SLeX结合部位之间有相似性，这是意外的。因此，我们产生了一种E-选择蛋白凝集素/EGF构建体(E-LE)，如P-LE一样表达、纯化并去糖基化。E-LE在类似于以前对E-选择蛋白凝集素/EGF(Graves等人，1994)使用的条件下结晶，结晶不对称单元中含有一个拷贝的E-LE。
P-LE晶体浸泡于含有8mM SLeX的稳定溶液中，采集结晶数据，扩展到3.4(表1)。P-LE/SLeX晶体结构在不对称单元中含有4个拷贝的P-LE，一个SLeX结合部位被晶体接触部分阻碍。这种晶体接触可能使浸泡后衍射质量显著降低。尽管这些数据分辨率较低，但在3个拷贝的P-LE中，从结合钙延伸开来能看到清楚的电子密度。这些图用来构建与P-LE结合的SLeX复合物结构，尽管在获得高分辨率的SLeX与E-LE的复合物后精化这些结果。最初以可达20mM的SLeX浓度将SLeX浸泡到E-LE晶体中的尝试未获成功。我们后来确定，在SLeX结合试验中，用于结晶的高浓度钙抑制E-选择蛋白(数据未显示)。因此，形成一种浸泡方案，其中钙浓度降低到可促进SLeX结合而仍保持高分辨率衍射的水平。这些条件形成衍射数据为1.5分辨率的晶体，和结合SLeX的清楚的电子密度(表1)。P-LE/SLeX复合物的结构揭示，相互作用实际上几乎完全是静电作用，与SLeX的大小相比，埋藏的总表面积较小(5492)。由于与P-LE的复合物分辨率较低，以下将更详细地描述E-LE/SLeX复合物的保守相互作用。Fuc羟基的相互作用肯定提供大量的结合能量。3-和4-羟基不仅配位结合钙，而且与本身可配位钙的残基形成氢键。另外，Glu-107仅距Fuc 2-羟基3.4，可形成弱氢键。SLeX Gal残基利用4-羟基(与Tyr-94的羟基)和6-羟基(与Glu-92的羧基)与蛋白质残基氢键键合。在两种选择蛋白非常不同的区域内(Arg-99(E-选择蛋白)与Ser-99(P-选择蛋白))，NeuNAc残基相互作用。在P-LE中，Tyr-48和Ser-99的羟基分别与NeuNAc的羧酸部分和4-羟基形成氢键。最后，似乎是NeuNAc环的C-4对Pro-98压紧。NeuNAc的定位使得与E-LE中的Arg-99不利地接触，因此进一步向回移动(图2A)允许更好的相互作用。在E-LE与P-LE之间，其余的SLeX基本上都重叠。
与SLeX复合的E-LE的结构证实了在低分辨率P-LE结构中看到的相互作用，由于Ser-97∶Arg-97(P-选择蛋白∶E-选择蛋白)不同，与NeuNAc的接触也不同。Fuc 3-和4-羟基配位结合钙，与也可配位钙的残基形成复杂的氢键网络。Fuc 4-羟基恰好替换无配体结构中可见的钙-连接的水分子，接受来自Asn-82的氢键，为Glu-80贡献一个氢键。Fuc 3-羟基替换另一个钙配位的水分子，尽管其最终位置与Asn-105更近1。在结合Asn83的SLeX旋转其2个扭角至59°后，它能为结合的水贡献一个氢键，随后为Fuc 2-羟基和Glu-107的侧链贡献氢键(未显示)。这种旋转也使Asn-83侧链能配位钙。P-LE中的Ser-97替换为E-LE中的Arg-97可与NeuNAc形成不同的相互作用，并使糖离开侧链，以减轻将要发生的紧密接触。Arg-97为糖苷氧和NeuNAc的羧基贡献氢键。在与P-LE类似的排列中，羧基也接受来自Tyr-48的氢键。
SLeX结合P-LE和E-LE中观察到的蛋白质接触极好地符合集中于对于P-选择蛋白和E-选择蛋白识别至关重要的残基的定点诱变研究(Erbe等人，1993；Erbe等人，1992；Graves等人，1994；Hollenbaugh等人，1993；Ng和Weis，1997)。许多这种突变(例如E-和P-选择蛋白中的Tyr-48和Tyr-94和E-选择蛋白中的Arg-97的置换)现在能解释为直接影响与SLeX的氢键作用。其它突变可能通过改变作用残基的方向间接破坏功能。后一种解释可能说明了与E-和P-选择蛋白中发现的三Lys片段(残基111-113)突变有关的功能破坏。在与SLeX复合的P-LE和E-LE结构中，Lys-113不直接参与结合。然而，该残基与Glu-92的羧酸部分氢键键合(通过侧链氨基)，后者也与SLeX内的Gal残基的6-羟基氢键键合。因此，选择蛋白该区域中的某些突变可通过间接机制破坏SLeX结合。
E-LE和P-LE/SLeX结构与有关凝集素/聚糖复合物的比较揭示了重要的相似性和差异。对与寡甘露糖结合的MBP-A晶体结构的检测(Weis等人，1992)表明，钙结合作用的相似排列也涉及连接的甘露糖残基的3-和4-羟基。然而相对于MBP-A/寡甘露糖复合物中的甘露糖，E-LE和P-LE/SLeX结构中的Fuc环“翻转”。这导致环位置互换，使得选择蛋白LE/SLeX复合物的Fuc 3-和4-羟基分别占据MBP-A/寡甘露糖复合物中甘露糖的4-和3-羟基位置。尽管使用不同的羟基，并且它们与糖环的关系不同(对于甘露糖3-和4-羟基，分别为赤道-赤道，在Fuc中为赤道-轴)，但保留沿糖环碳到羟基的载体。羟基的这种精确定位似乎是与钙离子连接并且同时与蛋白质氢键作用所必需的。已导入3个选择蛋白残基(Ng和Weis，1997)的MBP-A K3突变体的晶体结构，与选择蛋白LE/SLeX复合物明显不同地结合SLeX。这种结构和此处所示的结构显示与结合钙有Fuc连接，涉及不同的羟基。在K3突变体/SLeX复合物中，Fuc 2-和3-羟基连接钙，并分别占据选择蛋白LE/SLeX复合物中所见的Fuc 4-和3-羟基位置。这使结合袋内的SLeX方向相对于选择蛋白LE/SLeX复合物旋转90°，并在Gal 4-羟基与Lys-111侧链之间有氢键相互作用，这我们没有发现。这突出了Glu-92、Tyr-94和Tyr-48(在E-选择蛋白中为Arg-97)对于E-和P-LE/SLeX复合物中配体结合的重要性。最后，根据结合表面上SLeX的一般朝向，将分子停靠到E-选择蛋白lec/EGF晶体结构内的SLeX模型(Graves等人，1994；Kogan等人，1995；Poppe等人，1997)与我们的结果相比较。但是，对于分子接触的同一性，全都不同程度地不符合此处所示的结构。假定SLeX与结合钙的连接模拟MBP-A/寡甘露糖复合物和MBP-A K3突变体/SLeX复合物中所见的，所有模型都提示，SLeX的Fuc 2-和3-羟基与结合钙连接。这与我们在两种不同的选择蛋白LE/SLeX复合物中所见截然不同，其中Fuc连接通过3-和4-羟基介导。提出的E-选择蛋白/SLeX相互作用的其它接触与我们的结果不同程度地一致或不一致。根据这些错误结构考虑设计用于治疗的SLeX模拟物最终可能限制这些工作的成功。
用于X-射线结晶学的功能PSGL-1肽的产生。然后为了阐明识别的结构基础，我们设法获得与PSGL-1复合的P-LE的晶体结构，但预期PSGL-1的生理或胞外大形式对于共结晶而言太不均匀。诱变和生物化学研究表明，与E-选择蛋白不同，P-选择蛋白识别成熟PSGL-1N端内的多肽残基和SLeX-修饰的O-聚糖。PSGL-1决定簇的候选者包括氨基酸的阴离子片段，这些氨基酸包括(从成熟多肽N端起编号)Tyr-5、Tyr-7和Tyr-10，其中一个或多个是用间接法定位于Thr-16的硫酸化、唾液酸化、岩藻糖基化(假定SLeX样)的O-聚糖(Pouyani和Seed，1995；Ramachandran等人，1999；Sako等人，1995；Wilkins等人，1995)。3个Tyr残基中任一个的硫酸化能支持P-选择蛋白结合，但是，通过滚动研究(Ramachandran等人，1999)而不是通过严格亲和力测定推断单个硫酸酪氨酸的相对作用。为了研究这些结构问题并产生适于与P-LE结晶的PSGL-1的均匀修饰形式，我们在事先用岩藻糖基转移酶-VII和核心2 N-乙酰葡糖胺转染的CHO细胞系中表达截短形式的PSGL-1，在CHO细胞中表达产生功能PSGL-1必需的修饰酶(Kumar等人，1996；Li等人，1996)。我们使用一种可溶性PSGL-1构建体(19ek.Fc(Goetz等人，1997))，它编码与IgG1的重链域(19.Fc(Sako等人，1995))融合的PSGL-1的19个N端氨基酸，其中导入了肠激酶切割序列，它将在表达和纯化后便于单体PSGL-1肽的分离。以前曾证明包被于乳胶微球上的19ek.Fc支持在表达P-和E-选择蛋白的CHO细胞上的滚动(Goetz等人，1997)。
为了产生单体PSGL-1肽(称为19ek肽)，用肠激酶消化19ek.Fc。利用MS的初步分析提示，19ek肽在结构上不均匀(未显示)。因此，通过阴离子交换HPLC实现混合物的解析，它将19ek肽混合物分散为均匀的成分，主要是稍后以盐梯度洗脱的主要成分(图1A)。主要19ek肽的结构确定为磺基糖肽(称为SGP-3)，如图1A所示。SGP-3的PSGL-1部分在翻译后广泛修饰，包括所有3个酪氨酸残基上的硫酸化，和Thr-16处含SLeX的核心2修饰的O-聚糖(图1A，插图)。重要的是，该聚糖与从HL-60骨髓细胞系分离的PSGL-1所表征的2个含SLeX O-聚糖之一相同(Wilkins等人，1996)。19ek肽的次要成分(图1A)是修饰较少的SGP-3。19ek肽SGP-1和SGP-2的结构(图1A)确定为分别含有1个和2个硫酸酪氨酸的SGP-3形式。利用MS的初步分析表明，连二硫酸成分内存在硫酸酪氨酸的每种前突变，但没有定量。19ek肽库内也存在不含硫酸酪氨酸(糖肽-1，GP-1)或不含碳水化合物(磺基肽-1，SP-1)的SGP-3形式，并且通过层析法解析(图1A)。
为了选择最具功能性的成分进行共结晶，我们使用表面胞质团共振测定P-LE对各19ek肽的结合亲和力。为进行比较，我们评价了一种可溶性重组PSGL-1(sPSGL-1)，它包含完整的二聚胞外域。与以前的研究一致，P-LE以快速动力学结合固定的sPSGL和19ek肽(图1B)。根据使用EDTA和中和单克隆抗体的对照实验(未显示)，并用SGP-3作为可溶性抑制剂(图1B)，确定结合是特异性的。用完全修饰的SGP-3获得对于19ek肽的最高亲和力作用，KD为778nM。用sPSGL获得基本相同的亲和力(图1C)，提示19ek肽SGP-3在功能上模拟全长胞外PSGL-1构建体，较短构建体中存在的PSGL-1的N端区组成了对P-LE的完整识别区。P-LE对SGP-3的连二硫酸形式的结合亲和力略弱(图1C)，对于二硫酸形式(SGP-2)KD为2.88μM，对于单硫酸形式(SGP-1)为12.3μM。不含碳水化合物(SP-1)或磺基酪氨酸(GP-1)的SGP-3形式的P-LE结合亲和力较弱，估计分别为113μM和31.1μM(图1C)。P-LE对于不含碳水化合物或硫酸化的合成19ek肽的亲和力大大低于任何修饰的形式，在此处使用的蛋白质浓度下无法测定。此处测定的P-LE与sPSGL和SGP-3结合的亲和力与以前可溶性P-选择蛋白和类似于P-LE的P-选择蛋白的凝集素-EGF构建体与全长嗜中性粒细胞PSGL-1结合所测得的值相当(KD分别为322nM和422nM)(Mehta等人，1998)。另外，最近也报道了可溶性P-选择蛋白与类似于SGP-3修饰的PSGL-1磺基糖肽的结合亲和力，KD为～350nM(Leppanen等人，1999)。
与PSGL-1磺基糖肽-3结合的P-LE的X-射线晶体结构。P-LE与两倍摩尔过量的SGP-3共结晶。为了获得衍射1.9的大I222空间群晶体，需要重复大引晶和用锶替换钙。用室内采集的汞数据产生相位，显示在结晶不对称单元中有2个P-LE/SGP-3复合物。用CNS精化结构为R-因子＝20.4％(R-free，23.5％)(表1)。在SGP-3内的29个氨基酸中，可观察到残基6-18，包括硫酸化Tyr-7(Tys-7)和硫酸化Tyr-10(Tys-10)。结构中杂乱和缺乏的是多肽残基1-5，包括大多数N端硫酸化酪氨酸(Tys-5)和含有肠激酶-接头区的残基19-29。在Thr-16处SLeX修饰的O-聚糖除一个残基外都可见。未检测到与Gal(1，3)GalNAc分支(2，3)-连接的NeuNAc的电子密度(图1A，插图)，但该残基似乎不是结合必需的(Leppanen等人，1999)。
P-LE/SGP-3复合物的两张不同的视图提供了结合作用的结构概貌，由此可推断生理P-选择蛋白/PSGL-1相互作用的情况。SGP-3以1∶1化学计算与含有大表位的P-LE凝集素域结合，将溶剂排除在16412外，包含对于P-LE/SLeX复合物所述的SLeX结合部位。尽管实际上根据转移NOE研究(D.Tsao，未发表的发现)确定，SGP-3在溶液中无序，并且可能延伸，但结合构象通过内部折叠压缩，产生发夹样结构。尽管该结果不排除PSGL-1同型二聚体的不同臂(每一个提供结合相互作用的不同成分)可能同时啮合一个P-选择蛋白凝集素域的可能性，但是提示，PSGL-1的一个臂能提供完整的一组结合决定簇。而且，这种结合作用提供了PSGL-1同型二聚体的各个单体同时啮合两个不同P-选择蛋白分子的可能性。两种平行结合作用的共定位可能是P-选择蛋白功能的生理需要，因为发现PSGL-1的二聚化突变体在剪切影响下不能支持细胞结合(Snapp等人，1998)。由P-LE/SLeX复合物的检测也可确定，SGP-3的结合在基本与凝集素域∶EGF域界面相对的P-LE面上发生。这直接证明P-选择蛋白的EGF域不参与直接结合PSGL-1，至少是该分子的N端部分，但是在P-选择蛋白功能中可能具有间接作用(见下文)。
尽管实际上钙被替换为锶，但在P-LE与SLeX的复合物中见到的相互作用在P-LE/SLeX结构中再现，这与以前发现的该金属能有效替换钙相一致(Asa等人，1992)。该复合物中有P-LE的大结构重排，导致金属离子坐标改变。在P-LE/SLeX复合物中，Fuc的2-羟基与Glu-107形成氢键(距离3.4)。这在P-LE/SGP-3复合物中不存在，但被代替为与Glu-88之间的氢键，它本身也可配位结合锶。在P-LE结构中，Asn-83的侧链接近但不配位结合钙，在E-LE与SLeX的结合中，SLeX的结合使其与金属离子和Fuc羟基相互作用。在P-LE/SGP-3复合物中，该残基的位点被替换为Glu-88的侧链。就此而言，金属连接精确地模拟与寡甘露糖复合的MBP(Weis等人，1992)和与SLeX复合的MBP的K3突变体(Ng和Weis，1997)，其中发现相应的残基Glu-193连接钙。
SGP-3多肽与P-LE之间的相互作用是疏水和静电接触的组合。在扩展构象中，与蛋白质接触的SGP-3肽的大多数N端残基是Tys-7，随后是3个残基。残基Tys-10到Leu-13形成一个转角，这改变了肽的方向，其余的残基在扩展构象中朝向Pro-18。Tys-7的硫酸化与Ser-46和Ser-47的侧链羟基、主链酰胺氮并通过排列的水分子形成一系列氢键。另外，P-LE的His-114为其余的硫酸氧贡献一个氢键，形成氢键网络。Tys-7也与Lys-112的酰胺氮形成主链氢键，并与Ser-47和Lys-113的侧链形成疏水作用。SGP-3残基Leu-8对Leu-13压紧，它们都对His-108和Lys-111侧链形成的蛋白质的疏水表面压紧。这些相互作用有助于稳定肽的紧凑四级结构。Tys-10侧链的芳环正对两个亮氨酸残基，硫酸盐的位置能与Arg-85和Thr-16的主链酰胺氢键键合。P-LE的大结构排列(见下文)使Arg-85与SGP-3多肽的相互作用成为可能，并且证明了以前关于P-选择蛋白内该残基的定点诱变研究的发现(Bajorath等人，1994)。当突变为Ala时，P-选择蛋白突变体丧失与PSGL-1表达细胞结合的高亲和力，仍保留低亲和力(可能只是SLeX介导的)结合。类似地，其表位已经对附近残基76-83作图的抗体显示不能与PSGL-1结合，但可与SLeX结合(Hirose等人，1998)。在P-LE/SGP-3复合物中，SGP-3中的Phe-12的侧链不与蛋白质接触，但在与非结晶对称有关的另一拷贝的复合物中对其本身压紧。在溶液中似乎可能正对Leu-110侧链形成的疏水表面。只能见到与SGP-3的Pro-14有相互作用，它对His-108压紧，并接受来自Arg-85的氢键。
与无配体的P-LE和P-LE/SLeX复合物相比，与SGP-3结合的P-LE构象有几处显著改变。最明显的构象改变是残基环从Asn-83移至Asp-89，使Arg-85与SGP-3的Tys-10接触，和Glu-88移至连接结合金属的位置。这种移动随后似乎影响残基Arg-54向Glu-74的位置移动，占据Asn-83到Asp-89环空出的空间。在未复合的P-LE中，Thr-65对Trp-1的侧链压紧，排除溶剂。P-LE/SGP-3复合物中观察到的环的移动预期使Trp-1暴露于溶剂，但该残基重排，在凝集素域的Tyr-118与EGF域的Glu-135之间压紧。在Trp-1移动的同时，EGF域相对于凝集素域转动52°，Trp-1侧链移动产生的空隙被MPD分子填充，它对侧链的新位置压紧。这提出了关于EGF域的移动是由用于结晶的高浓度MPD引起的还是由于SGP-3结合引起的这一问题。EGF域在与PSGL-1(至少是分子N端区)的结合中似乎不起直接作用，根据观察到EGF域可调节配体识别，它与凝集素域的关系的改变是一个令人感兴趣的发现(Gibson等人，1995；Kansas等人，1994)。
此外，这些研究也表明，EGF和CR域与此处所述结合部位C端的PSGL-1其它区之间有第二次结合作用。其它结构研究进一步研究了凝集素与EGF域之间可能的相互作用。SGP-3多肽的内部折叠使Tys-10靠近Thr-10处的O-聚糖，提示PSGL-1线性序列内SLeX修饰的聚糖与硫酸酪氨酸的关系可能不是绝对位于最少数量的间插残基之上。P-选择蛋白可能支持PSGL-1 N端的多种结合构象，该研究只显示其中之一。P-LE/SGP-3结构提示PSGL-1的Tys-7和Tys-10(而不是Tys-5)是结合必需的，该结果与诱变研究一致，该诱变研究表明这些特异硫酸酪氨酸残基在P-选择蛋白介导的滚动中的优先作用。然而，PSGL-1 N端的柔性可能使硫酸酪氨酸有不同的前突变，例如Tys-5和Tys-7或Tys-5和Tys-10，以不同的方式结合P-选择蛋白内的碱性残基。这一假说可以解释P-LE对三硫酸SGP-3的亲和力为何高于二硫酸SGP-2。P-选择蛋白内可能存在第三个尚未确定的硫酸酪氨酸结合部位，这可解释这一发现，PSGL-1多肽的柔性可使3个硫酸酪氨酸残基中的任一个与此处定义的两个部位结合。这可解释含有一个硫酸酪氨酸残基(包括Tys-5)的PSGL-1的突变为何支持P-选择蛋白的结合(Ramachandran等人，1999)。鼠PSGL-1中相应的N端区也是结合P-选择蛋白所必需的，并且含有2个可能的硫酸酪氨酸，只有2个和4个残基从对应于Thr-16的可能的糖基化位点中去除，上述发现也证明了结合中这种可能的柔性。鼠P-选择蛋白在位点85和114处也含有碱性残基，根据对人P-LE/SGP-3相互作用的观察，预期与鼠PSGL-1内的硫酸酪氨酸有相似的离子作用。这种相互作用的结果是横跨硫酸酪氨酸和SLeX结合部位有较少的间插残基。类似地，PSGL-1 N端区的柔性也允许与Thr-16结合的其它O-聚糖结构的识别。已经对骨髓PSGL-1描述了较长聚-N-乙酰乳酸胺O-聚糖内的SLeX和LeX表位，P-选择蛋白可能以类似的方式适合它。
结论。与SLeX复合的P-LE和E-LE和与此处所示PSGL-1磺基糖肽复合的P-LE的晶体结构显然有助于我们对选择蛋白识别的分子基础的理解。与SLeX复合的P-LE和E-LE的结构显示相同的和不同的结合作用，这解释了它们对共有配体的不同的亲和力。P-LE/SGP-3复合物的结构特别说明了E-和P-选择蛋白对PSGL-1的不同识别如何实现。E-和P-选择蛋白凝集素域的主要序列有50％以上相同，而P-LE/SGP-3相互作用必需的残基是P-选择蛋白独有的，这可能是P-选择蛋白/PSGL-1相互作用的较高亲和力的原因。残基Arg-85和His-114对于与SGP-3内酪氨酸硫酸残基的离子相互作用是重要的，是P-选择蛋白独有的(人E-选择蛋白中的相应残基分别是不带电的Gln和Leu)。有趣的是，在小鼠、大鼠、兔和母牛的P-选择蛋白和E-选择蛋白中观察到这些位点处不同电荷的趋势，提示是P-选择蛋白与PSGL-1相互作用的保守结合基序。这些结构发现也可能了解L-选择蛋白/PSGL-1相互作用的性质。根据单克隆抗体中和(Kansas，1996)和诱变(Ramachandran等人，1999)研究，L-选择蛋白似乎也识别PSGL-1的N端区。这种相互作用的亲和力尚未测定，但相对于P-选择蛋白和E-选择蛋白与PSGL-1的相互作用，预计为中度亲和力。这是根据以下假设高度同源的L-选择蛋白凝集素域采取类似于E-选择蛋白和P-选择蛋白的构象，PSGL-1 N端的识别与P-选择蛋白的识别有共同的性质。与P-选择蛋白一样，人L-选择蛋白在位点85处含有碱性残基(Lys残基)，预计它可与PSGL-1 N端的内硫酸化Tyr形成基本离子作用。然而，L-选择蛋白在位点114处不含碱性残基，这能支持与PSGL-1内酪氨酸硫酸的第二次离子作用，因此结合亲和力也许与P-选择蛋白相当。
E-和P-选择蛋白与此处所示SLeX和PSGL-1磺基糖肽的相互作用主要是基于氢键网络和选择的离子作用，是这类细胞粘附分子的结合亲和力和快速结合动力学的基础。亲和力相对较低的选择蛋白/反受体相互作用的快速可逆性导致白细胞的粘附和滚动，这是随后的激活、牢固粘附和向组织中渗入所必需的。在炎症中，PSGL-1似乎在选择蛋白介导的过程中起中心作用，介导嗜中性粒细胞最初与血管内皮的粘附，并且促进对于炎症反应增强可能十分重要的嗜中性粒细胞-嗜中性粒细胞和嗜中性粒细胞-血小板相互作用。此处所述的结构信息将极大地帮助用于炎症治疗的小分子拮抗剂的合理设计，其中E-和P-选择蛋白/SLeX和P-选择蛋白/PSGL-1相互作用得到证实。表1.数据采集相位确定及精化统计数字
表2E-选择蛋白SLEX 4接触TYR48，GLU80，ASN82，ASN83，GLU92，TYR94，ARG97，GLU98，ASN105，ASP106，GLU107，结合钙
E-选择蛋白SLEX 8接触TYR44，SER45，PRO46，SER47，TYR48，ALA77，PROP78，GLY79，GLU80，PRO81，ASN82，ASN83，GLU88，CYS90，GLU92，TYR94，ARG97，GLU98，LYS99，ASP100，TRP104，ASN105，ASP106，GLU107，ARG108，LYS111，LYS113，结合钙P-选择蛋白SLEX 4接触TYR48，GLU80，ASN82，GLU92，TYR94，PRO98，SER99，ASN105，ASP106，GLU107，结合钙P-选择蛋白SLEX 8接触TYR44，SER46，SER47，TYR48，ALA77，ASP78，ASN79，GLU80，PRO81，ASN82，ASN83，ARG85，GLU88，CYS90，GLU92，ILE93，TYR94，LYS96，SER97，PRO98，SER99，ALA100，TRP104，ASN105，ASP106，GLU107，HIS108，LYS111，LYS113，结合钙P-选择蛋白PSGL-1 4接触ALA9，TYR45，SER46，SER47，TYR48，GLU80，ASN82，LYS84，ARG85，GLU88，GLU92，TYR94，PRO98，SER99，ASN105，ASP106，GLU107，HIS108，LEU110，LYS111，LYS112，LYS113，HIS114，结合锶P-选择蛋白PSGL-18接触SER6，THR7，LYS8，ALA9，TYR10，SER11，TYR44，TYR45，SER46，SER47，TYR48，TYR49，TRP50，ALA77，ASP78，ASN79，GLU80，PRO81，ASN82，ASN83，LYS84，ARG85，ASN86，ASN87，GLU88，CYS90，GLU92，ILE93，TYR94，ILE95，LYS96，SER97，PRO98，SER99，ALA100，TRP104，ASN105，ASP106，GLU107，HIS108，CYS109，LEU110，LYS111，LYS112，LYS113，HIS114，结合锶参考文献(1)Alon，R.，Chen，S.，Puri，K.D.，Finge，E.B.和Springer，T.A.(1997).L-选择蛋白粘连的动力学和选择蛋白介导的滚动机制.J.CellBiol.138，1169-1180.
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(52)Yang，J.，Hirata，T.，Croce，K.，Merrill-Skoloff，G.，Tchernychev，B.，Williams，E.，Flaumenhaft，R.，Furie，B.C.和Furie，B.(1999).定向基因破坏证实，P-选择蛋白糖蛋白配体-1(PSGL-1)是P-选择蛋白介导的而不是E-选择蛋白介导的嗜中性粒细胞滚动和迁移所必需的.J.Exp.Med.190，1769-1782.
上述所有公开文本，无论是公开的专利、未决的申请、发表的文章、蛋白质结构保藏还是其它，均在此完整引用作为参考。尽管为了便于理解已经详细描述了本发明，但本领域技术人员根据内容所述应当理解，在不背离附加权利要求书中本发明真正范围的情况下，能进行形式和细节的更改。
权利要求
1.一种结晶的P-选择蛋白LE。
2.权利要求1的结晶P-选择蛋白LE，其特征在于是空间群为P21的片状，晶胞参数为a＝81.0，b＝60.8，c＝91.4，β＝103.6°。
3.P-选择蛋白LE与SLeX的结晶复合物。
4.权利要求3的结晶复合物，其特征在于是空间群为P21的片状，晶胞参数为a＝81.1，b＝60.5，c＝91.4，β＝103.3°。
5.E-选择蛋白LE与SLeX的结晶复合物。
6.权利要求5的结晶复合物，其特征在于是空间群为P212121的杆状，晶胞参数为a＝34.5，b＝72.4，c＝77.6。
7.P-选择蛋白LE与PSGL-1肽的结晶复合物。
8.权利要求7的结晶复合物，其特征在于是空间群为I222的双棱锥形，晶胞参数为a＝63.4，b＝96.8，c＝187.3。
9.SLeX结合蛋白或肽的活性部位，其中该活性部位包括根据图3的氨基酸残基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
10.权利要求9的活性部位，其中该活性部位还包括根据图3的氨基酸残基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
11.SLeX结合蛋白或肽的活性部位，其中该活性部位包括根据图4的氨基酸残基TYR48、GLU80、ASN82、ASN83、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
12.权利要求11的活性部位，其中该活性部位还包括根据图4的氨基酸残基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
13.PSGL-1结合蛋白或肽的活性部位，其中该活性部位包括根据图5的氨基酸残基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和结合锶的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
14.权利要求13的活性部位，其中该活性部位还包括根据图5的氨基酸残基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109的相对结构坐标，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
15.一种鉴定可与P-选择蛋白LE相互作用的试剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图2、图3或图5的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生P-选择蛋白LE的三维模型；和(b)用该三维模型设计或选择可与P-选择蛋白LE相互作用的试剂。
16.权利要求15的方法，其还包括步骤(c)获得鉴定的试剂；和(d)使鉴定的试剂与P-选择蛋白LE接触，以确定该试剂对P-选择蛋白LE活性的影响。
17.一种鉴定含有SLeX结合部位的分子或分子复合物的激活剂或抑制剂的方法，包括下列步骤(a)利用(i)根据图3的残基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，或(ii)根据图4的氨基酸残基TYR48、GLU80、ASN82、GLU92、TYR94、ARG97、GLU98、ASN105、ASP106、GLU107和结合钙的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生含有SLeX结合部位的分子或分子复合物的三维模型；和(b)用步骤(a)产生的三维模型对候选激活剂或抑制剂进行计算机拟合分析，选择或设计候选激活剂或抑制剂。
18.权利要求17的方法，其中根据图3的相对结构坐标还包括氨基酸残基TYR44、SER46、SER47、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ARG85、GLU88、CYS90、ILE93、LYS96、SER97、ALA100、TRP104、HIS108、LYS111和LYS113，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
19.权利要求17的方法，其中根据图4的相对结构坐标还包括氨基酸残基TYR44、SER45、PRO46、SER47、ALA77、PRO78、GLY79、PRO81、GLU88、CYS90、LYS99、ASP100、TRP104、ARG108、LYS111和LYS113，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
20.权利要求17的方法，其还包括下列步骤(c)获得候选激活剂或抑制剂；和(d)使候选激活剂或抑制剂与该分子或分子复合物接触，确定候选激活剂或抑制剂对该分子或分子复合物的影响。
21.权利要求20的方法，其中为了确定候选激活剂或抑制剂对分子或分子复合物结合SLeX的影响，在SLeX的存在下，使候选激活剂或抑制剂与该分子或分子复合物接触。
22.一种鉴定含有PSGL-1结合部位的分子或分子复合物的激活剂或抑制剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图5的氨基酸残基ALA9、TYR45、SER46、SER47、TYR48、GLU80、ASN82、LYS84、ARG85、GLU88、GLU92、TYR94、PRO98、SER99、ASN105、ASP106、GLU107、HIS108、LEU110、LYS111、LYS112、LYS113、HIS114和结合锶的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生含有PSGL-1结合部位的分子或分子复合物的三维模型；和(b)用步骤(a)产生的三维模型对候选激活剂或抑制剂进行计算机拟合分析，选择或设计候选激活剂或抑制剂。
23.权利要求22的方法，其中根据图5的相对结构坐标还包括氨基酸残基SER6、THR7、LYS8、TYR10、SER11、TYR44、TYR49、TRP50、ALA77、ASP78、ASN79、PRO81、ASN83、ASN86、ASN87、CYS90、ILE93、ILE95、LYS96、SER97、ALA100、TRP104和CYS109，±氨基酸主链原子的一个均方根差，其不超过1.5。
24.权利要求22的方法，其还包括下列步骤(c)获得候选激活剂或抑制剂；和(d)使候选激活剂或抑制剂与分子或分子复合物接触，并确定候选激活剂或抑制剂对分子或分子复合物的影响。
25.权利要求24的方法，其中为了确定候选激活剂或抑制剂对分子或分子复合物结合PSGL-1或PSGL-1肽的影响，在PSGL-1或PSGL-1肽的存在下，使候选激活剂或抑制剂与分子或分子复合物接触。
26.一种鉴定可与SLeX相互作用的试剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图3或图4的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生SLeX的三维模型；和(b)用该三维结构设计或选择可与SLeX相互作用的试剂。
27.权利要求26的方法，其还包括下列步骤(c)获得鉴定的试剂；和(d)使鉴定的试剂与SLeX接触，以确定该试剂对SLeX活性的影响。
28.一种鉴定可与PSGL-1相互作用的试剂的方法，包括下列步骤(a)利用根据图5的相对结构坐标，±不超过1.5的氨基酸主链原子的一个均方根差，产生PSGL-1肽的三维模型；和(b)用该三维结构设计或选择可与PSGL-1相互作用的试剂。
29.权利要求28的方法，其还包括下列步骤(c)获得鉴定的试剂；和(d)使鉴定的试剂与PSGL-1或PSGL-1肽接触，以确定该试剂对PSGL-1或PSGL-1肽活性的影响。
30.利用权利要求15的方法鉴定的一种试剂。
31.利用权利要求17的方法鉴定的一种抑制剂或激活剂。
32.利用权利要求22的方法鉴定的一种抑制剂或激活剂。
33.利用权利要求26的方法鉴定的一种试剂。
34.利用权利要求28的方法鉴定的一种试剂。
全文摘要
本发明涉及P－选择蛋白的凝集素和EGF－样(LE)域的晶体和三维结构，均与SLe
文档编号G01N23/207GK1430516SQ01809777
公开日2003年7月16日 申请日期2001年5月17日 优先权日2000年5月19日
发明者W·S·索莫斯, 唐进, R·喀姆法森, J·瑟赫拉 申请人:遗传学研究所有限责任公司