专利名称：来自Tat、Rev和Nef保守区的HIV肽以及它们作为例如疫苗组分的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于调节性和辅助性HIV蛋白质的保守区域的新肽、自由或载体结合形式的包含至少一种所说的肽的抗原、包含至少一种抗原的疫苗、免疫测定试剂盒和用该抗原探测由人免疫缺陷病毒(HIV)或HIV特异性肽诱导的抗体的方法。
背景获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)在发展中国家里持续提出了难以应付的挑战。在西方国家里，针对HIV-1复制和成熟的治疗策略已经对疾病的发展产生了显著的效果。然而，目前治疗的高成本、药品的高毒性和很少的痊愈意味着安全有效的疫苗的发展对控制AIDS的大范围流行仍然是极为重要的。
HIV-1是编码六个在简单反转录病毒中没有发现的调节和辅助基因的复杂反转录病毒，该基因即tat、rev、nef、vif、vpr和vpu(表1)。在真核细胞中，只有完全剪接的mRNAs被输出到细胞质中进行翻译。未剪接或部分剪接的RNAs在细胞核中保留并最终被降解。这样，由衍生自多重剪接的RNA类的tat、rev和nef基因编码的蛋白质(称为Tat、Rev和Nef)首先被表达并组成早期的HIV-1基因表达。为了表达单独地剪接的RNAs并也为了将未剪接的全长RNA基因组转运入细胞质进行包装，HIV-1发展了克服对RNA转运限制的方法。调节蛋白质Tat和Rev对HIV-1复制是基本的，因为这些蛋白质中的突变除去了HIV-1的生产(Dayton A.I.等人(1986)Cell，44941-947和Fisher，A.G.等人(1986)Nature，320367-371)。
辅助基因是衍生自完全位于HIV-1包膜基因上游的外显子的，如vif，或衍生自位于env上游也在其中但在不同读框中的外显子的，如tat、rev。剪接的效率部分地调节了不同辅助蛋白质基因表达的水平。
在HIV-1原病毒DNA整合后，由细胞的RNA聚合酶II合成了mRNA的占优势的截短的形式，该RNA聚合酶II与位于原病毒DNA长末端重复(LTR)的5’位点相互作用。tat是首先被表达的基因之一，它携带核定位信号。它是可使LTR-指导的转录增强高达一千倍的有效转录激活物。Tat的持续表达为持续的高水平基因表达提供了正反馈回路的保证。不同于与DNA序列相互作用的常规转录激活物，Tat在特定的茎-环二级结构即TAR(反式激活反应元件)上直接结合到所有HIV-1 RNAs的5’末端。环的结构对Tat的功能是高度保守的和基本的。已经用核磁共振(NMR)分析了Tat/TAR相互作用的结构(Puglisi等人(1992)Science，25776-80)。Tat结合与细胞蛋白质(细胞周期蛋白T)有关联的TAR，它依次再结合使RNA聚合酶II的C-末端结构域磷酸化的CDK9，从而促进RNA转录物的延长。这些Tat的细胞辅因子只在激活的细胞中存在，它们的缺乏抑制了原病毒DNA的转录，导致T-淋巴细胞中的“准潜伏期”。Tat是从两个外显子表达的，核定位信号和TAR结合区域两者都位于第一个外显子中。Tat是由感染的细胞分泌的，且可以对相邻细胞发挥异源的作用。这包括细胞激活(Hofman等人(1993)Blood，822774-2780)、细胞凋亡的诱导(Macho等人(1999)Oncogene，187543-7551)、发挥分泌型生长因子的功能(Trinh，D.P.等人(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.，256299-306)和调制宿主细胞蛋白质合成以有利于病毒的蛋白质合成(Xiao等人(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.，244384-389，1998)。目标为Tat的治疗策略因此对HIV-1感染具有强烈的效果。
在感染后的早期中，编码Tat、Rev和Nef的小的多重剪接的mRNAs占优势。当产生了Rev的阈水平时，未剪接的和单独地剪接的RNAs在细胞质中积累以进行翻译，使得生产性的感染得以进行。缺乏生成Rev的该阈水平可能有助于HIV的准潜伏期。Rev只可以结合到携带有RNA结构—RRE(Rev反应元件)的RNAs上，该RRE位于基因组的env编码区域。Rev与RRE通过在蛋白质的氨基酸末端一半的富碱性精氨酸区域以多聚体方式相互作用。该相互作用的结果是可提供例如Env、Vif、Vpu和Vpr的基因产物的部分剪接的RNAs的转运以及可充当新基因组以整合入装配颗粒的未剪接的RNAs的转运。利用NMR也完成了对Rev/RRE相互作用的结构分析(Battiste等人(1996)Science，2731547-1551，1996)。Rev携带有富亮氨酸输出信号，使得它可以为了新合成的RNAs的继续的转运而在细胞核和细胞质之间穿梭往返(Kalland等人(1994)J.Virol.，681475-1485；Meyer & Malim，(1994)Genes Dev.，81538-1547)。这样，Rev确保结构基因是在调节基因之后晚期表达的。对抗Rev的治疗策略将在感染早期打断病毒的生活周期。
尽管最初Nef被描述为负因子，后来显示它对病毒的复制具有正作用，且它在感染的早期和贯穿始终都以比Tat和Rev更大的量表达。Nef在N末端十四烷基化且与质膜的内侧面有关联。Nef是通过胞吞作用造成表面CD4减量调节和降解的部分原因(Piguet等人(1998)EMBO J.，172472-2481)。将CD4从细胞表面去除可防止其他HIV-1菌株的超感染或新释放的病毒的再感染。Nef也是造成MHC类型I减量调节的原因，从而防止受感染的细胞被细胞毒性T-淋巴细胞破坏(Le Gall等人(1997)Res.Virol.，14843-47)。Nef不是基本的病毒蛋白质，因为它对于外周血淋巴细胞或T细胞系的体外感染不是必需的。然而，Nef缺失突变体在很长的时期里是较小致病性的。Nef也对细胞内的信号转导途径具有复杂的作用，且它含有可与在T-细胞激活中涉及的激酶的SH3结构域相互作用的富脯氨酸的区域，这是有效的HIV复制所必需的特征(Moarefi等人(1997)Nature，385650-653)。含有Nef的病毒能够有比缺失Nef基因的病毒多的病毒DNA合成，这暗示Nef直接或间接地激活病毒的逆转录酶。与病毒体有关联的低水平的Nef可能是造成该现象的原因。低水平的Nef也是从受感染的细胞中释放的，尽管对相邻细胞的潜在作用还不清楚。由于Nef是在感染的早期表达的且对CD4和MHC类型I的表达以及疾病的进行有显著的作用，因此它代表了将来治疗策略的重要的目标。
Tat和Nef是分泌的并可被巨噬细胞吸收，且与MHC类型II有关联地表达。这改进了它们作为基于肽的治疗的目标的适宜性，其中的肽也要在MHC类型II的环境中表达。明显地，除了也在早期表达且影响疾病进行的Nef之外，也应该优先把对于HIV-1的复制是基本的早期基因产物如Tat和Rev作为目标。
表1 HIV-1调节和辅助蛋白质。
在疫苗候选物中的天然的HIV序列不能够刺激稳定的长期免疫反应，这是由于HIV通过改变递呈给免疫系统的抗原决定部位的外观而隐藏的固有能力。为了克服抗原决定部位的这种变化的递呈，某些氨基酸替代物和氨基酸组合将支持免疫系统以可靠的方式递呈和识别外源的病毒抗原并因而达到更高的程度。
基于上述背景，我们决定研究设计新型合成肽的可能性，这些肽可以模仿来自调节性和辅助性的HIV蛋白质的抗原决定部位，以使得它们可以暴露在免疫系统的体液和细胞两部分，以满足有效的治疗性的和/或预防性的疫苗的需要。
最初的工作是基于天然的Tat氨基酸序列的，该序列发表在Korber B.等人，《人逆转录病毒和AIDS》(Human Retrovirusesand AIDS)1997 Eds.Theoretical Biology and BiophysicsGroup，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，NM。第一个Tat抗原决定部位定位于tat蛋白质的氨基酸1和氨基酸24之间表2 Tat抗原决定部位氨基酸序号天然出现的氨基酸1 M S2 E D V3 S Q P L V A4 V I5 D N6 P H A7 R N S K E D8 L I Q R V M T9 E D P10P S11W12K N E H L13H R Q14P15G P16S N A17Q K T18P H19K T S A R P E Q20T A I21A P D V22C S23T N S24N K R Q A P T
在本说明书中给出的序列中表示氨基酸的单字母以及三字母代号是与国际标准相一致的，并且也在教科书中给出，例如LehningerA.L.，《生物化学原理(Principles of Biochemistry)》，WorthPublishers Inc.，New York，1982。在左侧栏的右边给出的氨基酸代表序列的天然的变型。我们的分析结果得到了含有该修饰的抗原决定部位的序列 其中的Nl表示2-氨基己酸(正亮氨酸，三字母和单字母分别缩写为Nle和Nl)，半胱氨酸残基是氧化态的，即形成了链内二硫键。由于肽的C-末端部分(在位置22)的半胱氨酸残基是在该选择的抗原决定部位外部的分子内二硫键的一部分，因此相似的肽内二硫键是通过在选择的抗原决定部位的N-末端放置半胱氨酸而形成的。另一种可供选择的办法是通过序列的二聚化而形成分子间二硫键 进一步可供选择的办法是与选自Tat的另一个抗原决定部位二聚化。Tat上的第二个抗原决定部位位于C-末端方向的氨基酸35和57之间，与第一个抗原决定部位由10个氨基酸分隔，这10个氨基酸除每个抗原决定部位中的Cys残基之外还含有5个Cys残基。相对高的Cys残基的数目提供了各种分子间和分子内交联的可能性。很可能该富Cys的结构域将支配这种蛋白质的免疫学暴露并因此导致两个相关抗原决定部位的“隐藏”。两个接近的抗原决定部位的选择和修饰可以更优化的方式暴露Tat蛋白质的基本部分。
为了减少脱逸突变型发展的概率，进一步增加了抗原决定部位的数目，并且选择了两个额外的肽序列。这些序列位于Rev(残基58-78)和Nef(残基65-85)。天然的序列已经发表在《人逆转录病毒和AIDS》(Human Retroviruses and AIDS)1999；核酸和氨基酸序列的汇集和分析(A Compilation and Analysis of NucleicAcid and Amino Acid Sequences)Eds.Theoretical Biologyand Biophysics Group，Los Alamos National Laboratory，LosAlamos。
表3 Tat抗原决定部位氨基酸序号天然出现的氨基酸35QPILTYV36VACL37C38F39ILQMT40TNKR41KQ42GA43L44GS45I46SFY47YN48G49RKS50K51K52R53RKSG54QRP55R56R57RGS
表4 Rev抗原决定部位氨基酸序号 天然出现的氨基酸58RWQ59IVLF60LIP61GSNDCVTAR62TADNS63YCFRHSVL64LV65GH66RG67SPFL68ATEQVPS69EKQDN70PSAN71VNGP72PQHSLRTDI73LFV74QLPHDE75L76P77PLE78LIVP以及Nef抗原决定部位，表5氨基酸序号天然出现的氨基酸65E G D S66N G D E67E V68A G69L F70P71I V72T R K A M73P74Q H75V L I76P77L V T78R79P80M V I81T D82Y F R83K R84A G S E Q85A S V为了确定序列的唯一性以及它们与其作为HIV-1抗原的特异性和敏感性相结合的刺激免疫系统的性质，已经合成了几个修饰的肽。
发明描述根据本发明的肽是来源于上述的HIV-1的Tat、Rev和Nef蛋白质的4个不同的保守区域的，具有维持HIV-1的抗原决定部位的唯一性(免疫原性、敏感性和特异性)的性质。进一步地，根据本发明的新肽不具有已知的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)拮抗效应并应该具有至少一个潜在的CTL抗原决定部位。
根据本发明，满足上述标准的肽选自Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Leu Glu Pro Trp Xaa12His Pro Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24(SEQ ID NO1)其中链中的氨基酸可具有如下的含义肽衍生物1位的Xaa是Met、Ser、Cys或没有，2位的Xaa是Glu、Asp、Val、Ser或没有3位的Xaa是Ser、Gln、Pro、Leu、Val、Ala、Trp、Tyr或Phe，4位的Xaa是Val或Ile，5位的Xaa是Asp、Asn或Ile，6位的Xaa是Pro、His或Ala，7位的Xaa是Arg、Asn、Ser、Lys、Glu或Asp12位的Xaa是Leu、Ile或Nle15位的Xaa是Gly或Pro16位的Xaa是Ser、Asn或Ala，17位的Xaa是Gln、Lys或Thr18位的Xaa是Pro或His，19位的Xaa是Lys、Thr、Ser、Ala、Arg、Pro、Glu、Leu、Ile或Nle20位的Xaa是Thr、Ala或Ile21位的Xaa是Ala、Pro、Asp或Val22位的Xaa是Cys或Ser23位的Xaa是Thr、Asn或Ser24位的Xaa是Asn、Lys、Arg、Gln、Ala、Pro或Thr该肽包含SEQ ID NO1序列的至少6个连续的氨基酸，此外两个或多个Cys残基可形成部分链内或链间二硫键连接，即其中p＝1-8的-S-(CH2)p-S-或-(CH2)p-桥，可选择地由一个或多个杂原子如O、N或S介入；Xaa1Xaa2Xaa3Phe Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12-Z-Tyr XaaiGlyXaa15Lys Lys Arg Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23(SEQ ID NO4)其中链中的氨基酸可具有如下的含义1位的Xaa是Pro、Ile、Leu、Thr、Tyr或Val2位的Xaa是Val、Ala、Cys、Leu3位的Xaa是Cys、Ile、Leu、Val或Nle5位的Xaa是Ile、Leu、Gln、Met或Thr6位的Xaa是Thr、Asn、Lys或Arg7位的Xaa是Lys、Arg或Gln8位的Xaa是Gly或Ala9位的Xaa是Leu或Ile10位的Xaa是Gly、Ser或Ala11位的Xaa是Ile或Gly12位的Xaa是Ser、Phe或Tyr在14位前插入的Xaai是Leu、Ile、Nle15位的Xaa是Arg、Lys、Ser或瓜氨酸(Cit)19位的Xaa是Arg、Lys、Ser、Gly或Cit
20位的Xaa是Gln、Arg或Pro21位的Xaa是Ile或Leu22位的Xaa是Gly、Leu、Ile、Cys或没有23位的Xaa是Gly或没有其中SEQ ID NO4的序列包含至少6个连续的氨基酸，-Z-为可选择的连接体并具有PEG、修饰的PEG和/或[Gly]n的含义，其中n＝1、2或3，此外两个或多个Cys残基可形成部分链内或链间二硫键连接，即其中p＝1-8的-S-(CH2)p-S-或-(CH2)p-桥，可选择地由一个或多个杂原子如O、N或S介入；Xaa1Ile Leu Xaa4Xaa5Xaa6Leu Gly Arg Xaa10Xaa11-Z-Xaa12Leu XaaiXaaiXaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Leu Pro Pro Leu(SEQ ID NO7)其中1位的Xaa是Phe、Tyr、Trp或Arg4位的Xaa是Gly、Ser、Asn、Asp、Cys、Val、Thr、Ala或Arg5位的Xaa是Thr、Ala、Asp、Asn或Ser6位的Xaa是Tyr、Cys、Phe、Arg、His、Ser、Val或Leu10位的Xaa是Ser、Pro、Phe、Leu或Ile11位的Xaa是Ala、Thr、Glu、Gln、Val、Pro或Ser12位的Xaa是Glu、Lys、Gln、Asp、Asn、Tyr、Trp或Phe在13位后插入的Xaai是Ser、Pro、Phe、Leu或Ile在14位前插入的Xaai是Ala、Thr、Glu、Gln、Val、Pro或Ser14位的Xaa是Glu、Lys、Gln、Asp或Asn15位的Xaa是Pro、Ser、Ala或Asn16位的Xaa是Val、Asn、Gly或Pro17位的Xaa是Pro、Gln、His、Ser、Leu、Arg、Thr、Asp或Ile18位的Xaa是Leu、Phe或Val
19位的Xaa是Gln、Leu、Pro、His、Asp或Glu其中SEQ ID NO7的序列由至少6个连续的氨基酸组成，连接体-Z-是可选择的并具有PEG、修饰的PEG和/或[Gly]n的含义，其中n＝1、2或3；Xaa1Leu Val Gly Xaa5Pro Xaa7Xaa8Pro Xaa10Xaa11Pro-Z-[Arg]mXaaiXaa13Xaa14Pro Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21(SEQ ID NO10)其中1位的Xaa是Lys或ArG5位的Xaa是Phe或Leu7位的Xaa是Ile或Val8位的Xaa是Thr、Arg、Lys、Ala或Met10位的Xaa是Gln或His11位的Xaa是Val、Leu或Ile在13位前插入的Xaai是Leu13位的Xaa是Leu、Val或Thr14位的Xaa是Arg或瓜氨酸(Cit)16位的Xaa是Met、Val、Ile或Nle、Leu17位的Xaa是Thr或Asp18位的Xaa是Tyr、Phe或Arg19位的Xaa是Lys或Arg20位的Xaa是Ala、Gly、Ser、Glu或Gln21位的Xaa是Ala、Ser或Val其中SEQ ID NO10的序列由至少6个连续的氨基酸组成，连接体-Z-是可选择的并具有PEG、修饰的PEG和/或[Gly]n的含义，其中n＝1、2或3，且独立于n，[Arg]m中的m＝0、1、2或3，序列的末端可为游离羧基或氨基基团、酰胺、酰基、乙酰基或其盐类，和/或所说的肽序列是固定在固体支持物上的。
新肽的序列具有充当好的抗原的潜力，其中该抗原包含至少一种选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7或SEQ ID NO10的序列的肽。可以通过以如二聚化或多聚化和/或固定到固相上来调整不同肽的比率或浓度或肽的大小以改变抗原性。根据本发明，抗原包含一个或多个多肽序列，它们或者通过如位于链中Cys残基之间的二硫键或可能由一种或多种杂原子如O、S或N介入的C1-C8的亚烷基(alkylen)的键来连接，或者优选地它们是不连接的。该链可被以单聚体、二聚体或寡聚体的形式固定到固相上。可将额外的氨基酸添加到末端以获得促进固定化的《臂》。
PEG是聚乙二醇(HO(CH2CH2O)aH且可以是连接体-Z-的部分，可选择地，在连接之前用二羧酸(HO(CH2CH2O)aCO(CH2)bCOOH)或末端羧基(HO(CH2CH2O)a-1CH2COOH)对PEG进行修饰，其中a＝1-10，b＝2-6。
连接体-Z-可或者由PEG、修饰的PEG或其组合组成，和/或由一种或多种结合的Gly残基组成。可作为选择地，连接体-Z-可由Gly-桥[Gly]n组成，其中n＝1、2或3。
本发明中肽的所有氨基酸均可为D-或L-型的，尽管优选的是天然的L-型。
经过修饰末端NH2-基团和/或COOH-基团，肽序列的C-和N-末端可以与天然序列不同，它们可被进行如酰基化、乙酰基化、酰胺化或修饰以提供载体或其他分子的结合位点。
根据本发明的肽由6到50个氨基酸组成，优选地为10到30个氨基酸之间。它们包括了氨基酸在鉴定了的位置的所有天然变型。
根据本发明的多肽抗原是游离或载体结合型的。肽可选择地结合的载体或固相可选自大量已知的载体。它们应该是根据固定的多肽作为诊断抗原或疫苗中的免疫成分的计划用途而选择的。
可被用作如诊断目的的载体例子是共聚物的磁珠或胶乳如苯乙烯-二乙烯苯、羟基化的苯乙烯-二乙烯苯、聚苯乙烯、羧基化的聚苯乙烯、炭黑珠、非激活的或聚苯乙烯或聚氯乙烯激活的玻璃、环氧激活的多孔的磁性玻璃、明胶或多糖颗粒或其他蛋白质颗粒、血红细胞、单克隆或多克隆抗体或这样的抗体的fab片段。
根据本发明的进一步的实施方案，抗原可构成疫苗的部分，该疫苗可能与载体、佐剂结合或与其他免疫刺激元件如携带有env基因的金丝雀痘病毒(canarypox virus)结合。用于疫苗目的的载体和/或佐剂的例子是其他蛋白质，例如人或牛的血清白蛋白和匙孔血蓝蛋白和脂肪酸。可将免疫刺激材料分为三组佐剂、抗原的载体和媒介物。佐剂的实施例包括氢氧化铝(aluminum hydroxyd)、铝盐、皂苷、胞壁酰二肽和三肽、单磷酰脂A、棕榈酸、B.pertussis和包括Th1细胞因子IL-12和IL-1的各种细胞因子。许多蛋白质毒素可被用于携带过客(passenger)蛋白质跨细胞膜进入细胞溶胶，该蛋白质在发展CTL疫苗中是有用的。载体包括细菌类毒素，例如失活的破伤风和霍乱毒素、遗传上去毒的细菌毒素如来自大肠杆菌(E.coli)的热不稳定性的肠毒素、脂肪酸、活的载体如形成例如酵母反转录转座子杂合体TY颗粒和HBcAg颗粒的微粒的脊髓灰质炎嵌合和杂交蛋白质。在现代疫苗中经常出现的成分媒介物由矿物油乳剂、弗氏完全和不完全佐剂、植物油乳剂、非离子型嵌段共聚物表面活性剂、角鲨烯或角鲨烷、脂肽、脂质体和生物降解性微球组成。具有发展新疫苗的重要潜力的两个新佐剂包括水包油微乳状液(MF59)和多聚体微颗粒。可以用到任何可以增强抗原的免疫原性的物质，且几个载体或佐剂的此外的替代物在美国或欧洲药典中给出。
用于免疫刺激用途的抗原的适当的制剂也可包含干扰素如INF-γ、抗病毒的趋化因子或生血生长因子例如粒细胞巨噬细胞生长因子。
为了增强如肠内的刺激和吸收的另一种方法是与小肽如二、三或四肽一起给予本发明的肽。这些肽可在加于本发明的肽之后或与其组合给予。优选地，这些肽是与三肽YGG一起给予的，由D-或L-型的氨基酸组成，优选地为D-型。
最近的对非肠胃外的疫苗递送例如通过粘膜层的方法包括基因融合技术以创建粘膜佐剂的非毒性衍生物、在基本基因有缺失的遗传上失活的抗原、抗原和在粘膜的免疫反应的调节和控制中重要的特异性细胞因子的共表达，以及本身允许DNA或RNA摄入及在宿主细胞中的内源表达的遗传材料。
发展持久的反应(其中细胞介导的免疫是必需的)的一个方法是用编码一种或多种特异性抗原的质粒DNA来进行免疫。
为了保护免受HIV感染，疫苗应该诱导粘膜的和全身的免疫反应并可通过任何方便的路线给予，肠胃外的或非肠胃外的，例如皮下的、皮内的、静脉内的、肌内的、口服的、粘膜的或鼻内的。
在根据本发明的疫苗的优选实施方案中，该疫苗包含含有选自SEQ ID NO1、4、7和10中至少一组的肽的抗原，更优选的是不同的肽以相等的量出现，在进一步的优选实施方案中，疫苗组合物包含抗原F V I H R L E P W L H P G S Q H NI T A S T N-NH2(SEQ ID NO14)和R L V G F P V K P Q V P G L L R P L T Y K A A-NH2(SEQ ID NO15).
该序列可激活细胞免疫系统，并与CTL-抗原决定部位一起作用。在CTL-抗原决定部位的读框内进行的氨基酸改变被设计用来获得增强的结合。已经实施了其他的氨基酸改变以促进肽的合成和/或增加肽的溶解性。
用现在的抗原在体液样品中探测由HIV-1或HIV-1特异性肽或蛋白质诱导的抗体的方法是本发明的进一步的实施方案。本发明还包含为该探测而设计的免疫测定试剂盒和能够选择性地与所说的抗原反应的抗体。
肽制备描述本发明的肽可通过任何已知的生产线性氨基酸序列的方法进行生产，例如重组DNA技术。将编码一种或多种本发明的肽或该肽的多聚体的核酸序列引入到表达载体中。适当的表达载体是含有复制和表达的必需的控制区域的如质粒、粘粒、病毒和YAC(酵母人工染色体)。表达载体在宿主细胞中可被刺激而表达。适当的宿主细胞为如细菌、酵母细胞和哺乳动物细胞。这样的技术是本领域所公知的，并描述于如Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》(MolecularCloningA Laboratory manual)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，1989。其他众所周知的技术是降解或通过将一个氨基酸残基在液相中或优选地在固相(树脂)中与下一个相偶联的合成，例如通过所谓的Merrifield合成法。参见如Barany和Merrifield的Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.2，E，Gross和Meinhofer，Ed.(Acad.Press，N.Y.，1980)、Kneib-Coronier和Mullen Int.J.Peptide Protein Res.，30，p.705-739(1987)以及Fields和Noble Int.J.Peptide Protein Res.，35，p.161-214(1990)。
倘若连接的或环状的肽是必需的，那么当适当的线性氨基酸序列合成后，可使氨基酸序列遭受化学氧化步骤以在一个肽序列中或在两个肽序列之间环化或连接两个Cys残基，参见Akaji等人，Tetrahedron Letter，33，8，p.1073-1076，1992。
合成概述在下面给出的实施例中制备的所有肽衍生物均利用标准程序在Milligen 9050肽合成仪上合成。所用的树脂为Tenta Gel P RAM，理论加样为0.20meq/g(RAPP POLYMERE GmbH，Tübingen)。合成的终产物在真空中干燥过夜。然后通过在作为清除剂的乙二硫醇(5％)和水(5％)的存在下用90％的三氟乙酸将肽从树脂上分开(RT1.5小时)。然后将树脂过滤并在过滤器上用额外的三氟乙酸(100％)(2×20ml)洗涤。将组合的滤出液在真空中蒸发(在RT水浴)，且用乙醚(200ml)和过滤掉的沉淀产物研磨残余物。迅速地将固体用冰乙酸(100ml)在过滤器中溶解，并加入1.5升20％的在甲醇中的乙酸，然后用0.1M在甲醇中的碘溶液处理直到获得淡褐色的颜色。然后加入乙酸盐形式的Dowex 1×8离子交换(Bio-Rad，Richmond，CA)(15g)并过滤混和物。蒸发滤出液并从乙酸中冷冻干燥残余物。然后在含有在0.1％的三氯乙酸水溶液中的乙腈的适当的系统中，通过在用Kromasil100-5C8(EKA Noble，Surte，Sweden)填充的柱上的反相液相层析提纯产物。从柱中收集的样品通过装备了Kromasil100-5C8柱(EKA Noble，Surte，Sweden)的分析性高效液相色谱(HPLC)(Beckman System Gold，USA)进行分析。汇集含有纯物质的组分，将溶液蒸发并从乙酸中冷冻干燥产物。最终的HPLC分析是在终产物上进行的，并且肽的结构通过氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实。
在合成中所用的所有氨基酸都是L-氨基酸且它们在α-氨基官能团处用芴基-甲氧基-羰基基团进行保护。侧链以如下所示来保护Cys(Trt)，Gln(Trt)，Glu(OtBu)，Thr(tBu).
在括弧内的缩写为Trt＝三苯基甲基tBu＝叔丁基OtBu＝叔丁基酯氨基酸衍生物是由Bachem AG，Switzerland提供的。
实施例1
C S W V N P R L E P W Nl H P G S Q H Nl T A C T N-NH2(SEQ ID NO2)的制备。该肽是根据合成概述从相应起始材料以酰胺形式合成的。然后通过用I2氧化来环化该肽。将该肽溶解于乙酸/甲醇(1∶4)中并加入0.1M在甲醇中的I2。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
纯度(HPLC)大于97％(单一杂质少于1％)分子量(游离碱)2746.2实施例2F V I P R L E P W Nl H P G S Q P Nl T A C T N-NH2(SEQID NO3)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
纯度(HPLC)大于97％(单一杂质少于1％)分子量(游离碱)2538.0实施例3Y L L F L T K G L G I S G G G Y Nl G Cit K K R Cit Q I LG-NH2(SEQ ID NO5)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
实施例4Y L Nl F L T R G L G I S G G G Y Nl G Cit K K R Cit Q IC G-NH2(SEQ ID NO6)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
纯度(HPLC)大于97％(单一杂质少于1％)分子量(游离碱)3097.7
实施例5R I L S T Y L G R I S G G G W L S A E P V P L Q L P P L-NH2(SEQ ID NO8)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
纯度(HPLC)大于97％(单一杂质少于1％)分子量(游离碱)2990.6实施例6R I L S T Y L G R I S G G G Y L S A E P V P L Q L P P L-NH2(SEQ ID NO9)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
实施例7K L V G F P V K P Q V P G G G R L L Cit P Nl T Y K A A-NH2(SEQ ID NO11)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
实施例8R L V G F P V K P Q V P G G G R L L R P L T Y K A A-NH2(SEQ ID NO12)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
纯度(HPLC)大于97％(单一杂质少于1％)分子量(游离碱)2790.4分子式C130H217O39N29
实施例9经由二硫键的二聚化使实施例2中的肽序列经由氧化步骤连接而形成二肽，其中的半胱氨酸残基形成二硫键。该键以下面任何一种途径形成，即A)用I2进行氧化。将该肽(如果不同的话用相等的量)溶解于乙酸/甲醇(1∶4)中并加入0.1M在甲醇中的I2以得到同型二聚体的混和物，或B)经由[Cys(Spy)22]-SEQ ID NO3进行氧化。将溶解于2M AcOH(aq)和2-丙醇(1∶1)中的2.3mM的肽SEQ ID NO3用2，2二硫代二吡啶(dithiodipyridin)(3eqv)处理以得到[Cys(Spy)22]-SEQ ID NO3。将[Cys(Spy)22]-SEQ ID NO3溶解于10mM NH4Oac(aq pH＝6.5)和甲醇(5∶2)中以得到二聚体SEQ ID NO13。
结果所得的二聚体的纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
实施例10F V I H R L E P W L H P G S Q H Nl T A S T N-NH2(SEQID NO14)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
纯度(HPLC)大于98％(单一杂质少于1％)分子量(游离碱)2540.2实施例11R L V G F P V K P Q V P G L L R P L T Y K A A-NH2(SEQID NO15)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
纯度(HPLC)大于99％(单一杂质少于1％)分子量(游离碱)2520.3实施例12-参考实施例天然tatl序列M E S V D P R L E P W K H P G S Q P K T AC T N-NH2(SEQ ID NO16)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
纯度(HPLC)大于97％(单一杂质少于1％)分子量(游离碱)2708.1实施例13-参考实施例天然tat2序列Q V C F I T K G L G I S Y G R K K R R Q RR R-NH2(SEQ ID NO17)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
纯度(HPLC)大于94％分子量(游离碱)2806.4实施例14-参考实施例天然Nef序列E E V G F P V R P Q V P L R P M T Y K A A-NH2(SEQ ID NO18)的制备。该肽是从根据合成概述的相应起始材料以酰胺形式合成的。纯度是用HPLC分析确定的，而结构是用氨基酸分析和质谱分析法(LDI-MS)来证实的。
纯度(HPLC)大于95％分子量(游离碱)2384.8
实施例15制备了包含肽SEQ ID NO3和12的疫苗。将冷冻干燥的肽以终浓度4mg/ml溶解于无菌水中。根据生产商的使用说明，也制备了终浓度为0.3mg/ml的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)制剂。将两种溶液以皮内方式给予。一般的注射剂量为100μl。
实施例16制备了包含肽SEQ ID NO14和15的疫苗。将冷冻干燥的肽以终浓度4mg/ml溶解于无菌水中。根据生产商的使用说明，也制备了终浓度为0.3mg/ml的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)制剂。将两种溶液以皮内方式给予。一般的注射剂量为100μl。
实施例17将抗原溶液或悬浮液与等份的Behring的弗氏完全或不完全佐剂混和，然后通过将该溶液吸入注射器针筒内并用力挤出或用匀浆器而使其很好地乳化。该乳剂应保持稳定至少30分钟。最好使抗原-佐剂乳剂以贮存物(depot)形式进行皮下注射。
实施例18探测由HIV-1诱导的抗体的免疫测定。
磁性颗粒试剂将根据生产商推荐的规程来制备。Dynal AS是所使用的Dynabeads的生产商。用配体覆盖的磁性颗粒被称为试剂1。根据本发明的肽是与磁性颗粒预活化的表面共价偶联的。也可能将肽物理地吸附到磁性颗粒表面。试剂1中颗粒的浓度为1mg/ml到15mg/ml。颗粒的大小在0.2μm到15μm。肽的浓度为0.01mg/mg颗粒到1mg/mg颗粒。
抗人Ig碱性磷酸酶(AP)缀合抗体试剂是根据Dako AS推荐的规程制备的。该规程是本领域中的标准程序。将该试剂称为试剂2。
底物溶液酚酞-单磷酸酯(phenolphtaleine-monophosphate)将根据Fluka AG推荐的规程来制备。该规程是本领域中的标准程序。将该底物溶液称为试剂3。
所使用的洗涤和温育缓冲液是具有下面额外的化合物的0.05Mtris-碱缓冲液Tween 20(0.01％到0.1％)、甘油(0.1％到10％)和氯化钠(0.2％到0.1％)。
测定程序包含温育步骤，其中在每一个孔内将1滴试剂1与2滴洗涤缓冲液混和。混和后，加入30μl样品，然后将溶液温育5分钟。磁性颗粒可用磁体来捕获，并且在磁体被分离之前去除液体。然后在与试剂2温育之前，用4滴洗涤缓冲液将孔洗涤两次。将1滴试剂2和2滴洗涤缓冲液加入并使溶液温育5分钟。磁性颗粒可用磁体来捕获，并且在磁体被分离之前去除液体。然后在与试剂3温育之前重复洗涤步骤。将2滴试剂3加入到每一个孔中且使溶液温育3分钟。结果可在白色背景下读取。正结果是红色的(3+＝浓红色)然而负结果是明显的淡黄/褐色溶液，在负对照中得到。
免疫测定试剂盒可被用于探测由HIV病毒或HIV特异性肽或蛋白质例如本发明的肽所诱导的抗体。
实施例19治疗性或预防性疫苗选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7或SEQ IDNO10的本发明的至少一个多肽可形成抗原，并且可组成预防性或治疗性疫苗的活性要素，其中的疫苗可提供对1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的保护。该疫苗可包括在保护或刺激宿主(人或脊椎动物)的免疫系统中具有有利作用的化合物如白细胞介素、干扰素、粒细胞巨噬细胞生长因子、生血生长因子等。优选地，该疫苗组合物进一步含有佐剂或媒介物，更优选地，佐剂或媒介物为可能含有明矾的单磷酰脂A(MPL)、弗氏佐剂(完全的或不完全的)或氢氧化铝。佐剂/媒介物最适的量将依赖于所选择的类型。
本发明的肽通过在C-末端添加单脂肪酸如单棕榈酰链进行修饰以形成脂肽疫苗。进一步，该脂肽可用冷冻-融化方法而引入脂质体膜，结果得到在其表面具有肽配体的脂质体。
肽或疫苗制剂在贮藏之前可以被冷冻干燥。可将冷冻干燥的肽溶解于无菌水中至终浓度为0.1-100mg/ml。可将疫苗优选地于低温贮藏在安瓿中以备使用，该安瓿含有一个或多个剂量单位。根据本发明的肽的一般剂量单位在浓度范围0.05μg-1mg每kg体重，优选地为0.15μg-0.15mg每kg体重。本领域的技术人员可以理解适当的剂量将依赖于病人的体重、疾病类型、状况的严重程度、给予途径以及几个其他因素。当用作治疗性疫苗时，该疫苗通过注射可给予高达12次。可随后加以进一步的强化，并且在一些情况下该强化在贯穿病人一生发生。在注射溶液的制备中，将每种肽以终浓度为1mg/ml溶解于无菌水中。一般的注射量为100μl到200μl(2×100μl)。优选地，该肽是与适当的佐剂和/或粒细胞巨噬细胞生长因子共同给予的，例如在浓度范围0.1mg/ml到1mg/ml的Leucoma《SheringPlough》，或根据生产商的使用推荐。特别优选地为组合治疗，其中本肽是与在公布的国际专利申请号PCT/N000/00075和/或共同未决的挪威专利申请号2000 4413中所描述的肽一起给予的。这些肽可同时或相继地给予。适当的给予法可为皮内、皮下、静脉内、口服、肌内、鼻内、粘膜的或任何其他的适当途径。为了维持保护，强化的给药是必需的。对那些本领域的技术人员而言，可以理解根据本发明的疫苗组合物不仅在预防感染中有用，而且在治疗感染中也有用。
当在小鼠中以100μg每kg体重的剂量注射时，观察不到根据本发明的肽的毒性作用。
上述实施例仅仅意味着本发明的说明。必须理解本领域的技术人员可修饰此处描述的肽、抗原和疫苗，而不背离如本发明在权利要求中所阐明的概念和范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名Bionor lmmuno AS(B)街道Strmdalsjordet 4，P.O.Box 1893 Gulset(C)城市3703 Skien(E)国家挪威(F)邮政编码(ZIP)N-3705(G)电话+47 35 50 57 50(H)电传+47 35 50 57 01(i)发明人(A)姓名Birger Srensen(B)街道Meierlia 3(C)城市3727 Skien(D)国家挪威(ii)发明题目来自Tat，Rev和Nef保守区的HIV肽以及它们作为例如疫苗组分的应用(iii)序列数目18(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM兼容(C)操作系统Windows 2000(D)软件Word 7.0(v)目前申请日申请号(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度22-24氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(v)片段类型内部的(ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注释＝″位置1的Xaa是Met，Ser，Cys或没有ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2(D)其它信息/注释＝″位置2的Xaa是Glu，Asp，Val，Ser或没有ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置3(D)其它信息/注释＝″位置3的Xaa是Ser，Gln，Pro，Leu，Val，Ala，Trp，Tyr或Pheix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置4(D)其它信息/注释＝″位置4的Xaa是Val或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置5(D)其它信息/注释＝″位置5的Xaa是Asp，Asn或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置6(D)其它信息/注释＝″位置6的Xaa是Pro，His或Alaix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置7(D)其它信息/注释＝″位置7的Xaa是Arg，Asn，Ser，Lys，Glu或Aspix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12(D)其它信息/注释＝″位置12的Xaa是Leu，Ile或Nleix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置15(D)其它信息/注释＝″位置15的Xaa是Gly或Proix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置16(D)其它信息/注释＝″位置16的Xaa是Ser，Asn或Alaix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置17(D)其它信息/注释＝″位置17的Xaa是Gln，Lys或Thrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置18(D)其它信息/注释＝″位置18的Xaa是Pro或Hisix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置19(D)其它信息/注释＝″位置19的Xaa是Lys，Thr，Ser，Ala，Arg，Pro，Glu，Leu，Ile或Nleix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置20(D)其它信息/注释＝″位置20的Xaa是Thr，Ala或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置21(D)其它信息/注释＝″位置21的Xaa是Ala，Pro，Asp或Valix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置22(D)其它信息/注释＝″位置22的Xaa是Cys或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置23(D)其它信息/注释＝″位置23的Xaa是Thr，Asn或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置24(D)其它信息/注释＝″位置24的Xaa是Asn，Lys，Arg，Gln，Ala，Pro或Thrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注释＝″位置1的Cys可以形成二硫键的一部分ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置22(D)其它信息/注释＝″位置22的Cys可以形成二硫键的一部分(xi)序列描述SEQ ID NO1Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Leu Glu Pro Trp Xaa12His Pro Xaa15Xaa16Xaa1715 10 15Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa2420(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度24氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1...22(D)其它信息/注释＝″位置1和22的Cys可以形成链内二硫键的一部分(xi)序列描述SEQ ID NO2Cys Ser Trp Val Asn Pro Arg Leu Glu Pro Trp Nle His Pro Gly Ser Gln His Nle Thr1 5 10 15 20Ala Cys Thr Asn(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(xi)序列描述SEQ ID NO3Phe Val Ile Pro Arg Leu Glu Pro Trp Nle His Pro Gly Ser Gln Pro Nle Thr Ala Cys1 5 10 15 20Thr Asn(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度24-27氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注释＝″位置1的Xaa是Pro，Ile，Leu，Thr，Tyr或Valix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2(D)其它信息/注释＝″位置2的Xaa是Val，Ala Cys，Leu，ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置3(D)其它信息/注释＝″位置3的Xaa是Cys，Ile，Leu，Val或Nleix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置5(D)其它信息/注释＝″位置5的Xaa是Ile，Leu，Gln，Met或Thrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置6(D)其它信息/注释＝″位置6的Xaa是Thr，Asn，Lys或Argix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置7(D)其它信息/注释＝″位置7的Xaa是Lys，Arg或Glnix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置8(D)其它信息/注释＝″位置8的Xaa是Gly或Alaix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置9(D)其它信息/注释＝″位置9的Xaa是Leu或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置10(D)其它信息/注释＝″位置10的Xaa是Gly，Ser或Alaix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11(D)其它信息/注释＝″位置11的Xaa是Ile或Glyix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12(D)其它信息/注释＝″位置12的Xaa是Ser，Phe或Tyrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置插在位置14前的Xaai(D)其它信息/注释＝″插在位置14前的Xaai是Leu，Ile，Nleix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置15(D)其它信息/注释＝″位置15的Xaa是Arg，Lys，Ser或瓜氨酸ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置19(D)其它信息/注释＝″位置19的Xaa是Arg，Lys，Ser，Gly或瓜氨酸ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置20(D)其它信息/注释＝″位置20的Xaa是Gln，Arg或Proix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置21
(D)其它信息/注释＝″位置21的Xaa是Ile或leuix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置22(D)其它信息/注释＝″位置22的Xaa是Gly，Leu，Ile，Cys或没有ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置23(D)其它信息/注释＝″位置23的Xaa是Gly或没有ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12..13(D)其它信息/注释＝″选择性插入的连接体-Z-ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2，3和22(D)其它信息/注释＝″位置2、3和22的Cys可以形成二硫键的一部分(xi)序列描述SEQ ID NO4Xaa1Xaa2Xaa3Phe Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12-Z-Tyr Xaa1Gly1 5 10 15Xaa15Lys Lys Arg Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa2320(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度27氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12..13(D)其它信息/注释＝″插入的3个残基的Gly-桥(xi)序列描述SEQ ID NO5Tyr Leu Leu Phe Leu Thr Lys Gly Leu Gly Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Nle Gly Cit Lys Lys15 10 15 20Arg Cit Gln Ile Leu Gly
25(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度28氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12..13(D)其它信息/注释＝″插入的3个残基的Gly-桥ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置27(D)其它信息/注释＝″位置27的Cys可以形成二硫键的一部分(xi)序列描述SEQ ID NO6Tyr Leu Nle Phe Leu Thr Arg Gly Leu Gly Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Nle Gly Cit Lys Lys15 10 15 20Arg Cit Gln Ile Cys Gly25(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度25-28氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注释＝″位置1的Xaa是Phe，Tyr，Trp或Argix)特征(A)名称/关键词修饰位点
(B)位置4(D)其它信息/注释＝″位置4的Xaa是Gly，Ser，Asn，Asp，Cys，Val，Thr，Ala，或Argix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置5(D)其它信息/注释＝″位置5的Xaa是Thr，Ala，Asp，Asn或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置6(D)其它信息/注释＝″位置6的Xaa是Tyr，Cys，Phe，Arg，His，Ser，Val或Leuix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置10(D)其它信息/注释＝″位置10的Xaa是Ser，Pro，Phe，Leu或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11(D)其它信息/注释＝″位置11的Xaa是Ala，Thr，Glu，Gln，Val，Pro或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12(D)其它信息/注释＝″位置12的Xaa是Glu，Lys，Gln，Asp，Asn，Tyr，Trp或Pheix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置插入在位置13后的Xaai(D)其它信息/注释＝″插入在位置13后的Xaai是Ser，Pro，Phe，Leu或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置插入在位置14前的Xaai(D)其它信息/注释＝″插入在位置14前的Xaai是Ala，Thr，Glu，Gln，Val，Pro，或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置14(D)其它信息/注释＝″位置14的Xaa是Glu，Lys，Gln，Asp或Asnix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置15(D)其它信息/注释＝″位置15的Xaa是Pro，Ser，Ala或Asnix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置16(D)其它信息/注释＝″位置16的Xaa是Val，Asn，Gly或Proix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置17(D)其它信息/注释＝″位置17的Xaa是Pro，Gln，His，Ser，Leu，Arg，Thr，Asp或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置18(D)其它信息/注释＝″位置18的Xaa是Leu Phe或Valix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置19(D)其它信息/注释＝″位置19的Xaa是Gln，Leu，Pro，His，Asp或Gluix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11..12(D)其它信息/注释＝″选择性插入的连接体-Z-ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置4(D)其它信息/注释＝″位置4和6的Cys可以形成二硫键的一部分(xi)序列描述SEQ ID NO7Xaa1Ile Leu Xaa4Xaa5Xaa6Leu Gly Arg Xaa10Xaa11-Z-Xaa12Leu13XaaiXaaiXaa141 5 10 15Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Leu Pro Pro Leu2025(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度28氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11..12(D)其它信息/注释＝″插入的[Gly]n桥，其中n＝3(xi)序列描述SEQ ID NO8Arg Ile Leu Ser Thr Tyr Leu Gly Arg Ile Ser Gly Gly Gly Trp Leu Ser Ala Glu Pro Val1 5 10 15 20Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu25SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度28氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11..12(D)其它信息/注释＝″插入的[Gly]n桥，其中n＝3(xi)序列描述SEQ ID NO9Arg Ile Leu Ser Thr Tyr Leu Gly Arg Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Leu Ser Ala Glu Pro Val1 5 10 15 20Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu25(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度22-29氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注释＝″位置1的Xaa是Lys或Argix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置5(D)其它信息/注释＝″位置5的Xaa是Phe或Leuix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置7(D)其它信息/注释＝″位置7的Xaa是Ile或Valix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置8(D)其它信息/注释＝″位置8的Xaa是Thr，Arg，Lys，Ala或Metix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置10(D)其它信息/注释＝″位置10的Xaa是Gln或Hisix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11(D)其它信息/注释＝″位置11的Xaa是Val，Leu或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置插入在位置13前的Xaai(D)其它信息/注释＝″Leu是插入在位置13前的ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置13(D)其它信息/注释＝″位置13的Xaa是Leu，Val或Thrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置14(D)其它信息/注释＝″位置14的Xaa是Arg或Citix)特征
(A)名称/关键词修饰位点(B)位置16(D)其它信息/注释＝″位置16的Xaa是Met，Val，Ile，Leu或Nleix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置17(D)其它信息/注释＝″位置17的Xaa是Thr或Aspix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置18(D)其它信息/注释＝″位置18的Xaa是Tyr，Phe或Argix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置19(D)其它信息/注释＝″位置19的Xaa是Lys或Argix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置20(D)其它信息/注释＝″位置20的Xaa是Ala，Gly，Ser，Glu或Glnix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置21(D)其它信息/注释＝″位置21的Xaa是Ala，Ser或Valix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12...(LeuiXaa13)(D)其它信息/注释＝″选择性地，连接体-Z-和/或[Arg]m桥是插入在Xaa12和(LeuiXaa13)之间的，其中m是0，1，2或3.(xi)序列描述SEQ ID NO10Xaa1Leu Val Gly Xaa5Pro Xaa7Xaa8Pro Xaa10Xaa11Pro-Z-[Arg]mLeuiXaa131 5 10Xaa14Pro Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa2115 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度26氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(C)位置12...(LeuiXaa13....)(D)其它信息/注释＝″连接体-Z-是[Gly]n(其中n是3)和[Arg]m(其中m是1)(xi)序列描述SEQ ID NO11Lys Leu Val Gly Phe Pro Val Lys Pro Gln Val Pro Gly Gly Gly Arg Leu Leu Cit Pro Nle1 5 10 15 20Thr Tyr Lys Ala Ala25(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度26氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(E)位置12...(LeuiXaa13)(F)其它信息/注释＝″连接体-Z-是[Gly]n(其中n是3)和[Arg]m(其中m是1)(xi)序列描述SEQ ID NO12Arg Leu Val Gly Phe Pro Val Lys Pro Gln Val Pro Gly Gly Gly Arg Leu Leu Arg Pro Leu1 5 10 15 20Thr Tyr Lys Ala Ala25(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度44氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型双链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型二聚体肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置SEQ ID NO3位置20和SEQ ID NO3位置20之间的二硫键(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型双链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(xi)序列描述SEQ ID NO14Phe Val Ile His Arg Leu Glu Pro Trp Leu His Pro Gly Ser Gln His Nle Thr Ala Ser Thr Asn15 10 15 20(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度23氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型双链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(xi)序列描述SEQ ID NO15Arg Leu Val Gly Phe Pro Val Lys Pro Gln Val Pro Gly Leu Leu Arg Pro Leu Thr Tyr Lys Ala1 5 10 15 20Ala(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度24氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型双链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无，tat1天然序列(xi)序列描述SEQ ID NO16Met Glu Ser Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys1 5 10 15 20Thr Asn(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度23氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型双链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无，tat2天然序列(xi)序列描述SEQ ID NO17Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5 10 15 20(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型双链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无，天然Nef序列(xi)序列描述SEQ ID NO18Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala Ala15 10 2权利要求
1.特征在于包含至少一种选自如下氨基酸序列的氨基酸序列的肽Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Leu Glu Pro Trp Xaa12His Pro Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24(SEQ ID NO1)其中链中的氨基酸可具有如下的含义肽衍生物1位的Xaa是Met、Ser、Cys或没有，2位的Xaa是Glu、Asp、Val、Ser或没有3位的Xaa是Ser、Gln、Pro、Leu、Val、Ala、Trp、Tyr或Phe，4位的Xaa是Val或Ile，5位的Xaa是Asp、Asn或Ile，6位的Xaa是Pro、His或Ala，7位的Xaa是Arg、Asn、Ser、Lys、Glu或Asp12位的Xaa是Leu、Ile或Nle15位的Xaa是Gly或Pro16位的Xaa是Ser、Asn或Ala，17位的Xaa是Gln、Lys或Thr18位的Xaa是Pro或His，19位的Xaa是Lys、Thr、Ser、Ala、Arg、Pro、Glu、Leu、Ile或Nle20位的Xaa是Thr、Ala或Ile21位的Xaa是Ala、Pro、Asp或Val22位的Xaa是Cys或Ser23位的Xaa是Thr、Asn或Ser24位的Xaa是Asn、Lys、Arg、Gln、Ala、Pro或Thr肽包含SEQ ID NO1的序列的至少6个连续氨基酸，Xaa1Xaa2Xaa3Phe Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12-Z-Tyr XaaiGly Xaa15Lys Lys Arg Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23(SEQ ID NO4)其中链中的氨基酸具有如下的含义1位的Xaa是Pro、Ile、Leu、Thr、Tyr或Val2位的Xaa是Val、Ala、Cys、Leu3位的Xaa是Cys、Ile、Leu、Val或Nle5位的Xaa是Ile、Leu、Gln、Met或Thr6位的Xaa是Thr、Asn、Lys或Arg7位的Xaa是Lys、Arg或Gln8位的Xaa是Gly或Ala9位的Xaa是Leu或Ile10位的Xaa是Gly、Ser或Ala11位的Xaa是Ile或Gly12位的Xaa是Ser、Phe或Tyr在14位前插入的Xaai是Leu、Ile、Nle15位的Xaa是Arg、Lys、Ser或瓜氨酸(Cit)19位的Xaa是Arg、Lys、Ser、Gly或Cit20位的Xaa是Gln、Arg或Pro21位的Xaa是Ile或Leu22位的Xaa是Gly、Leu、Ile、Cys或没有23位的Xaa是Gly或没有其中SEQ ID NO4的序列包含至少6个连续的氨基酸，-Z-为可选择的连接体并具有PEG、修饰的PEG和/或[Gly]n的含义，其中n＝1、2或3，Xaa1Ile Leu Xaa4Xaa5Xaa6Leu Gly Arg Xaa10Xaa11-Z-Xaa12Leu13XaaiXaaiXaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Leu Pro Pro Leu(SEQ IDNO7)其中1位的Xaa是Phe、Tyr、Trp或Arg4位的Xaa是Gly、Ser、Asn、Asp、Cys、Val、Thr、Ala或Arg5位的Xaa是Thr、Ala、Asp、Asn或Ser6位的Xaa是Tyr、Cys、Phe、Arg、His、Ser、Val或Leu10位的Xaa是Ser、Pro、Phe、Leu或Ile11位的Xaa是Ala、Thr、Glu、Gln、Val、Pro或Ser12位的Xaa是Glu、Lys、Gln、Asp、Asn、Tyr、Trp或Phe在13位后插入的Xaai是Ser、Pro、Phe、Leu或Ile在14位前插入的Xaai是Ala、Thr、Glu、Gln、Val、Pro或Ser14位的Xaa是Glu、Lys、Gln、Asp或Asn15位的Xaa是Pro、Ser、Ala或Asn16位的Xaa是Val、Asn、Gly或Pro17位的Xaa是Pro、Gln、His、Ser、Leu、Arg、Thr、Asp或Ile18位的Xaa是Leu、Phe或Val19位的Xaa是Gln、Leu、Pro、His、Asp或Glu其中SEQ ID NO7的序列由至少6个连续的氨基酸组成，连接体-Z-是可选择的并具有PEG、修饰的PEG和/或[Gly]n的含义，其中n＝1、2或3，Xaa1Leu Val Gly Xaa5 Pro Xaa7Xaa8Pro Xaa10Xaa11Pro-Z-[Arg]mXaaiXaa13Xaa14Pro Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21(SEQ ID NO10)其中1位的Xaa是Lys或Arg5位的Xaa是Phe或Leu7位的Xaa是Ile或Val8位的Xaa是Thr、Arg、Lys、Ala或Met10位的Xaa是Gln或His11位的Xaa是Val、Leu或Ile在13位前插入的Xaai是Leu14位的Xaa是Leu、Val或Thr15位的Xaa是Arg或瓜氨酸(Cit)17位的Xaa是Met、Val、Ile或Nle、Leu18位的Xaa是Thr或Asp19位的Xaa是Tyr、Phe或Arg20位的Xaa是Lys或Arg21位的Xaa是Ala、Gly、Ser、Glu或Gln22位的Xaa是Ala、Ser或Val其中SEQ ID NO10的序列由至少6个连续的氨基酸组成，连接体-Z-是可选择的并具有PEG、修饰的PEG和/或[Gly]n的含义，其中n＝1、2或3，且独立于n，[Arg]m中的m为0、1、2或3，序列的末端可为自由羧基或氨基基团、酰胺、酰基、乙酰基或它们的盐，两个或多个Cys残基可形成链内或链间二硫键的部分，即其中的p＝1-8的-S-(CH2)p-S-或-(CH2)p-桥，可选择地有一个或多个杂原子如O、N和S介入，和/或所说的肽序列被固定于固体支持体上。
2.根据权利要求1的肽，特征在于SEQ ID NO1的氨基酸序列选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO14。
3.根据权利要求1的肽，特征在于SEQ ID NO4的氨基酸序列选自SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
4.根据权利要求1的肽，特征在于SEQ ID NO7的氨基酸序列选自SEQ ID NO8和SEQ ID NO9。
5.根据权利要求1的肽，特征在于SEQ ID NO10的氨基酸序列选自SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO15。
6.特征在于包含至少一种根据权利要求1的肽的抗原。
7.根据权利要求6的抗原，特征在于它包含至少一个选自SEQID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7和SEQ ID NO10中至少一组的肽。
8.疫苗组合物，特征在于它包含根据权利要求6的抗原和药学上可接受的稀释剂，也可选择地包含佐剂、载体和/或媒介物以及额外的免疫刺激化合物。
9.根据权利要求8的疫苗组合物，特征在于它包含至少一个选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7和SEQ ID NO10中至少一组的肽。
10.根据权利要求9的疫苗组合物，特征在于它包含SEQ IDNO14和SEQ ID NO15中的肽。
11.根据权利要求8-10的疫苗组合物，特征在于肽是溶解于无菌水溶液的且可选择的免疫刺激化合物是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
12.根据权利要求8-11的疫苗组合物，特征在于该组合物包含选自单磷酰脂A(MPL)、弗氏完全的或不完全的佐剂或氢氧化铝的佐剂。
13.疫苗组合物，特征在于根据权利要求6的抗原是作为脂肽和/或脂质体制剂而制备的。
14.一种在体液样品中探测由HIV或HIV特异性肽或蛋白质诱导的抗体的方法，特征在于对所说的样品进行免疫测定，其中抗原是选自权利要求1、2、3、4和5的肽。
15.在体液样品中探测由HIV或HIV特异性肽或蛋白质诱导的抗体的免疫测定试剂盒，特征在于诊断抗原是前述权利要求1到5中任何一项的肽。
16.特征在于能够选择性地与权利要求6和7中的抗原进行反应的抗体。
全文摘要
本发明包含能够诱导HIV－1特异性免疫反应的新的修饰的肽，而不对抗细胞毒性T－细胞的活性，从而得到对抗HIV的有效的预防性和治疗性疫苗。该肽是基于HIV的Tat和Rev(即调节性蛋白质)和Nef(即辅助蛋白质)的保守区域的。描述了包含至少一种所说的肽的自由或载体结合形式的抗原、包含至少一种抗原的疫苗组合物、免疫测定试剂盒和用此类抗原探测由HIV或HIV特异性肽诱导的抗体的方法。
文档编号G01N33/569GK1458936SQ01815739
公开日2003年11月26日 申请日期2001年9月3日 优先权日2000年9月4日
发明者B·索伦森 申请人:比奥诺尔免疫有限公司