专利名称：可溶性纤维蛋白分析方法
技术领域：
本发明涉及通过在血液样品中产生特异性降解产物而分析可溶性纤维蛋白的方法。
凝血活化时，产生凝血酶，导致形成纤维蛋白沉淀，并形成可溶性纤维蛋白。
凝血酶使血纤维蛋白肽A与纤维蛋白原分子分离，导致产生纤维蛋白单体，其上在纤维蛋白原中掩蔽的“A”聚合位点暴露，引起纤维蛋白单体的“A”位点与纤维蛋白原和纤维蛋白上可接近的“a”位点相互作用。然后释放血纤维蛋白肽B，导致“B”聚合位点暴露，引起纤维蛋白单体分子的“B”位点与纤维蛋白原和纤维蛋白单体上可接近的“b”位点相互作用。
如果凝血酶的量非常高(体外测试)，全部纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体，其然后通过位点“A”和“a”以及“B”和“b”的相互作用而聚合，产生纤维蛋白凝块。然而体内产生的凝血酶较少。产生的纤维蛋白单体较少暴露，因此，一部分纤维蛋白单体聚合产生纤维蛋白(血栓)，另一部分与带有可接近的a和b位点的纤维蛋白原反应，或者与纤维蛋白原降解产物反应，形成可溶性纤维蛋白，其中纤维蛋白单体与纤维蛋白原结合。
为了研究患者中是否存在凝血活化而测定可溶性纤维蛋白，在血液特别是血浆中存在可溶性纤维蛋白，为这种活化提供了证据。
该测定是分析组成血栓的纤维蛋白的纤维蛋白溶解作用形成的D-二聚体的必要补充，这也是凝血活化过程的标志。体内凝块降解时，血浆D-二聚体数目升高。为此，如果存在血栓，并处于降解过程，则无论凝血持续或停止，D-二聚体数目应该升高；相反，如果凝血停止，则可溶性纤维蛋白数目不再升高，反之，如果凝血持续可溶性纤维蛋白则升高。
就D-二聚体数目特异性测定血浆可溶性纤维蛋白含量能1.测定患者在取样时是否存在凝血过程；2.评价凝-溶(coagulo-lytic)平衡。基础D-二聚体数目反映体内血栓降解；血浆加入溶栓剂后获得的D-二聚体数目代表基础D-二聚体以及来自循环中纤维蛋白的降解(或可溶性纤维蛋白)的D-二聚体总数。
可引用的分析纤维蛋白的最早方法包括乙醇测试(1，2，9)、或硫酸鱼精蛋白测试(3，4，5，7)。然而这些测试不是很特异(9，10)，并不很灵敏(10)。另外，大的纤维蛋白原数目(＞5g/l)干扰乙醇测试和硫酸鱼精蛋白测试获得的结果。最后，硫酸鱼精蛋白测试结果难于解释(6，8)。
另一种检测可溶性纤维蛋白的方法是基于利用Largo所述方法(11，12)，用纤维蛋白单体致敏的红细胞的血细胞凝集技术。此种测试例如Diagnostica Stago销售的FS测试。
该技术虽然简单，有时缺少灵敏性，特别适合于诊断弥散性血管内凝血。但不能检测少量的可溶性纤维蛋白(局部血栓形成，探测抗凝药效果)。
目前，分析可溶性纤维蛋白的其它技术基于利用单克隆抗体，检测纤维蛋白暴露表位、以及纤维蛋白原掩蔽表位、或纤维蛋白或纤维蛋白原降解产物(13-14)。然而，利用单克隆抗体直接分析导致可溶性纤维蛋白数目依所用商品化抗体而变化。
本发明作者提出不同于现有技术的方法，来评价患者凝-溶平衡，其特别简单、快速。这比上述血细胞凝集方法更为灵敏。与利用单克隆抗体的测试相比有优势，它利用同样的方式检测循环的纤维蛋白(可溶性)以及已经体内降解的纤维蛋白，因而提供凝-溶平衡的极准确评价。
在本发明方法中，在样品与纤维蛋白高特异性的纤溶酶原激活物(PA-Fb sp)温育期间，于产生可溶性纤维蛋白降解产物之后，测量样品中存在的可溶性纤维蛋白。可溶性纤维蛋白经PA-Fb sp降解获得的降解产物数目，与样品接触PA-Fb sp前测量的基础纤维蛋白降解产物数目之间的差异，使得可以测定样品中血浆可溶性纤维蛋白数目。
因此，本发明提供了分析生物样品中可溶性纤维蛋白的方法，其中所述样品接触具有纤维蛋白高特异性的纤溶酶原激活物(PA-Fb sp)，通过测量可溶性纤维蛋白经PA-Fb sp降解获得的降解产物数目与所述样品接触PA-Fb sp之前测定的纤维蛋白降解产物基础数目之间的差异，测量样品的可溶性纤维蛋白数目。
本发明分析生物样品中可溶性纤维蛋白的方法，包含以下步骤·分析血浆样品中含有的纤维蛋白降解产物；·在能够将样品含有的可溶性纤维蛋白降解为其降解产物的条件下，使血液样品接触具有纤维蛋白高特异性的纤溶酶原激活物(Pa-Fbsp)；·分析与Pa-Fb sp温育的样品中的纤维蛋白降解产物；·根据Pa-Fb sp温育后以及未处理样品中测定的纤维蛋白降解产物数目之间的差异，测定可溶性纤维蛋白。
选择用于分析降解产物的试剂，测量特定的降解产物。例如，使用对特定类型降解产物具有一定特异性的抗体。
生物样品优选生物液体，例如血液或血浆样品，或来自引流物(drainage)。
本发明也涉及具有纤维蛋白高特异性的纤溶酶原激活物(即，其只活化纤维蛋白中的纤溶酶原)在通过产生特异性降解产物而分析可溶性纤维蛋白的方法中的用途。还涉及进行上述方法的试剂盒。
许多纤溶酶原激活物为人所知。但是某些既降解纤维蛋白原，又降解纤维蛋白，例如链激酶和尿激酶(15)。这种化合物不适合本发明方法，因为它们引起纤维蛋白原降解，产生纤维蛋白原降解产物，其干扰纤维蛋白降解产物。
另一组纤溶酶原激活物由对降解纤维蛋白具有高特异性(与降解纤维蛋白原比较)的化合物组成。本发明方法优先利用该第二组化合物的特异性。
文献中已描述了具有该特异性(PA-Fb sp)的不同化合物。已知的实例有·组织纤溶酶原激活物(t-PA)或其衍生物，例如TNK-tPA，其是具有极高纤维蛋白特异性的tPA突变体(16)；·来自普通吸血蝙蝠(Desmodus rotundus)唾液的活化剂(bat-tPA或vPA＝吸血蝙蝠(Vampire bat)唾液纤溶酶原激活物)或其衍生物DSPA＝普通吸血蝙蝠唾液PA，FEKP＝DSPAα1和α2，EKP＝DSPA β，KP＝DSPA γ，(17)；·葡萄球菌激酶(SAK)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的多肽(18-19)或其突变体之一(20)。
本发明方法优选利用血浆样品进行。通过测定经PA-Fb sp作用产生的降解产物，测定可溶性纤维蛋白数目。如有必要，将正常血浆经微量凝血酶处理，诱导凝血活化，以产生可溶性纤维蛋白，而不引起凝块形成，以此作为阳性对照，用以确证该方法。
为了获得阳性血浆对照，血浆先与凝血酶或其它凝血活化剂温育一定时间。然后加入活化剂抑制剂，防止反应继续，从而阻断随后启动的凝血过程。例如，活化剂是凝血酶时，将水蛭素或肝素用作抑制剂。
可方便确定血浆温育时间以及凝血活化剂和阻断抑制剂的浓度，以获得凝块开始形成之前的全部凝血活化步骤。
在凝血活化剂(凝血酶)存在下温育优选温育时间2分钟、室温进行。然后加入大大过量的抑制剂，以确保阻断凝血。
·如果使用水蛭素，对于凝血酶终浓度为0.18U/ml时，其优选使用终浓度为100μg/ml。
·如果使用肝素，使用的凝血酶终浓度为0.18U/ml时，其使用终浓度为500U/ml。
本发明评价可溶性纤维蛋白，首先用PA-Fb sp降解可溶性纤维蛋白，然后测定经PA-Fb sp作用产生的特异性降解产物。
尽可能迅速地获得代表样品中存在的可溶性纤维蛋白数量的本发明方法的结果，至关重要。为此，必须确定PA-Fb sp的使用条件，以迅速降解可溶性纤维蛋白，而不伴有循环中血浆纤维蛋白原的降解“污染”，其产生降解产物，在分析中干扰来自可溶性纤维蛋白的降解产物。
选择PA-Fb sp的剂量，以引起阳性对照中纤维蛋白降解产物的最大升高，阴性对照(即，不用凝血活化剂)几乎不升高。
本发明范围内可以使用使纤维蛋白特异性降解的不同纤维蛋白溶解活化剂。PA-Fb sp优选自上述活化剂，即t-PA或其衍生物、VPA或其衍生物、以及葡萄球菌激酶或其突变体之一。优选使用t-PA或葡萄球菌激酶，更优选t-PA。
样品于37℃温育15分钟，所用葡萄球菌激酶终浓度为1-12μg/ml范围内。最终滞留浓度为10μg/ml。温育时间可以变动，其变化决定于所用PA-Fb sp的天然功能和浓度。
t-PA优选使用终浓度为1-2.5μg/ml范围内。t-PA优选使用2μg/ml浓度。
存在不同的可以特异性检测的可溶性纤维蛋白降解产物。在优选实施方案中，测定PA-Fb sp作用于可溶性纤维蛋白产生的D-二聚体数目，即测定PA-Fb sp作用于可溶性纤维蛋白产生的D-二聚体浓度(PA-Fb sp作用后的D-二聚体-PA-Fb sp作用前的基础D-二聚体)。
可以利用任何常规分析技术，例如ELISA类方法、胶乳粒凝集灵敏方法、免疫层析方法等，分析可溶性纤维蛋白在PA-Fb sp存在下降解产生的D-二聚体。可以提到的不同商品化D-二聚体分析检验的实例有，ASSERACHROM D-Di或STA LIATEST D-Di，均由DiagnosticaStago经销。然而在本发明范围内，可方便地改变ASSERACHROM D-DiELISA检验的使用条件，以缩短检验(与固定化抗体温育15分钟，与过氧化物酶标记的抗体温育15分钟)。
除DD/E片段以外，存在可以测定的其它纤维蛋白降解产物，例如YD/DY、YD/DXD复合物。
如以下实施例所阐明(见实施例3)，对于在开始治疗以前、或抗凝治疗期间、或停止抗凝治疗以后表现凝血活化的患者上，可以实行本发明方法。其不仅能评价凝血活化过程、特别是在凝血活化诊断时的变化，而且能评价抗凝血治疗的效果。
另一方面，本发明涉及分析样品中可溶性纤维蛋白剂量的试剂盒，其特征在于包含·存在利用上述方法获得的可溶性纤维蛋白的阳性对照；·由对照血浆组成的阴性对照；·PA-Fb sp，供单个样品的单份数量，或者足够供多个样品的数量；·分析D-二聚体的试剂；以及·任选的稀释样品用缓冲液，例如包含0.1％胎牛血清和Tween的pH 7.4磷酸缓冲液。
阳性和阴性血浆对照优选是冻干的。
优选PA Fb sp为tPA。
例如，利用ELISA类型方法的试剂分析D-二聚体，例如ASSERACHROM D-Di，或者利用对胶乳颗粒凝聚灵敏的测试的试剂，例如STA LIATEST D-Di，均由Diagnostica Stago经销。
以下实施例解释本发明。
实施例1选择用于获得包含可溶性纤维蛋白的阳性血浆对照的凝血酶浓度利用以下方法制备阳性血浆对照正常血浆 300μl人凝血酶(Stago ref.00896)，2u/ml 30μl室温下温育2分钟水蛭素(Knoll) 100μg/ml(终浓度)或肝素(Choay) 500u/ml(终浓度)证实·试管中没有凝块形成。
·商品化的可溶性纤维蛋白检测试验是阳性(例如，Stago的FS测试)。
可以保持表I显示的两种可能性。
表II-A管2保持。
I-B管3保持。
实施例2确定指定温育条件下使用的PA-Fb sp的量为进行本发明方法，样品中加入的活化剂的量必须使其诱导阳性对照血浆显著产生D-二聚体(如实施例1所获得的那样)，并且阴性对照血浆(不经凝血酶处理的对照)产生D-二聚体不明显。
对照血浆和阳性对照血浆(n＝21)与不同剂量的PA-Fb sp于37℃温育15分钟。温育期结束时，利用Liatest或快速ELISA(D-Di Stago)测定D-二聚体(与俘获抗体37℃温育15分钟，与显示抗体37℃温育15分钟)。
利用ELISA测试获得表I所示结果。
利用Liatest(n＝5)获得基本类似的结果。
表II通过提高t-PA和SAK的量降解可溶性纤维蛋白
选择的PA-Fb sp剂量为其诱导·未处理对照血浆(阴性对照)升高＜300ng/ml；·阳性对照血浆升高最大。
从这些结果来看，似乎使用PA-Fb sp的优选终浓度为·对于t-PA为2μg/ml在这些条件下，能够被PAI中和的t-PA剂量可以忽略不计；·对于SAK为10μg/ml(在某些患者或某些阳性对照中，低剂量SAK引起的可溶性纤维蛋白降解较差，可能因为样品中存在抗葡萄球菌激酶，抗葡萄球菌激酶似乎是葡萄球菌感染造成的)。
实施例3健康志愿者以及显示可疑的凝血活化(因D-二聚体升高)的患者获得的结果利用下述程序对两个血浆样品实行该方法血浆在t-PA(2μg/ml)或SAK(10μg/ml)存在下37℃温育15分钟。
利用上述ELISA测试分析产生的D-二聚体。
A.健康志愿者获得的结果表III
B.D-二聚体数目升高的患者获得的结果(通过快速ELISA进行实验)表IV在我们的研究中发现的实例
结论
本发明方法根据其可溶性纤维蛋白和D-二聚体血浆数目，可以将患者分为三组。下表V概括了这三组中各组的特征
如上所述，本发明方法不仅能跟踪凝血活化过程的变化，也可以评价抗凝血药物的功效，并可以确定药物再活化的凝血是否停止。
组1早期凝血活化，可溶性纤维蛋白升高，而D-二聚体不升高。
组2凝血活化中断(有效药物)、但已经形成的凝血酶继续降解(可溶性纤维蛋白正常，D-二聚体数目升高)的患者。
组3表现凝块体内降解的凝血活化的患者(可溶性纤维蛋白和D-二聚体同时升高)药物不够有效。
实施例4使用的技术概述试剂pH 7.4缓冲液纯化的人凝血酶(Stago，ref 00896)t-PA(Boehringer)抑酶肽(Aprotinin)。4℃保存溶液。
D-二聚体试剂盒。
表VI概述了所使用的方法。
表VI通过产生D-二聚体分析可溶性纤维蛋白所使用的方法
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权利要求
1.分析样品中可溶性纤维蛋白的方法，其中所述样品接触具有可溶性纤维蛋白高特异性的纤溶酶原激活物(PA-Fb sp)，通过测量可溶性纤维蛋白经PA-Fb sp降解后获得的纤维蛋白降解产物数目与所述样品接触PA-Fb sp之前测定的纤维蛋白降解产物基础数目之间的差异，测量样品中可溶性纤维蛋白数目。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述测定的纤维蛋白降解产物是D-二聚体。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述的具有可溶性纤维蛋白高亲和力的纤溶酶原激活物(PA-Fb sp)特异性针对纤维蛋白。
4.权利要求1的方法，其特征在于所述的PA-Fb sp选自tPA及其衍生物、VPA或其衍生物、以及葡萄球菌激酶或其一种突变体。
5.权利要求1的方法，其特征在于所述的PA-Fb sp是t-PA或葡萄球菌激酶。
6.权利要求1的方法，其特征在于所述的血液样品为血浆。
7.权利要求1的方法，其特征在于所述的纤维蛋白降解产物利用ELISA或LIATEST类型方法分析。
8.权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于所述的测试样品在PA-Fb sp存在下，于37℃温育15分钟。
9.权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于所述的PA-Fb sp是样品的终浓度为2μg/ml的tPA。
10.权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于所述的PA-Fb sp选自葡萄球菌激酶、bat-tPA、VPA、DSPAs、FEKP、EKP和KP。
11.权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于所述的PA-Fb sp是样品的终浓度为10μg/ml的葡萄球菌激酶。
12.权利要求1-10中任一项的方法，其特征在于相对于阳性对照确定PA-Fb sp活化产生的可溶性纤维蛋白降解产物数目。
13.权利要求11的方法，其特征在于从经过处理、体外诱导凝血活化而不形成凝块的正常血浆中制备阳性对照。
14.用于权利要求1-12中任一项的方法的阳性对照，其特征在于由经过处理、体外诱导凝血活化而不形成凝块的正常血浆组成，并且所述血浆在和应用于测试样品类似的条件下，接触具有可溶性纤维蛋白高亲和力和/或高特异性的纤溶酶原激活物。
15.具有纤维蛋白高亲和力的纤溶酶原激活物(PA-Fb sp)的用途，用于通过产生特异性降解产物而分析可溶性纤维蛋白的方法。
16.权利要求15的用途，其特征在于所述的纤维蛋白降解产物是D-二聚体。
17.权利要求15的用途，其特征在于所述的PA-Fb sp选自tPA及其衍生物、VPA或其衍生物、以及葡萄球菌激酶或其一种突变体。
18.权利要求15的用途，其特征在于所述的PA-Fb sp是tPA或葡萄球菌激酶。
19.分析样品中可溶性纤维蛋白的试剂盒，其特征在于包含·存在可溶性纤维蛋白的阳性对照；·由对照血浆组成的阴性对照；·PA-Fb sp，供单个样品的单份数量，或者足够供多个样品的数量；·分析D-二聚体的试剂；以及·任选的稀释样品用缓冲液。
20.权利要求19的试剂盒，其特征在于所述的阳性对照和阴性对照血浆为冻干形式。
21.权利要求19的试剂盒，其特征在于所述的PA-Fb sp是tPA。
22.权利要求19的试剂盒，其特征在于分析D-二聚体的试剂是ELISA、或对胶乳颗粒凝集方法灵敏的LIATEST类型测试试剂。
23.权利要求1-12中任一项的方法的用途，或者权利要求19-22中任一项的试剂盒，用于监测凝血活化过程的变化，并评价抗凝血药物的功效。
全文摘要
本发明涉及分析样品中可溶性纤维蛋白的方法，其中将所述样品接触具有可溶性纤维蛋白高特异性的纤溶酶原激活物(PA－Fb sp)，通过测量可溶性纤维蛋白经PA－Fb sp降解后获得的纤维蛋白降解产物比例与样品接触PA－Fb sp之前测定的纤维蛋白降解产物基础比例之间的差异，测量样品中可溶性纤维蛋白含量。
文档编号G01N33/86GK1458980SQ0181571
公开日2003年11月26日 申请日期2001年8月17日 优先权日2000年8月28日
发明者B·S·S·米斯哈希, J·索里亚 申请人:斯塔戈诊断公司, 公共救济事业局-巴黎医院