专利名称：微型反应杯式蛋白芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微型反应杯式蛋白芯片及制备方法。
背景技术：
生物芯片技术是九十年代中期兴起的一项新兴生物技术，因其可在一次反应中进行多种信息的平行分析，而受到众多研究者的瞩目，迅速在诸多生物学领域得到应用。生物芯片技术按检测对象分类，主要分为基因芯片和蛋白芯片两类。蛋白芯片是一种前沿的技术。它通过固定于支持介质上的多种蛋白质构成的微阵列，直接检测特定功能物质(标志性蛋白)现有的检测尿液、血清及其它体液的方法，如ELISA、放射性同位素标记、金标、荧光、化学发光、时间分辨荧光等，大多是单指标检测，信息量少，而且均具有局限性，如标记步骤复杂、仪器和试剂昂贵、操作烦琐、灵敏度低、易污染等。与传统检测方式相比，蛋白芯片技术具有以下优点1)高通量，同时可进行多人份的检测，也可单独使用。
2)高敏感度和特异性；3)操作快速、简便，适用于临床即时检测，只需一个半小时便能完成整个检测反应过程；4)所需样本量少。
但现有的生物芯片均将多种蛋白固定在一平面固相基质上，采用的材料有玻片、硅片、尼龙膜，硝酸纤维素膜等。用玻片和硅片等无机材料制备蛋白芯片需要将该载体进行化学修饰，操作复杂，而且化学修饰的均匀程度严重影响其后蛋白固定的好坏。用尼龙膜和硝酸纤维素膜等膜式有机材料制备蛋白芯片，虽然不需要进行化学修饰，操作相对简单，但由于其存在毛细渗透现象，同时其均一性不能得到保证，难免影响检测结果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测更为稳定、无样品相互污染的微型反应杯式蛋白芯片。
本发明公开的微型反应杯式蛋白芯片是一种采用有机聚合物材料制成的具有腔室结构的固相载体，各腔室相互分隔有规则地排列，并可独立使用，相互间有可折断的桥式结构相联。
本发明公开的微型反应杯式蛋白芯片由与之配套的有机聚合物材料制成的反应杯架进行支撑。
本发明公开的微型反应杯式蛋白芯片，其中所述的腔室可以是各种形状，包括圆柱体、长方体、棱柱体、圆锥体或棱锥体等。
本发明所述有机聚合物材料包括聚丙交脂(PLA)、聚已交脂(PGA)、聚己内脂(PCL)、聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)、ABS树脂、聚苯乙烯(PS)、纤维素、纤维素-聚乙烯、聚羟基丙酸脂或聚丙烯等。
下面结合附图对本发明微型反应杯式蛋白芯片的结构作进一步的描述。
图1为微型反应杯式蛋白芯片的结构示意图。其中图1-a为俯视图，图1-b为A-A剖视图。由图1可见微型反应杯上、下两端凹陷形成上、下两个腔室，分别是腔室1和腔室3。腔室1的底面2作为蛋白芯片载体，各种蛋白被有序地固定在2上，生化反应将在腔室1中进行，形成的腔室3使反应杯放置稳定，易于站立。各“反应杯”上部有“耳”式结构4，方便操作。“反应杯”间有“桥式”结构5相联，该“桥式”结构可折断。各“反应杯”具有完全分隔开的独立反应空间，可独立使用。各反应杯上有竖起的突起6，该突起与反应杯架对应。
图2为与微型反应杯式蛋白芯片配套使用的反应杯架示意图，该反应杯架可方便操作者同时对多个反应杯进行操作。反应杯架为多孔的板，孔的形状与反应杯相对应，其上开有几个到几十个孔不等，每孔内有凹槽9，该凹槽与反应杯突起6对应，可将反应杯在杯架中固定。杯架上有数字记号8和字母记号7，方便操作人员进行记录，区分待测的蛋白样本。
本发明微型反应杯式蛋白芯片，可将有机聚合物材料注塑、模压或冲压制成，这种聚合物材料无毛细渗透现象，牢固并具有韧性，与其他材料制成的平面式蛋白芯片相比具有以下优点1)从真正意义上解决了反应腔室间的互相干扰问题。目前蛋白芯片的常规做法是在一大张硝酸纤维素膜、玻璃基质或其他基质上固定多个蛋白质点阵。然后采用切割或封闭的办法使点阵分隔开，避免相互干扰。但此方法不能保证绝对的有效，很可能导致样品相互污染。反应杯式的蛋白芯片从一开始就将各点阵完全独立的固定在不同的反应杯内，因而根本解决了样品相互污染的问题。
2)使基质上蛋白固定的量更为准确。膜式基质具有吸水性，因此，液体的毛细渗透时间、蛋白吸附能力等因素将严重影响最终固定的蛋白量。同时由于膜式基质制备工艺及材质特性，其均一性存在一定问题，可能导致不同蛋白质点阵中，蛋白固定的量不同，影响检测结果。反应杯式蛋白芯片不具有吸水性，可保证不同蛋白质点阵中，固定相同的蛋白量，保证检测的稳定性。
本发微型反应杯式蛋白芯片所固定的蛋白质样品可以是抗原、抗体、受体，特别是与体内疾病性标志蛋白特异结合的蛋白，如SARS病毒相关蛋白、自身免疫疾病相关蛋白、肿瘤相关蛋白等。由于各“反应杯”内有序的固定了上述蛋白样品，因此可以达到多样品、多指标并行检测的目的。
采用本发明微型反应杯式蛋白芯片制备多指标并行检测的蛋白芯片的方法包括1)用稀释液将蛋白芯片上所要点制的蛋白质稀释到一定浓度；用芯片自动点样系统将这些蛋白质点制在反应杯里，点样密度在10-200点/cm2，点样浓度为0.01-10mg/ml，点样量0.1-40nl/点。
2)用封闭液将蛋白芯片封闭处理，以避免固相载体上未固定蛋白的区域随机吸附其它蛋白质，影响反应结果。干燥0.5-24小时。
3)将蛋白芯片冷冻干燥处理，2--8℃贮存。为了长期保持蛋白活性，采用冻干的方法来增加产品稳定性。
以下浓度单位除非特指均为w/v。
其中所述的稀释液配方为0-0.04mol/l PBS+0-0.2％BSA，0-0.04mol/l TE+0-0.2％BSA或0--80mM的CBS溶液或0-40mM Tris.HCL+0-80mM NaCl+0--5mM EDTA或0--50mM NaAc或pH为7.0-8.0的PBS(KH2PO4-Na2PO4)。
其中所述的封闭液配方为70-95％CBS+5-15％小牛血清+1-9％蔗糖。或1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN3的PBS。
采用上述蛋白芯片为主体，还可用于多指标并行检测的试剂盒，利用化学发光反应同时检测多种蛋白质在体液内的含量。该试剂盒包括1、蛋白芯片，其上固定有多种与体内疾病性标志蛋白特异结合的蛋白，如多种肿瘤标志物抗体，自免性疾病抗原，SARS蛋白抗原2、一种以一定浓度配比配制而成，并标记过氧化物酶的蛋白质或多蛋白质混合液。如辣根过氧化物酶标记的抗多种肿瘤标志物抗体混合物，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG、兔抗人IgG或鼠抗人IgG等；3、一种产生化学发光反应的化合物组成的化学组合物；4、一种蛋白芯片的洗涤液；5、标准品一种已知蛋白质的标准混合液，该组分不是必须，视被检测蛋白性质不同而选用。
图1本发明微型反应杯式蛋白芯片结构示意图1-a反应杯俯视图1-bA-A剖视2反应杯架示意图；图3用本发明蛋白芯片检测的SARS病人血样结果的示意图；图4用本发明蛋白芯片检测的干燥综合症病人血样结果的示意5用本发明蛋白芯片检测的类风湿性关节炎病人血样结果的示意6用本发明蛋白芯片检测的肝癌病人血样结果的示意图下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的范围。
具体实施例方式实施例1用于检测SARS抗体蛋白芯片的制备反应杯由聚苯乙烯(PS)注塑成型，微型反应杯形状为圆柱体，反应杯架由ABS树脂注塑成型。
1)将SARS的S蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml、N蛋白用稀释液稀释到0.06mg/ml、M蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml、3CL蛋白用稀释液稀释到0.04mg/ml、标准IgG蛋白用稀释液稀释到0.04mg/ml；用芯片自动点样系统将这些蛋白质点制在反应杯里，每种蛋白2点平行，点样密度在10-200点/cm2，点样量40nl/点。点阵排布如下
2)用封闭液将蛋白芯片封闭处理，以避免固相载体上未固定蛋白的区域随机吸附其它蛋白质，影响反应结果。干燥30-60分钟。
3)将蛋白芯片冷冻干燥处理，2-8℃贮存。为了长期保持蛋白活性，采用冻干的方法来增加产品稳定性。
以下浓度单位除非特指均为w/v。
其中所述的稀释液配方为0.01mol/l PBS+0.2％BSA或0.02mol/lTE+0.2％BSA其中所述的封闭液配方为75％CBS+8％小牛血清+7％蔗糖。
用上述蛋白芯片检测SARS患者血清，其中抗S蛋白抗体，抗M蛋白抗体，抗N蛋白抗体，抗3CL蛋白抗体均为阳性，结果如图3所示。
实施例2用于检测自身免疫疾病蛋白芯片的制备反应杯由聚苯乙烯(PS)注塑成型，微型反应杯形状为长方体，反应杯架由ABS树脂注塑成型。
1)将dsDNA蛋白用稀释液稀释到0.3mg/ml、SSA-52蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml、U1RNP蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml、SSB蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、Jo-1蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、CK19蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、Scl-70蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml、SSA-60蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、Sm蛋白用稀释液稀释到0.07mg/ml、Histone蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、ssDNA蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、RF蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、CENP-B蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、CCP蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml；用芯片自动点样系统将这些蛋白质点制在反应杯里，每种蛋白2点平行，点样密度在40点/cm2，点样量20nl/点。
点阵排布如下
2)用封闭液将蛋白芯片封闭处理，以避免固相载体上未固定蛋白的区域随机吸附其它蛋白质，影响反应结果。干燥30-60分钟。
3)将蛋白芯片冷冻干燥处理，2-8℃贮存。
以下浓度单位除非特指均为W/V。
其中所述的稀释液配方为0.01mol/l PBS+0.2％BSA或0.02mol/l TE+0.2％BSA其中所述的封闭液配方为80％CBS+10％小牛血清+5％蔗糖。
用上述蛋白芯片检测干燥综合症患者血清，其中ANA，抗SSA-60抗体，抗SSA-52抗体，抗Histones抗体，抗SSB抗体均为阳性，结果如图4所示。
实施例3以用于检测自身免疫疾病蛋白芯片为主体的检测试剂盒的使用方法试剂盒组分蛋白芯片；反应液；检测液；洗涤液。
1、浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍。
2、血清用洗涤液按1∶50稀释，吸取200μl加入反应孔内。
3、37℃温育振荡30分钟。弃去孔内的液体。
4、孔内加满稀释后的洗涤液，温育振荡5分钟，弃去洗涤液。共洗涤3次。
5、每反应杯内中加入200μl反应液。
6、同步骤3。
7、同步骤4。
8、在每个反应杯内加入150μl已混合15分钟的检测液A和B混合液，静置60秒。
9、用HD-2001系列生物芯片检测仪读取数据并进行数据分析。
用上述蛋白芯片检测类风湿性关节炎患者血清，其中抗G-IgG(类风湿因子)抗体，抗CK-19抗体均为阳性，结果如图5所示。
实施例4用于检测肿瘤标志物蛋白芯片的制备方法和试剂盒反应杯由聚苯乙烯(PS)注塑成型，微型反应杯形状为圆柱体，反应杯架由ABS树脂注塑成型。
1)将抗AFP抗体用稀释液稀释到0.25mg/ml，将抗CEA抗体用稀释液稀释到0.5mg/ml，将抗NSE抗体用稀释液稀释到0.3mg/ml，将抗CA12-5抗体用稀释液稀释到0.5mg/ml，将抗CA153抗体用稀释液稀释到0.5mg/ml，将抗CA199抗体用稀释液稀释到0.5mg/ml，将抗B-HCG抗体用稀释液稀释到0.7mg/ml，将抗HGH抗体用稀释液稀释到0.3mg/ml，将抗CA242抗体用稀释液稀释到0.7mg/ml，将抗PSA抗体用稀释液稀释到0.25mg/ml，将抗f-PSA抗体用稀释液稀释到0.3mg/ml，用芯片自动点样系统将这些蛋白质点制在反应杯里，每种蛋白2点平行，点样密度在40点/cm2，点样量20nl/点。点阵分布为
2)用封闭液将蛋白芯片封闭处理，以避免固相载体上未固定蛋白的区域随机吸附其它蛋白质，影响反应结果。干燥60分钟。
3)将蛋白芯片冷冻干燥处理，2-8℃贮存。
以下浓度单位除非特指均为W/V。
其中所述的稀释液配方为0.01mol/l PBS+0.2％BSA或0.02mol/l TE+0.2％BSA其中所述的封闭液配方为80％CBS+10％小牛血清+5％蔗糖。
以上述蛋白芯片作为主体制备用于体内肿瘤标志物含量的试剂盒。试剂盒组分包括蛋白芯片；反应液；检测液；洗涤液；标准品(一系列已知蛋白浓度肿瘤标志物的冻干品)。
用该试剂盒检测肝癌患者的血清中肿瘤标志物的含量，其中AFP和CA-125均为阳性，结果如图6所示。
权利要求
1.一种微型反应杯式蛋白芯片，其特征在于该芯片是采用有机聚合物材料制成的具有腔室结构的固相载体，各腔室相互分隔有规则地排列，并可独立使用，相互间有可折断的桥式结构相联。
2.根据权利要求1所述的微型反应杯式蛋白芯片，其特征在于其中所述的腔室形状包括圆柱体、长方体、棱柱体、圆锥体或棱锥体等。
3.根据权利要求1所述的微型反应杯式蛋白芯片，其特征在于其中所述的有机聚合物材料包括聚丙交脂、聚已交脂、聚己内脂、聚甲基丙烯酸甲脂、ABS树脂、聚苯乙烯、纤维素、纤维素-聚乙烯、聚羟基丙酸脂或聚丙烯等。
4.根据权利要求1所述的微型反应杯式蛋白芯片，其特征在于所述的微型反应杯上、下两端凹陷形成上、下两个腔室，分别是腔室(1)和腔室(3)，腔室(1)的底面(2)作为蛋白芯片载体，各反应杯上部有“耳”式结构(4)，反应杯间有桥式结构(5)相联，该“桥式”结构可折断，各反应杯上有竖起的突起(6)，与反应杯架对应。
5.根据权利要求4所述的微型反应杯式蛋白芯片，其特征在于其中所述的反应杯架为多孔的板，孔的形状与反应杯相对应，其上开有几个到几十个孔不等，每孔内有凹槽(9)，该凹槽与反应杯突起(6)对应，杯架上有数字记号(8)和字母记号(7)。
6.根据权利要求1所述的微型反应杯式蛋白芯片应用，其特征在于所述的蛋白芯片可用于体内疾病性标志蛋白特异结合的蛋白的多指标并行检测。
7.一种微型反应杯式蛋白芯片的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)将有机聚合物材料注塑、模压或冲压制成微型反应杯式蛋白芯片；2)用稀释液将蛋白芯片上所要点制的蛋白质稀释到一定浓度；用芯片自动点样系统将这些蛋白质点制在反应杯腔室(1)的底面(2)上，点样密度在10-200点/cm2，点样浓度为0.01-10mg/ml，点样量0.1-40nl/点；3)用封闭液将蛋白芯片封闭处理，干燥0.5-24小时；4)将蛋白芯片冷冻干燥处理，2-8℃贮存。
8.根据权利要求7所述的微型反应杯式蛋白芯片的制备方法，其特征在于其中所述的稀释液配方为w/v0-0.04mol/l PBS+0-0.2％BSA，0-0.04mol/l TE+0-0.2％BSA或0--80mM的CBS溶液或0-4mMTris.HCL+0-80mM NaCl+0--5mM EDTA或0--50mM NaAc或pH为7.0-8.0的PBS(KH2PO4-Na2PO4)；其中所述的封闭液配方为w/v70-95％CBS+5-15％小牛血清+1-9％蔗糖。或1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN3的PBS。
全文摘要
本发明涉及一种微型反应杯式蛋白芯片及制备方法。该微型反应杯式蛋白芯片是一种采用有机聚合物材料制成的具有腔室结构的固相载体，各腔室相互分隔有规则地排列，并可独立使用，相互间有可折断的桥式结构相联。采用本发明蛋白芯片进行蛋白质样品的多指标并行检测，可使检测更为稳定，同时无样品相互污染问题。
文档编号G01N33/50GK1580770SQ0314199
公开日2005年2月16日 申请日期2003年7月31日 优先权日2003年7月31日
发明者胡赓熙 申请人:上海数康生物科技有限公司