专利名称：一种抗炎症性变态反应的中药组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物，特别涉及用于抗炎症性变态反应和选择性环氧化酶2抑制作用的中药组合物，同时涉及该组合物的制备方法和质量控制方法。
背景技术：
在各种急性重症感染性疾病的病理生理过程中，过激的急性炎症反应对机体和主要靶器官严重损伤导致多器官功能衰竭是多数急性传染病病人死亡的主要原因之一。过激的免疫反应是免疫反应失调的重要表现，包括不同的反应类型，统称为变态反应。例如血清性休克，阿萨斯反应，迟发变态反应，和抗体依赖性细胞介导细胞毒反应(ADCC.antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity)。
肾上腺皮质激素可以抑制抗体生成，在重症感染可以起到保护靶细胞，挽救病人的生命。但是长期应用肾上腺皮质激素后发现许多毒副作用，特别是在缺乏对病原体有效控制的情况下，由于免疫抑制，抗体生成受到影响(因此部分病人可能检测抗体滴度降低)导致病原体扩散和二重感染，重要器官的出血，糖代谢和电解质紊乱等，甚至导致部分病人抢救失败和病人的死亡。医药界多年来期望在调节病毒感染引起的ADCC反应中不抑制抗体产生而能够阻断诱导免疫活性细胞对靶细胞的介质，避免直接杀伤靶细胞的作用的更好的免疫调节剂和具有抗炎，抗渗出和抗自由基损伤的新药。
环氧化酶2(Cyclooxygenases，COX2)和肿瘤坏死因子(TNF)是许多急慢性炎症性疾病病理过程的重要因素，参与ADCC反应，诱导免疫活性细胞对靶细胞的杀伤作用。因为许多原因启动体内的非特异性炎症过程主要是由COX2介导，故参与许多重要难治性慢性炎症过程(Inflammation)，和肿瘤的转移和局部侵袭。例如类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis)、系统性红斑性狼疮(SLE)、疼痛(Pain)、骨关节炎(Osteoarthritis)、大肠肿瘤(Colon tumor)、原发性老年期痴呆(Alzheimers disease)直肠癌(Colorectal tumor)，赘生物(Neoplasm)，肺癌(Lung tumor)，乳腺癌(Breast tumor)皮肤肿瘤(Skin tumor)膀胱肿瘤(Bladder tumor)和食道肿瘤(Esophagus tumor).选择性COX2抑制剂的研究已经是非类固醇抗炎药领域的重要课题，目前已经上市的有methanesulfonanalide类和Tricyclicinhibitor类，人们期望具有抗炎，抗环氧化酶2(Cyclooxygenases，COX2)和肿瘤坏死因子(TNF)抗自由基作用，而没有影响抗体产生的免疫抑制作用的纯中药制剂的出现。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种新的抗炎症性变态反应和选择性环氧化酶2抑制作用的中药组合物；本发明的另一个目的在于公开制备一种新的抗炎症性变态反应和选择性环氧化酶2抑制作用的中药组合物的方法；本发明目的还在于公开一种新的中药组合物的质量控制方法。
本发明药物组合物的原料药组成及配比如下(按重量份)亮叶杨桐 70-140重量份 钩藤 30-80重量份蝉蜕 30-80重量份 紫花地丁 30-80重量份灵芝孢子粉30-80重量份。
本药物组合物的制备方法制法将亮叶杨桐，钩藤，蝉蜕及紫花地丁分别粉碎，混合，以80-95％乙醇浸泡22-28小时，1-3次，合并浸出液，回收酒精，70-85℃干燥，收率为20-28％，与灵芝孢子粉混合，经过常规工序直接或加入药学上可接受的赋型剂制成临床可接受的剂型，如片剂、口服液体制剂、胶囊、颗粒剂、注射剂等。
本组合物制成药剂的质量控制方法包括鉴别和/或含量测定。
鉴别方法包括下列方法中的一种和/或几种a.亮叶杨桐的鉴别取样品1克，加甲醇10毫升，超声提取25-35分，过滤，水浴上挥发到5毫升，对照品石牙茶叶5克加温水10毫升，浸泡1-3小时过滤，滤液用吹风机吹干，再加甲醇如标本同法提取。按薄层层析法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上。以17-19∶5-7∶1-2氯仿-甲醇-水为展开剂，展开取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品与对照品(原植物)应有相同的斑点；b.钩藤鉴别取样品粉末1克，浓氨水浸润，以苯提取，回收溶剂，残渣用1-3∶4-7苯-乙酸乙酯溶解，供点样用；以钩藤碱，异钩藤碱，毛沟藤碱，翅果定碱作为对照品，以无水乙醇配制成0.2mg/ml溶液备用；用高效薄层板HSGF254点样，7-9∶1-2∶1-2∶0.1-0.2环己烷—乙醚—甲醇—乙酸乙酯晾干，点样，晒干后，紫外灯下观察，生物碱均显褐色暗斑；c.紫花地丁取样品2克，加甲醇20ml回流提取，25-35分；待测；以卢丁和槲皮素为对照品；在硅胶H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸18-22∶8-12∶2-4展开，用1％三氯化铝乙醇溶液喷雾，干后，紫外灯下观察有荧光斑点；d.灵芝孢子体取粉末显微镜下观察有小圆形孢子颗粒和破壁缺口，测定RNA阳性反应。
含量测定包括下列方法中的一种和/或几种a.芹菜素定量对照品溶液的制备精密称取真空干燥至恒重的芹菜素对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得；供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定；加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取25-40分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以4-6∶4-6∶1-2为流动相，检测波长为336nm，理论塔板数按芹菜素峰计算应不低于1000；b.山茶甙测定方法山茶甙对照品溶液的制备，精密称取真空干燥至恒重的山茶甙对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得，供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定，加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取25-35分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以4-6∶4-7∶1-2为流动相；检测波长为336nm，理论塔板数按山茶甙峰计算应不低于1000；c.melatonine含量测定超声波萃取法粗提Melatonin，称取2g本组合物制剂或原料药亮叶杨桐，并将其研磨成粉末状，加入20ml甲醇浸泡25-35min；然后在超声波作用下萃取25-35min；在3500-4500转/分钟速度下离心8-12min，取上清液；精滤用小孔径有机系微孔滤膜过滤样品；收集滤液，滤液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此样品以备固相萃取精提；固相萃取法浓缩精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱内所有杂质以净化固定相；然后再用10ml水建立一个固定相环境以得到Mel的合适保留；②上样将粗提好的样品直接加入到固相萃取柱上经抽真空迫使样品溶剂通过固定相；③固定相淋洗淋洗溶剂为10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脱准确量取5ml 75-85％的甲醇水溶液洗脱固相萃取柱，同时收集洗脱液，以备分析；含量测定取预处理好的样品20μl进样，通过高效液相色谱柱的分离，得到melatonin峰值代入标准melatonin二项式中计算melatonine含量，本组合物制剂不得低于0.5-2微克/克；亮叶杨桐不得低于1.5-4微克/克。
本发明组合物具有通过抑制环氧化酶2活性，抗自由基对细胞的损伤以抗炎症性变态反应作用，调节免疫过激反应，以利免疫平衡，从而防治由炎症导致的感染细胞损伤和器官功能衰竭。对各种急性发热性传染病的急救和对症治疗，对慢性免疫失调性疾病，如类风湿性关节炎，过敏性疾病有很好的效果，由于组方成份中含有黄酮类和天然松果体素，因此对和失眠，焦虑和浮肿等临床综合征也有很好的应用前景。且无毒副作用。
下面实验例用于进一步说明本发明。为了说明本发明组合物制剂(亮藤抗炎剂)临床治疗的药理学基础，以下试验设计重点是抗炎；对辐射引起自由基增加模型的抗自由基作用。
实验例一 亮藤抗炎剂对COX2抑制作用及抗自由基作用(体外实验)材料与方法鼠科巨噬细胞与单核细胞(The murine monocyte/macrophage)J774细胞系在DMEM培养液加入2mM glutamine，25mM，Hepes，penicillin(100u/ml)，streptomycin(100μg/ml)，10％foetal bovine serum(FBS)and1.2％Na pyruvate(Bio Whittaker，Europe).细胞加入到24孔板进行培养。细胞数为2.5×105Cells/ml.37℃在5％ CO2/95％ O2培养2h.立即用新鲜含有FBS培养液洗涤细胞。加入Arachidonic acid(AA)15×10-6M(Zingarelli et al.，1997)再培养30分钟。离心收集上清液以放射免疫方法测定培养液中的PGE2然后用以计算COX-1活性。(Sautebin etal.，1999).细胞洗涤后加入培养液，同时加入E.Coli lipopolysaccharide(LPS，10μg/ml)，培养24小时，诱导产生COX-2，加入Arachidonic acid(AA)15×10-6M，培养30分。以放射免疫方法测定培养液中的PGE2然后用以计算COX-2活性。
结果表明亮藤抗炎剂对COX2有显著抑制作用，并且呈现量效关系。而对COX1没有抑制作用。
药物浓度COX2抑制率％ COX1抑制率0.03μg/ml 34％ 00.3μg 40％ 1％3μg55％ 2％30μg 96％ 3％实验例二 亮藤消炎剂抗辐射诱导自由基的作用1、原理脂质过氧化物(LPO)是不饱和脂肪酸受到自由基攻击所形成的脂质过氧化物。不饱和脂肪酸主要存在于细胞膜、亚细胞结构及血小板中。是构成磷脂、脂蛋白和胆固醇的组分，如果大量LPO形成必然会造成细胞损伤，影响细胞功能。因此根据衰老的自由基学说，LPO可以随增令而增加。因此老龄动物血及主要脏器中的LPO含量可以较非老龄动物为高。如果应用亚剂量60Co照射诱发自由基也可以造成高LPO模型。为了证明本品的抗氧化作用。特进行本项试验2、材料与方法六月龄昆明小鼠雌性体重34～38g 20只，(由大连医科大学实验动物中心提供)用于造型预实验。60只雄性小鼠，体重42-45g用于正式实验预实验分2组，每组10只小鼠，造型组用60Co 450拉得照射与对照组同时采血。采血时间为照射后2，4，7，11及15天。观察血中SOD及LPO变化曲线。
正式实验动物分为5组，1组为正常对照组，2组为照射对照组；3组为亮藤消炎剂低剂量防护组每日0.17g/kg；4组为中剂量组每日1.7g/kg；5组为高剂量组每日3.4g/kg.将亮藤消炎剂每日剂量溶解在60ml水中供饮用。喂养3个月。实验组进行60Co 450拉得照射。根据预实验结果于照射后第4天LPO及SOD反应最明显。故在第4天采血及处死动物，取血清，脑匀浆进行LPO及SOD测定。
SOD及LPO测定方法按卫生部保健食品功能学评价程序和检验方法P 22及P25所提供的方法进行。
3、结果预实验小鼠经60Co 450拉得照射后4-7天血中SOD明显下降，同时LPO明显升高。15天后恢复正常。表明小鼠在450拉得照射条件下LPO及SOD可逆性变化模型成功，并提示正式实验可以在照射后4-7天采取标本为佳。(数据见表1，2；曲线见图2，3)。
正式实验在照射后第4天采取标本(血，脑匀浆)测定结果表明SOD在中高剂量组有显著差异(P＜0.05)且呈现一定的量效关系。血清中LPO在3个剂量组均有极显著降低(P＜0.01)，脑匀浆中LPO含量在低，中，高剂量组有显著差异(P＜0.05及＜0.01，见表3。)以上结果表明亮藤消炎剂具有一定的抗氧化作用。作为在自由基损伤的情况下起到一定的保护作用。
表1 小鼠经60Co 450拉得 照射后血清SOD含量变化时间表组别 照射前 后2天 47 11 15照射组(9) 198.5±10.9 171.8±11.5 185.4±11.1 184.7±8.9 184.4±13.6 179.6±8.5对照组(8) 195.6±12.9 178.7±19.6 199.6±14.4 209.3±7.9 193.1±16.2 181.7±8.9P ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＞0.05表2 小鼠经60Co 450拉得 照射后血清LPO含量变化时间表组别 照射前 后2天 47 1115照射组(9) 6.56±1.18 6.29±1.68.62±0.92 7.91±0.96 7.61±0.78 6.33±0.77对照组(8) 6.07±1.25 6.37±1.29 5.57±0.59 6.09±0.94 6.04±1.60 6.81±1.06P ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05
表3 亮藤消炎剂对60Co照射小鼠血清SOD及LPO水平的影响组别(N＝12)SOD PLPO P1对照组151.9±11.8*19.4±8.32照射组142.8±10.2 32.9±4.93低剂量154.2±4.72:3＞0.05 12.9±3.9＜0.014中剂量166.0±6.42:4＜0.05 15.4±5.9＜0.015高剂量181.5±7.02:5＜0.01 11.2±1.9＜0.01*X±SE表4 亮藤消炎剂对60Co照射小鼠脑匀浆SOD及LPO水平的影响组别 SOD P LPO P1对照组26.8±1.0* 3.5±0.42照射组24.0±1.9 4.0±0.33低剂量24.6±1.32组＞0.053.1±0.32组＜0.054中剂量28.1±1.2＞0.05 2.7±0.2＜0.015高剂量29.8±1.1＜0.05 2.8±0.3＜0.01●X±SE；N＝12下述实施例均能实现上述实验例的效果。
说明书附1 亮藤抗炎剂对COX2抑制作用。
图2 60Co照射后血清LPO变化时间曲线图3 小鼠经60Co照射后血清LPO变化时间曲线图4 60CO照射对小鼠血浆SOD含量图5 小鼠60CO照射后血浆LPO含量变化图6 小鼠60CO照射后脑内SOD含量变化图7 小鼠60CO照射后脑内LOP含量变化实施例1片剂亮叶杨桐 100克钩藤 50克蝉蜕 50克 紫花地丁 50克灵芝孢子粉50克将亮叶杨桐，钩藤，蝉蜕及紫花地丁分别粉碎，混合，以95％乙醇浸泡24小时，两次，合并浸出液，回收酒精，摄80度干燥，收率为23-26％，与灵芝孢子粉混合，称量50克加入10％糊精，常规制粒，制成颗粒100克，加入赋形剂，压片(制粒压片机一次完成)。每片重0.5克。
用法及用量每次2-4片，每天3次。
适应症各种急性发热性传染病的对症治疗，类风湿性关节炎，过敏性疾病，失眠，焦虑。
实施例2胶囊剂亮叶杨桐 120克钩藤 60克蝉蜕 70克 紫花地丁 70克灵芝孢子粉60克将亮叶杨桐，钩藤，蝉蜕及紫花地丁分别粉碎，混合，以90％乙醇浸泡26小时，两次，合并浸出液，回收酒精，摄氏85度干燥，收率为23-26％，与灵芝孢子粉混合，称量50克加入10％糊精，常规制粒，制成颗粒100克，经常规制成胶囊，每粒重0.5克。用法及用量每次2-4粒，每天3次。
实施例3颗粒剂亮叶杨桐 90克 钩藤 60克蝉蜕 40克 紫花地丁 40克灵芝孢子粉70克亮叶杨桐，钩藤，蝉蜕及紫花地丁分别粉碎，混合，以90％乙醇浸泡26小时，两次，合并浸出液，回收酒精，摄85度干燥，收率为23-26％，与灵芝孢子粉混合，以每50克所得混合物加入10％糊精，常规制粒，制成颗粒100克，经常规制成颗粒剂。
实施例4片剂的质量控制方法鉴别a.亮叶杨桐的鉴别取样品1克，加甲醇10毫升，超声提取30分，过滤，水浴上挥发到5毫升，对照品石牙茶叶5克加温水10毫升，浸泡2小时过滤，滤液用吹风机吹干，再加甲醇如标本同法提取。按薄层层析法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上。以18∶6∶1氯仿-甲醇-水为展开剂，展开取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品与对照品(原植物)应有相同的斑点；b.钩藤鉴别取样品粉末1克，浓氨水浸润，以苯提取，回收溶剂，残渣用2∶5苯-乙酸乙酯溶解，供点样用；以钩藤碱，异钩藤碱，毛沟藤碱，翅果定碱作为对照品，以无水乙醇配制成0.2mg/ml溶液备用；用高效薄层板HSGF254点样，8∶1∶1∶0.1环己烷—乙醚—甲醇—乙酸乙酯晾干，点样，晒干后，紫外灯下观察，生物碱均显褐色暗斑；c.紫花地丁取样品2克，加甲醇20ml回流提取，30分，待测，以卢丁和槲皮素为对照品；在硅胶H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸20∶10∶3展开，用1％三氯化铝乙醇溶液喷雾，干后，紫外灯下观察有荧光斑点；d.灵芝孢子体取粉末显微镜下观察有小圆形孢子颗粒和破壁缺口，测定RNA阳性反应；含量测定a.芹菜素定量对照品溶液的制备精密称取真空干燥至恒重的芹，菜素对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得；供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定；加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取30分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以5∶5∶1.5为流动相，检测波长为336nm，理论塔板数按芹菜素峰计算应不低于1000；b.山茶甙测定方法山茶甙对照品溶液的制备，精密称取真空干燥至恒重的山茶甙对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得，供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定，加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取30分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以5∶5∶1.5为流动相；检测波长为336nm，理论塔板数按山茶甙峰计算应不低于1000。c.melatonine含量测定超声波萃取法粗提Melatonin，称取2g亮藤消炎片或其原料药亮叶杨桐，并将其研磨成粉末状，加入20ml甲醇浸泡30min；然后在超声波作用下萃取30min；在4000转/分钟速度下离心10min，取上清液；精滤用￠25mm，0.20μm小孔径有机系微孔滤膜过滤样品；收集滤液，滤液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此样品以备固相萃取精提；固相萃取法浓缩精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱内所有杂质以净化固定相；然后再用10ml水建立一个固定相环境以得到Mel的合适保留；②上样将粗提好的样品直接加入到固相萃取柱上经抽真空迫使样品溶剂通过固定相；③固定相淋洗淋洗溶剂为10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脱准确量取5ml 80％的甲醇水溶液洗脱固相萃取柱，同时收集洗脱液，以备分析；含量测定取预处理好的样品20μl进样，通过高效液相色谱柱的分离，HPLC条件色谱柱250×4.6mm i.d.，5μm Hypersil ODS；流动相0.05MNa2HPO4--H3PO4缓冲液∶甲醇＝60∶40(v/v)，pH4.5，等度冲洗；流速1.0ml/min；荧光检测器Ex＝280nm，Em＝348nm；进样量20μl；得到melatonin峰值代入标准melatonin二项式中计算melatonine含量，亮藤消炎片不得低于0.5-2微克/克；亮叶杨桐不得低于2-3微克/克。
权利要求
1.炎症性变态反应的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由下述原料药制成的亮叶杨桐70-140重量份 钩藤30-80重量份蝉蜕30-80重量份紫花地丁30-80重量份 灵芝孢子粉30-80重量份。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由下述原料药制成的亮叶杨桐100重量份 钩藤50重量份蝉蜕50重量份紫花地丁50重量份灵芝孢子粉50重量份。
3.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由下述原料药制成的亮叶杨桐120重量份 钩藤60重量份蝉蜕70重量份紫花地丁70重量份灵芝孢子粉60重量份。
4.如权利要求1-3所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法为将亮叶杨桐，钩藤，蝉蜕及紫花地丁分别粉碎，混合，以80-95％乙醇浸泡22-28小时，1-3次，合并浸出液，回收酒精，70-85℃干燥，收率为20-28％，与灵芝孢子粉混合，经过常规工序直接或加入药学上可接受的赋型剂制成临床可接受的剂型，如片剂、口服液体制剂、胶囊、颗粒剂、注射剂。
5.如权利要求4所述的中药组合物的制备方法，其特征在于片剂的制备方法为将亮叶杨桐，钩藤，蝉蜕及紫花地丁分别粉碎，混合，以95％乙醇浸泡24小时，两次，合并浸出液，回收酒精，摄氏80度干燥，收率为23-26％，与灵芝孢子粉混合得混合物，加入相当所得混合物重量10％的糊精，常规制粒，加入赋形剂，压片，得片剂。
6.如权利要求1-3所述的中药组合物制剂的质量控制方法，其特征在于该方法中的鉴别方法包括如下鉴别中的一种或几种a.亮叶杨桐的鉴别取样品1克，加甲醇10毫升，超声提取25-35分，过滤，水浴上挥发到5毫升，对照品石牙茶叶5克加温水10毫升，浸泡1-3小时过滤，滤液用吹风机吹干，再加甲醇如标本同法提取，按薄层层析法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上。以17-19∶5-7∶1-2氯仿-甲醇-水为展开剂，展开取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品与对照品应有相同的斑点；b.钩藤鉴别取样品粉末1克，浓氨水浸润，以苯提取，回收溶剂，残渣用1-3∶4-7苯-乙酸乙酯溶解，供点样用；以钩藤碱，异钩藤碱，毛沟藤碱，翅果定碱作为对照品，以无水乙醇配制成0.2mg/ml溶液备用；用高效薄层板HSGF254点样，7-9∶1-2∶1-2∶0.1-0.2环己烷-乙醚-甲醇-乙酸乙酯晾干，点样，晒干后，紫外灯下观察，生物碱均显褐色暗斑；c.紫花地丁取样品2克，加甲醇20 ml回流提取，25-35分；待测；以卢丁和槲皮素为对照品；在硅胶H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸18-22∶8-12∶2-4展开，用1％三氯化铝乙醇溶液喷雾，干后，紫外灯下观察有荧光斑点；d.灵芝孢子体取粉末显微镜下观察有小圆形孢子颗粒和破壁缺口，测定RNA阳性反应。
7.如权利要求6所述的中药组合物制剂的质量控制方法，其特征在于片剂的鉴别方法包括如下鉴别中的一种或几种a.亮叶杨桐的鉴别取样品1克，加甲醇10毫升，超声提取30分，过滤，水浴上挥发到5毫升，对照品石牙茶叶5克加温水10毫升，浸泡2小时过滤，滤液用吹风机吹干，再加甲醇如标本同法提取.按薄层层析法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上.以18∶6∶1氯仿-甲醇-水为展开剂，展开取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品与对照品应有相同的斑点；b.钩藤鉴别取样品粉末1克，浓氨水浸润，以苯提取，回收溶剂，残渣用25苯-乙酸乙酯溶解，供点样用；以钩藤碱，异钩藤碱，毛沟藤碱，翅果定碱作为对照品，以无水乙醇配制成0.2mg/ml溶液备用；用高效薄层板HSGF254点样，8∶1∶1∶0.1环己烷-乙醚-甲醇-乙酸乙酯晾干，点样，晒干后，紫外灯下观察，生物碱均显褐色暗斑；c.紫花地丁取样品2克，加甲醇20ml回流提取，30分，待测，以卢丁和槲皮素为对照品；在硅胶H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸20∶10∶3展开，用1％三氯化铝乙醇溶液喷雾，干后，紫外灯下观察有荧光斑点；d.灵芝孢子体取粉末显微镜下观察有小圆形孢子颗粒和破壁缺口，测定RNA阳性反应。
8.如权利要求1-3所述的中药组合物制剂的质量控制方法，其特征在于该方法中的含量测定方法包括如下含量测定中的一种或几种a.芹菜素定量对照品溶液的制备精密称取真空干燥至恒重的芹菜素对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得；供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定；加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取25-40分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以4-6∶4-6∶1-2为流动相，检测波长为336nm，理论塔板数按芹菜素峰计算应不低于1000；b.山茶甙测定方法山茶甙对照品溶液的制备，精密称取真空干燥至恒重的山茶甙对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得，供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定，加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取25-35分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以4-6∶4-7∶1-2为流动相；检测波长为336nm，理论塔板数按山茶甙峰计算应不低于1000；c.melatonine含量测定超声波萃取法粗提Melatonin，称取2g本组合物制剂或原料药亮叶杨桐，并将其研磨成粉末状，加入20ml甲醇浸泡25-35min；然后在超声波作用下萃取25-35min；在3500-4500转/分钟速度下离心8-12min，取上清液；精滤用小孔径有机系微孔滤膜过滤样品；收集滤液，滤液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此样品以备固相萃取精提；固相萃取法浓缩精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱内所有杂质以净化固定相；然后再用10ml水建立一个固定相环境以得到Mel的合适保留；②上样将粗提好的样品直接加入到固相萃取柱上经抽真空迫使样品溶剂通过固定相；③固定相淋洗淋洗溶剂为10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脱准确量取5ml 75-85％的甲醇水溶液洗脱固相萃取柱，同时收集洗脱液，以备分析；含量测定取预处理好的样品20μl进样，通过高效液相色谱柱的分离，得到melatonin峰值代入标准melatonin二项式中计算melatonine含量，本组合物制剂不得低于0.5-2微克/克；亮叶杨桐不得低于1.5-4微克/克。
9.如权利要求8所述的中药制剂的质量控制方法，其特征在于片剂的含量测定方法包括如下含量测定中的一种或几种a.芹菜素定量对照品溶液的制备精密称取真空干燥至恒重的芹菜素对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得；供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定；加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取30分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以5∶5∶1.5为流动相，检测波长为336nm，理论塔板数按芹菜素峰计算应不低于1000；b.山茶甙测定方法山茶甙对照品溶液的制备，精密称取真空干燥至恒重的山茶甙对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得，供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定，加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取30分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以5∶5∶1.5为流动相；检测波长为336nm，理论塔板数按山茶甙峰计算应不低于1000；c.melatonine含量测定超声波萃取法粗提Melatonin，称取2g亮藤消炎片或其原料药亮叶杨桐，并将其研磨成粉末状，加入20ml甲醇浸泡30min；然后在超声波作用下萃取30min；在4000转/分钟速度下离心10min，取上清液；精滤用￠25mm，0.20μm小孔径有机系微孔滤膜过滤样品；收集滤液，滤液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此样品以备固相萃取精提；固相萃取法浓缩精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱内所有杂质以净化固定相；然后再用10ml水建立一个固定相环境以得到Mel的合适保留；②上样将粗提好的样品直接加入到固相萃取柱上经抽真空迫使样品溶剂通过固定相；③固定相淋洗淋洗溶剂为10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脱准确量取5ml 80％的甲醇水溶液洗脱固相萃取柱，同时收集洗脱液，以备分析；含量测定取预处理好的样品20μl进样，通过高效液相色谱柱的分离，HPLC条件色谱柱250×4.6mm i.d.，5μm Hypersil ODS；流动相0.05MNa2HPO4--H3PO4缓冲液∶甲醇＝60∶40(v/v)，pH4.5，等度冲洗；流速1.0ml/min；荧光检测器Ex＝280nm，Em＝348nm；进样量20μl；得到melatonin峰值代入标准melatonin二项式中计算melatonine含量，亮藤消炎片不得低于0.5-2微克/克；亮叶杨桐不得低于2-3微克/克。
10.如权利要求1-3所述的中药组合物制剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括以下步骤鉴别a.亮叶杨桐的鉴别取样品1克，加甲醇10毫升，超声提取25-35分，过滤，水浴上挥发到5毫升，对照品石牙茶叶5克加温水10毫升，浸泡1-3小时过滤，滤液用吹风机吹干，再加甲醇如标本同法提取。按薄层层析法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上。以17-19∶5-7∶1-2氯仿-甲醇-水为展开剂，展开取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品与对照品应有相同的斑点；b.钩藤鉴别取样品粉末1克，浓氨水浸润，以苯提取，回收溶剂，残渣用1-3∶4-7苯-乙酸乙酯溶解，供点样用；以钩藤碱，异钩藤碱，毛沟藤碱，翅果定碱作为对照品，以无水乙醇配制成0.2mg/ml溶液备用；用高效薄层板HSGF254点样，7-91-2∶1-2∶0.1-0.2环己烷-乙醚-甲醇-乙酸乙酯晾干，点样，晒干后，紫外灯下观察，生物碱均显褐色暗斑；c.紫花地丁取样品2克，加甲醇20ml回流提取，25-35分；待测；以卢丁和槲皮素为对照品；在硅胶H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸18-22∶8-12∶2-4展开，用1％三氯化铝乙醇溶液喷雾，干后，紫外灯下观察有荧光斑点；d.灵芝孢子体取粉末显微镜下观察有小圆形孢子颗粒和破壁缺口，测定RNA阳性反应；含量测定a.芹菜素定量对照品溶液的制备精密称取真空干燥至恒重的芹菜素对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得；供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定；加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取25-40分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以4-6∶4-6∶1-2为流动相，检测波长为336nm，理论塔板数按芹菜素峰计算应不低于1000；b.山茶甙测定方法山茶甙对照品溶液的制备，精密称取真空干燥至恒重的山茶甙对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得，供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定，加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取25-35分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以4-6∶4-7∶1-2为流动相；检测波长为336nm，理论塔板数按山茶甙峰计算应不低于1000；c.melatonine含量测定超声波萃取法粗提Melatonin，称取2g本组合物制剂或原料药亮叶杨桐，并将其研磨成粉末状，加入20ml甲醇浸泡25-35min；然后在超声波作用下萃取25-35min；在3500-4500转/分钟速度下离心8-12min，取上清液；精滤用小孔径有机系微孔滤膜过滤样品；收集滤液，滤液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此样品以备固相萃取精提；固相萃取法浓缩精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱内所有杂质以净化固定相；然后再用10ml水建立一个固定相环境以得到Mel的合适保留；②上样将粗提好的样品直接加入到固相萃取柱上经抽真空迫使样品溶剂通过固定相；③固定相淋洗淋洗溶剂为10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脱准确量取5ml 75-85％的甲醇水溶液洗脱固相萃取柱，同时收集洗脱液，以备分析；含量测定取预处理好的样品20μl进样，通过高效液相色谱柱的分离，得到melatonin峰值代入标准melatonin二项式中计算melatonine含量，本组合物制剂不得低于0.5-2微克/克；亮叶杨桐不得低于1.5-4微克/克。
11.如权利要求10所述的中药组合物制剂的质量控制方法，其特征在于用于片剂的方法包括以下步骤鉴别a.亮叶杨桐的鉴别取样品1克，加甲醇10毫升，超声提取30分，过滤，水浴上挥发到5毫升，对照品石牙茶叶5克加温水10毫升，浸泡2小时过滤，滤液用吹风机吹干，再加甲醇如标本同法提取.按薄层层析法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上.以18∶6∶1氯仿-甲醇-水为展开剂，展开取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品与对照品应有相同的斑点；b.钩藤鉴别取样品粉末1克，浓氨水浸润，以苯提取，回收溶剂，残渣用25苯-乙酸乙酯溶解，供点样用；以钩藤碱，异钩藤碱，毛沟藤碱，翅果定碱作为对照品，以无水乙醇配制成0.2mg/ml溶液备用；用高效薄层板HSGF254点样，8∶1∶1∶0.1环己烷-乙醚-甲醇-乙酸乙酯晾干，点样，晒干后，紫外灯下观察，生物碱均显褐色暗斑；c.紫花地丁取样品2克，加甲醇20ml回流提取，30分，待测，以卢丁和槲皮素为对照品；在硅胶H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸20∶10∶3展开，用1％三氯化铝乙醇溶液喷雾，干后， 紫外灯下观察有荧光斑点；d.灵芝孢子体取粉末显微镜下观察有小圆形孢子颗粒和破壁缺口，测定RNA阳性反应；含量测定a.芹菜素定量对照品溶液的制备精密称取真空干燥至恒重的芹，菜素对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得；供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定；加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取30分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以5∶5∶1.5为流动相，检测波长为336nm，理论塔板数按芹菜素峰计算应不低于1000；b.山茶甙测定方法山茶甙对照品溶液的制备，精密称取真空干燥至恒重的山茶甙对照品20mg，置5ml容量瓶中，摇匀，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶内，用甲醇稀释到刻度即得，供试品溶液的制备取待测样品0.1g精密称定，加至5ml容量瓶内，加入甲醇3ml超声波提取30分，加甲醇到刻度即可，测定方法及条件HPLC色镨条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为添充剂，甲醇∶水∶四氢呋喃以5∶5∶1.5为流动相；检测波长为336nm，理论塔板数按山茶甙峰计算应不低于1000；c.melatonine含量测定超声波萃取法粗提Melatonin，称取2g亮藤消炎片或其原料药亮叶杨桐，并将其研磨成粉末状，加入20ml甲醇浸泡30min；然后在超声波作用下萃取30min；在4000转/分钟速度下离心10min，取上清液；精滤用￠25mm，0.20μm小孔径有机系微孔滤膜过滤样品；收集滤液，滤液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此样品以备固相萃取精提；固相萃取法浓缩精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱内所有杂质以净化固定相；然后再用10ml水建立一个固定相环境以得到Mel的合适保留；②上样将粗提好的样品直接加入到固相萃取柱上经抽真空迫使样品溶剂通过固定相；③固定相淋洗淋洗溶剂为10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脱准确量取5ml 80％的甲醇水溶液洗脱固相萃取柱，同时收集洗脱液，以备分析；含量测定取预处理好的样品20μl进样，通过高效液相色谱柱的分离，HPLC条件色谱柱250×4.6mm i.d.，5μm Hypersil ODS；流动相0.05MNa2HPO4--H3PO4缓冲液∶甲醇＝60∶40(v/v)，pH4.5，等度冲洗；流速1.0ml/min；荧光检测器Ex＝280nm，Em＝348nm；进样量20μl；得到melatonin峰值代入标准melatonin二项式中计算melatonine含量，亮藤消炎片不得低于0.5-2微克/克；亮叶杨桐不得低于2-3微克/克。
12.如权利要求1-3所述的中药组合物在制备选择性抑制环氧化酶2活性和/或抗自由基对细胞的损伤的药物中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于在制备抗炎症性变态反应药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗炎症性变态反应和选择性环氧化酶2抑制作用的中药组合物及其制备方法和质量控制方法。该组合物主要由亮叶杨桐、钩藤、蝉蜕、紫花地丁、灵芝孢子粉组成。该中药组合物制备时将亮叶杨桐，钩藤，蝉蜕及紫花地丁分别粉碎，混合，以80－95％乙醇浸泡22－28小时，1－3次，合并浸出液，回收酒精，70－85℃干燥，收率为20－28％，与灵芝孢子粉混合，经过常规工序直接或加入药学上可接受的赋型剂制成临床可接受的剂型。同时本发明还提供了对该组合物进行成分鉴别、含量测定的质量控制方法。本组合物有很好抗炎症性变态反应和选择性环氧化酶2抑制作用。
文档编号G01N33/15GK1572317SQ0314853
公开日2005年2月2日 申请日期2003年7月2日 优先权日2003年6月3日
发明者霍玉书, 霍虹 申请人:霍玉书