专利名称：：多病毒复制子培养系统的制作方法背景(1)发明领域本发明总地涉及利用细胞培养物筛选抗病毒化合物的方法和组合物。更具体地，本发明涉及利用持有多亚基因组病毒复制系统的多细胞培养物评价化合物的抗病毒活性。(2)相关技术的描述引用的参考文献1.Agapov，E.V.，I.Frolov，B.D.Lindenbach，B.M.Pragai，S.Schlesinger和C.M.Rice1998.NoncytopathicSindbisvirusRNAvectorsforheterologousgeneexpressionProcNatlAcadSciUSA.9512989-94.2.Arroyo，J.I.，S.A.Apperson，C.B.Cropp，B.J.Marafino，Jr.，T.P.Monath，R.B.Tesb，R.E.Shope和M.A.Garcia-Blanco1988.EffectofhumangammainterferononyellowfevervirusinfectionAmJTropMedHyg.38647-50.3.Ballart，I.，D.Eschle，R.Cattaneo，A.Schmid，M.Metzler，J.Chan，S.Pifko-Hirst，S.A.Udem和M.A.Billeter1990.InfectiousmeaslesvirusfromclonedcDNAEmboJ.9379-84.4.Barclay，W.，Q.Li，G.Hutchinson，D.Moon，A.Richardson，N.Percy，J.W.Almond和D.J.Evans1998.EhcapsidationstudiesofpoliovirussubgenomicrepliconsJGenViroi.791725-34.5.Behrens，S.E.，C.W.Grassmann，H.J.Thiel，G.Meyers和N.Tautz1998.CharacterizationofanautonomoussubgenomicpestivirusRNArepliconJVirol.722364-72.6.Blight，K.J.，A.A.Kolykhalov和C.M.Rice2000.EfficientinitiationofHCVRNAreplicationincellcultureScience.2901972-4.7.Bredenbeek，P.J.，I.Frolov，C.M.Rice和S.Schlesinger1993.SindbisvirusexpressionvectorspackagingofRNArepliconsbyusingdefectivehelperRNAsJVirol.676439-46.8.Bronstein，I.，C.S.Martin，J.J.Fortin，C.E.Olesen和J.C.Voyta1996.ChemiluminescencesensitivedetectiontechnologyforreportergeneassaysClinChem.421542-6.9.Burgart，L.J.，R.A.Robinson，M.J.Heller，W.W.Wilke，0.K.Iakoubova和J.C.Cheville1992.MultiplexpolymerasechainreactionModPathol.5320-3.10.Camenisch，G.，M.Gruber，G.Donoho，P.VanSloun，R.H.Wenger和M.Gassmann1996.Apolyoma-basedepisomalvectorefficientlyexpressesexogenousgenesinmouseembryonicstemcellsNucleicAcidsRes.243707-13.11.Clarke，D.K.，M.S.Sidhu，J.E.Johnson和S.A.Udem2000.RescueofmumpsvirusfromcDNAJVirol.744831-8.12.Collins，P.L.，M.G.Hill，E.Camargo，H.Grosfeld，R.M.Chanock和B.R.Murphy1995.ProductionofinfectioushumanrespiratorysyncytialvirusfromclonedcDNAconfirmsanessentialroleforthetranscriptionelongationfactorfromthe5′proximalopenreadingframeoftheM2mRNAingeneexpressionandprovidesacapabilityforvaccinedevelopmentProcNatlAcadSciUSA.9211563-7.13.Collins，P.L.，M.G.Hill，J.Cristina和H.Grosfeld1996.Transcriptionelongationfactorofrespiratorysyncytialvirus，anonsegmentednegative-strandRNAvirusProc.Natl.Acad.Sci.USA.9381-85.14.Constantinescu，N.1991.[Molecularmechanismsoftheantiviraleffectofinterferon]RevRoumVirol.42191-213.15.Conzelmann，K.K.和M.Schnell1994.RescueofsyntheticgenomicRNAanalogsofrabiesvirusbyplasmid-encodedproteiusJVirol.68713-9.16.Corey，D.R.1997.PeptidenucleicacidsexpandingthescopeofnucleicacidrecognitionTrendsBiotechnol.15224-9.17.Davis，N.L.，F.B.Grieder，J.F.Smith，G.F.Greenwald，M.L.Valenski，D.C.Sellon，P.C.Charles和R.E.Johuston1994.AmoleculargeneticapproachtothestudyofVenezuelanequineencephalitisviruspathogenesisArchVirolSuppl.999-109.18.Davis，N.L.，L.V.Willis，J.F.Smith和R.E.Johnston1989.InvitrosynthesisofinfectiousvenezuelanequineencephalitisvirusRNAfromacDNAcloneanalysisofaviabledeletionmutautVirology.171189-204.19.dosSautos，C.N.，P.R.Post，R.Carvalho，Ferreira，II，C.M.Rice和R.Galler1995.Completenucleotidesequenceofyellowfevervirusvaccinestrains17DDand17D-213VirusRes.3535-41.20.Dryga，S.A.，O.A.Dryga和S.Schlesinger1997.IdentificationofmutationsinaSindbisvirusvariantabletoestablishpersistentinfectioninBHKcellstheimportanceofamutationinthensP2geneVirology.22874-83.21.Elnifro，E.M.，A.M.Ashshi，R.J.Cooper和P.E.Klapper2000.MultiplexPCRoptimizationandapplicationindiagnosticvirologyClinMicrobiolRev.13559-70.22.Elroy-Stein，O.，T.R.Fuerst和B.Moss1989.Cap-independenttranslationofmRNAconferredbyeucephalomyocarditisvirus5′sequenceimprovestheperformanceofthevacciniavirus/bacteriophageT7hybridexpressionsystemProcNatlAcadSciUSA.866126-30.23.Fan，J.，K.J.Henricksou和L.L.Savatski1998.RapidsimultaneousdiagnosisofinfectionswithrespiratorysyncytialvirusesAandB，influeuzavirusesAaudBandhumauparainfluenzavirustypes1，2和3bymultiplexquantitativereversetranscription-polymerasechainreaction-enzymehybridizatiouassay(Hexaplex)ClinInfectDis.261397-402.24.Frolov，I.，E.Agapov，T.A.Hoffinan，Jr.，B.M.Pragai，M.Lippa，S.Schlesinger和C.M.Rice1999.SelectionofRNAreplicobscapableofpersistentuoucytopathicreplicationinmammaliancellsJVirol.733854-65.25.Frolov，I.，T.A.Hoffinan，B.M.Pragai，S.A.Dryga，H.V.Huang，S.Schlesinger和C.M.Rice1996.Alphavirus-basedexpressionvectorsstrategiesandapplicationsProcNatlAcadSciUSA.9311371-7.26.Geierstanger，B.H.，M.Mrksich，P.B.Dervan和D.E.Wemmer1996.ExtendingtherecognitionsiteofdesignedminorgroovebindingmoleculesNatStructBiol.3321-4.27.Geigenmuller，U.，N.H.Ginzton和S.M.Matsui1997.Constructionofagenome-lengthcDNAcloneforhumanastrovirusserotype1andsynthesisofinfectiousRNAtranscriptsJVirol.711713-7.28.Gow，J.W.，M.M.McGill，W.M.Behan和P.O.Behan1996.LongRT-PCRamplificationoffull-lengthenterovirusgenomeBiotechniques.20582-4.29.Grentzmann，G.，J.A.Ingram，P.J.Kelly，R.F.Gesteland和J.F.Atkins1998.Adual-luciferasereportersystemforstudyingrecodingsignalsRna.4479-86.30.Grondahl，B.，W.Puppe，A.Hoppe，I.Kuhne，J.A.Weigl和H.J.Schmitt1999.Rapididentificationofninemicroorganismscausingacuterespirat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一个特定的生物化学靶，并筛选抑制该靶的候选抗病毒化合物。所述靶通常是已知或认为是病毒复制过程所必需的酶或受体。另一种供选择的途径是没有偏见的，从而无需事先考虑靶而寻找病毒复制的抑药剂。这种无偏见的途径一般包括细胞培养物的使用，因为作为专性的胞内病原体，病毒只能在细胞内复制。尽管基于细胞的筛选已成功地用于整个药物发现领域，当筛选抗病毒药时它是有问题的。这是因为它需要将感染性病毒接种到细胞中，并产生额外的感染性子代病毒。特别是，处理此类感染性材料不易适应筛选巨大化合物文库的高通量操作。因而，需要改进的用于筛选和分析抗病毒化合物的方法和组合物。尤其是，这些方法和组合物应当可用于高通量的抗病毒筛选。本文描述的发明满足所述需求。发明概述从而，本发明提供了利用亚基因组病毒复制系统评价潜在的抗病毒化合物的方法和组合物。使用这些方法和组合物允许同时针对多种病毒迅速筛选潜在的抗病毒化合物。在某些实施方案中，本发明涉及筛选候选抗病毒剂的抗病毒活性的方法。所述方法包括使用至少两个遗传上彼此截然不同的亚基因组病毒复制系统。所述方法包括制备包括含第一亚基因组病毒复制系统的细胞的第一细胞培养物，以及包括含第二亚基因组病毒复制系统的细胞的第二细胞培养物，向各细胞培养物中添加候选抗病毒剂，在足以检测候选抗病毒剂对所述亚基因组病毒复制系统的抗病毒效果的条件和时间下温育细胞培养物，并确定候选抗病毒剂对各病毒复制系统的效果。本发明相关的实施方案涉及筛选候选抗病毒剂的抗病毒活性的方法。这些方法也包括使用至少两个遗传上彼此截然不同的亚基因组病毒复制系统。这些方法包括组合包括含第一亚基因组病毒复制系统的细胞的第一细胞培养物和包括含第二亚基因组病毒复制系统的细胞的第二细胞培养物，以制备混合的细胞培养物，向混合细胞培养物中添加候选抗病毒剂，在足以检测候选抗病毒剂对所述亚基因组病毒复制系统的抗病毒效果的条件和时间下温育该混合细胞培养物，并确定候选抗病毒剂对各病毒复制系统的效果。本发明也涉及混合的细胞培养物，其包括第一细胞培养物(包括含第一亚基因组病毒复制系统的细胞)和第二细胞培养物(包括含第二亚基因组病毒复制系统的细胞)。附图的简要说明图1显示了总结证明单独培养的新培斯病毒复制子(顶部)和与丙型肝炎病毒复制子及黄热病毒复制子一起培养的新培斯病毒复制子(底部)对α-干扰素具有相似的敏感性的实验结果的两个图表。图2显示了总结证明单独培养的黄热病毒复制子(顶部)和与丙型肝炎病毒复制子及新培斯病毒复制子一起培养的黄热病毒复制子(底部)对α-干扰素具有相似的敏感性的实验结果的两个图表。图3显示了总结证明单独培养的丙型肝炎病毒复制子(顶部)和与新培斯病毒复制子以及黄热病毒复制子一起培养的丙型肝炎病毒复制子(底部)对α-干扰素具有相似的敏感性的实验结果的两个图表。发明详述本发明提供了新的用于评价候选抗病毒剂的抗病毒活性的方法和组合物。该方法包括同时评价所述药剂对一种以上亚基因组病毒复制系统的抗病毒活性。在这些方法中，每种亚基因组病毒复制系统都能够在细胞培养物的细胞中复制，从而该候选抗病毒剂的抗病毒活性通过向细胞培养物中施加所述药剂并测定该药剂对所述细胞培养物中亚基因组病毒复制系统复制的影响而评价。如本文所用，亚基因组病毒复制系统是不完整的病毒基因组，其能够复制，但缺乏一个或多个产生感染性病毒颗粒所必需的遗传元件。有两种类型的亚基因组病毒复制系统复制子和缺陷型基因组(小基因组)。病毒复制子是来源于病毒基因组的亚基因组病毒复制系统，其能够在体外培养的细胞中复制(Agapov等，1998)。它们典型地编码病毒基因组在细胞内复制和转录所需的全部顺式和反式作用的病毒元件，但缺乏一个或多个完整病毒复制所需的功能元件。所述元件可以因缺失所有或部分编码该功能的序列而缺乏，或者所述元件可以因突变如点突变致使该元件无功能而缺乏。最近几项报道描述了能够在细胞中持续复制的复制子的选择(Frolov等，1999)。因而，能够建立包含持续复制的许多病毒的病毒复制子的细胞系。表1提供了已经制备了或者无需过度实验就能够制备复制子的部分病毒列表。表1.用于抗病毒药筛选的病毒复制子感染性非致细胞病变性科病毒(俗名)克隆复制子披盖病毒科新培斯病毒是是委内瑞拉脑炎病毒是可能风疹病毒是可能小RNA病毒科脊髓灰质炎病毒是是柯萨奇病毒是可能肠道病毒是可能甲型肝炎病毒是可能黄病毒科黄热病毒是是登革热病毒是可能西尼罗河病毒可能日本脑病毒是是丙型炎病毒是是蜱传脑炎病毒(TBE)可能星状病毒科星状病毒是可能弹状病毒科狂犬病病毒是可能正粘病毒科流感病毒A是可能流感病毒B可能副粘病毒科呼吸道合胞病毒(RSV)是可能麻疹病毒是可能腮腺炎病毒是可能线状病毒科埃博拉病毒是可能马尔堡病毒可能布尼亚病毒科大地病毒(LaCrossvirus)可能加利福尼亚脑炎病毒是可能汉坦病毒可能克里米亚-刚果出血热病毒可能立夫特山谷热病毒可能沙粒病毒科拉沙热病毒可能阿根廷出血热病毒可能波利维亚出血热病毒可能呼肠孤病毒科科罗拉多蜱热嗜肝DNA病毒科乙型肝炎病毒是是乳头瘤病毒科人类乳头瘤病毒是是多瘤病毒科JC病毒是可能BK病毒是可能疱疹病毒科1型单纯疱疹病毒(HSV-1)是是2型单纯疱疹病毒(HSV-2)是可能EB病毒(EBV)是是人类巨细胞病毒(HCMV)是可能水痘-带状疱疹病毒(VZV)是可能6型人类疱疹病毒(HHV6)可能可能7型人类疱疹病毒(HHV7)可能可能8型人类疱疹病毒(HHV8)可能可能腺病毒科人类腺病毒是可能反转录病毒科1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)是可能2型人类免疫缺陷病毒(HIV-2)是可能1型人类t-细胞白血病病毒(HTLV-1)可能2型人类t-细胞白血病病毒(HTLV-2)是可能细小病毒科人类细小病毒是可能腺伴随病毒是是包含复制子的细胞培养物在抗病毒剂的发现和分析中提供了许多益处。它们允许在活细胞环境中观察抗病毒剂的效果，从而表现出抗病毒活性的任何药剂必需进入活细胞内并在其中起作用。含复制子的细胞培养物也允许利用已充分建立的细胞毒性测定立即鉴定出具有明显不期望的细胞毒性的抗病毒剂。这些细胞培养物也允许针对不能够在体外常规培养的病毒如丙型肝炎病毒(HCV)和人类乳头瘤病毒(HPV)进行基于细胞的药物发现筛选及其它研究。由于与感染性相关的病毒功能典型地不是病毒基因组复制所需的，缺乏至少一个感染性相关序列的病毒复制子比感染性病毒更为安全得多，因而更易于操作。如本文所用，感染性相关序列是病毒感染细胞所需的序列。含复制子的细胞培养物的另一个有利之处在于复制子能够被遗传操纵，以包括异源序列，例如编码报道基因如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白(MacDonald和Johnson，2000)的那些序列，其可促进对病毒基因组拷贝数的高通量自动化分析(Frolov等，1996)。开发非感染性病毒复制系统的替代途径是利用缺陷型基因组。缺陷型病毒基因组含有病毒基因组复制和转录所需的所有顺式作用元件，但缺乏一个或多个编码复制所需的反式作用因子的遗传元件。此类缺陷型基因组因此自身不能够复制(即它们并非复制子)，但如果反式(intrans)提供缺失的一个或多个因子，则它们能够被复制。含所述缺陷型基因组外加必要的反式作用因子的细胞表现出和复制子的功能相似性，在于细胞内发生部分病毒复制，且不产生感染性病毒。如同含复制性复制子的细胞培养物一样，含复制性缺陷型病毒基因组的细胞培养物代表了用于发现抗病毒药物的有用工具。缺陷型基因组的实例包括已在许多RNA和DNA病毒中观察到的在干扰缺损病毒颗粒内所含的基因组，例如分别为甲病毒(如新培斯病毒)和疱疹病毒(如1型单纯疱疹病毒)。缺陷型基因组的另一个实例是小基因组。这是一类为许多负链RNA病毒如呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病病毒、麻疹病毒等构建的人工基因组。这些病毒的小基因组是含有病毒RNA基因组复制所需的所有顺式作用序列，但缺乏完整病毒基因组的一个或全部编码区的不完整基因组。缺陷型病毒基因组的另一个实例是DNA病毒如疱疹病毒(如HSV-1)及其它DNA病毒如乳多空病毒(如猿猴病毒40(SV40))的所谓的扩增子。此类扩增子是含病毒复制起点且通过病毒所需的反式作用复制因子(起点结合蛋白、复制酶等)在细胞内复制的环状DNA分子。利用这些亚基因组病毒复制系统的筛选过程能够鉴定参与病毒基因组复制和病毒基因转录的任何生物化学路径的抑药剂。人们只需选择评价对感兴趣路径的效果的筛选操作就能够衡量候选抗病毒剂对该路径的影响。例如，为了鉴定靶向参与复制的任何路径的药剂，在由所述药剂处理后，测量复制终产物(例如复制的基因组)，例如通过进行定量PCR以定量存在的基因组的代表性部分。或者，为鉴定靶向参与复制的具体路径如RNA聚合酶翻译的药剂，人们可以测定该特定组分，例如通过抗体测定来定量RNA聚合酶。本发明提供了利用亚基因组病毒复制系统的有利之处同时针对多种病毒筛选候选抗病毒剂的方法和组合物。通过用候选抗病毒剂同时处理不止一种亚基因组病毒复制系统，能够更迅速地筛选候选药剂。这种多重处理方法也提供了同时比较候选抗病毒剂对各测试病毒的效果的能力。因而，该系统提供了有关抗病毒效果特异性的信息。该信息有助于例如评估所述效果是作用于特定的病毒靶，或是作用于细胞靶从而间接施加其对病毒的效果。另外，该方法允许鉴定表现出广泛抗病毒活性从而能够有效抵抗许多病毒的化合物。在本发明优选的实施方案中，将拥有亚基因组病毒复制系统的细胞培养物组合成为也称之为混合病毒复制子培养物(MVRC)的多亚基因组复制培养物(MSRC)。这成为可能是因为本发明可用的复制子和小基因组不从细胞到细胞扩散。因而，每个细胞可看作为自主单元，并且确定候选抗病毒剂对各病毒的效果仅仅要求各种亚基因组病毒复制系统可以彼此区分，例如通过PCR方法或能够仅扩增亚基因组复制系统之一的片段的任何其它方法区分。MSRC提供了发现抗病毒药物的筛选系统，较之于仅含一个亚基因组复制系统的培养物的使用，它提供了附加和独特的有利之处。利用MSRC筛选候选抗病毒剂的一个有利之处在于它减少了分析一大组候选药剂对多系列不同病毒的效果所需的成本和劳力。利用MSRC的另一个有利之处在于它简化了对不同病毒复制子的药效的比较，因为它确保所有复制子在相同培养条件下暴露于相同量的化合物。利用MSRC进行抗病毒筛选的另一个有利之处在于MSRC系统允许检测在单一病毒筛选系统中会被忽视的抗病毒药。在标准的单病毒筛选系统中，抗病毒剂对单个病毒的影响一般由超出阈值抑制水平的抗病毒效果来识别。在那些操作中，对筛选的病毒靶具有阈值下水平活性的抗病毒剂被放弃。通过筛选MSRC系统，能够鉴定靶向多个靶中任意一个的特异性抑药剂以及影响多种病毒的广谱药剂。因而同时收集对多种不同病毒复制子的抑制数据允许鉴定否则可能会被忽视的抗病毒剂。虽然没有描述过MSRC用于抗病毒药物发现的建立、分析和有利之处，允许在单个样品中定量多种病毒的多重病毒检测测定法是已知的，并且主要地用于诊断病毒感染。例如，已描述了用于单个样品中多种病毒的定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)介导的检测测定法(Elnifro等，2000；Grondahl等，1999；Fan等，1998；Jungkind等，1996；Burgart等，1992)。也已使用基于分子信标(beacon)的杂交探针检测单个样品中的多种病毒(Vet等，1999)。也已描述了对可由单个培养孔的内含物独立测定的不同基因报道分子的多重测定法(Parsons等，2000；Grentzmann等，1998)。尽管多重病毒检测测定法可易化对候选抗病毒剂对MSRC效果的分析，它们未预期MSRC或使之显而易见，或教导如何开发利用MSRC的抗病毒药筛选方法，因为它们未利用亚基因组病毒复制系统提供的有利之处。另外，实施本发明使用MSRC的抗病毒筛选测定也无需以前描述的多重测定法，因为可容易地设计将MSRC内容细分为多个单孔测定的方案。从而，在某些实施方案中，本发明涉及筛选候选抗病毒剂的抗病毒活性的方法。所述方法包括如下步骤(a)制备包括含第一亚基因组病毒复制系统的细胞的第一细胞培养物，以及包括含第二亚基因组病毒复制系统的细胞的第二细胞培养物；(b)向各细胞培养物中添加所述候选抗病毒剂；(c)在足以检测候选抗病毒剂对所述亚基因组病毒复制系统的抗病毒效果的条件和时间下温育细胞培养物；和(d)确定候选抗病毒剂对各病毒复制系统的效果。尽管在实施本方法时，即使含亚基因组病毒复制系统的细胞是分开的，也能由本发明实现某些有利之处，但优选培养物在步骤(b)前混合在一起成为MSRC。在那些实施方案中，MSRC可包含从2种到10种或更多种亚基因组病毒复制系统，只要能够辨别候选抗病毒剂对每种单独的亚基因组病毒复制系统的效果。也可能在一个细胞中具有不止一种亚基因组病毒复制系统(见实施例2)。因而，既然每个细胞都是拥有亚基因组病毒复制系统的独立单元，可认为每个细胞都潜在地提供了与候选抗病毒剂相关的独立信息。因此，MSRC中能够组合的不同亚基因组病毒复制系统的数目可与MSRC中细胞的数目一样高，只要存在评价各细胞中病毒复制的方法。此种方法的实例是为各亚基因组病毒复制系统提供不同的报道基因，其中各报道基因例如提供不同的荧光终产物(例如利用对各病毒RNA特异性的分子信标、或不同的荧光蛋白和/或由亚基因组病毒复制系统编码的酶的荧光产物)。然后可以通过定量与该细胞中的亚基因组病毒复制系统相关的荧光部分的荧光强度而对各细胞进行分析。任选地，例如可利用荧光激活细胞分选仪由各细胞获得此类数据。MSRC也可包括不含亚基因组病毒复制系统的对照细胞培养物，以便直接测量候选抗病毒剂对细胞本身的效果。可用于本发明的细胞是能够培养生长且能够持有亚基因组病毒复制系统的任何细胞。这将包括来自任何真核家族的细胞，包括植物、真菌、昆虫和原生生物。在多数实施方案中，细胞将来自能够持有目的病毒的相同生物体。在优选的实施方案中，细胞为动物细胞，优选为哺乳动物细胞；在最优选的实施方案中，细胞为人类细胞。可用于这些方法的细胞可以是原代细胞或者来自已建立的细胞系。当在MSRC中一起培养时，细胞必须具有相似的生长条件，从而各细胞将支持其所含有的亚基因组病毒复制系统的复制。细胞中的亚基因组病毒复制系统可以瞬时或稳定地维持在细胞中。仅仅要求所述亚基因组病毒复制系统能够复制足够长的时间，以便能够评价复制是否被候选抗病毒剂抑制。本发明的方法和组合物中所用的各亚基因组病毒复制系统必须在遗传上区别于所评价的其它亚基因组病毒复制系统。亚基因组病毒复制系统可属于不同的病毒科或相同的科，它们可以是相同的病毒但基因型不同，或者甚至是相同病毒的不同突变体。唯一的要求就是在两种细胞培养物混合到一起的实施方案中，它们必须彼此能够区分开来。在某些实施方案中，亚基因组病毒复制系统间的差异可以少至1个碱基对。此种方法可用于例如确定在一种亚基因组病毒复制系统而非其它系统中突变的特定蛋白是否是候选抗病毒剂的靶。本发明的方法可用于能够制备成亚基因组病毒复制系统的任何病毒，包括DNA病毒、RNA病毒、逆转录病毒和类病毒。也预想本发明的方法将能适用于目前不能够制备成亚基因组病毒复制系统但将来能够制备成此类系统的任何病毒。可用于本发明的病毒包括能够由其获得亚基因组病毒复制系统的任何病毒。这将包括感染来自任何真核界、门或科的生物体的细胞的病毒，所述生物体包括植物、真菌、昆虫和原生生物。在优选的实施方案中，病毒感染动物细胞，优选哺乳动物细胞；在最优选的实施方案中，病毒感染人类细胞。优选病毒的实例包括在表1中，并且包括丙型肝炎病毒、黄热病毒、呼吸道合胞病毒和新培斯病毒，如实施例中所用那样。可利用本发明的方法评价任何候选抗病毒剂，包括任何小的到大的有机或无机分子，只要药剂在添加到培养物中时可被细胞摄取。为辅助这种摄取，候选抗病毒剂可配制为包括赋形剂例如脂质体、两亲化合物等的组合物，这是本领域众所周知的。持有亚基因组病毒复制系统的细胞也可由例如聚乙二醇或用电穿孔仪器处理，以辅助候选抗病毒剂的摄取。候选抗病毒剂的非限制性实例包括核苷酸或核苷(如AZT)；寡核苷酸或多核苷酸如反义化合物，包括反义或编码抗病毒蛋白的基因的载体，包括质粒、病毒载体等。核酸模拟物例如肽核酸(参见例如Corey，1997)及其它核酸结合化合物(例如在Geierstanger等，1996中所描述的那些)也可用作为候选抗病毒剂。另外，可测试次级代谢物及其它小化学物质、生物活性氨基酸、寡肽或多肽的抗病毒活性，包括抗体及包含抗体结合部位的化合物、酶、结构蛋白、生长因子、转录因子等。在向细胞培养物中添加候选抗病毒剂之后，细胞在足以检测该药剂的抗病毒效果的条件和时间下温育。根据病毒、待测量的用以评价抗病毒活性的指标以及持有亚基因组病毒复制系统的细胞的性质，温育的最佳时间可以是从1分钟到48小时的任意长度，或更长。例如，在通过评价药剂是否与例如特定蛋白(如酶)结合而衡量候选抗病毒剂的活性的情况下，预想较短的时间周期，其中检测酶活性的抑制或候选药剂与酶的结合。当通过测定复制是否被药剂抑制而检测候选抗病毒剂的抗病毒活性时，细胞培养物必须温育足够长的时间以允许发生可检测量的复制，但并非长至细胞过度生长出培养皿。对诸如下文实施例中所用的那些病毒/细胞组合(Huh7肝细胞中的丙型肝炎病毒复制子；BHK肾成纤维细胞中的新培斯病毒复制子；Huh7细胞中的黄热病毒复制子；在上述持有新培斯病毒复制子的BHK细胞中瞬时表达的呼吸道合胞病毒小基因组)，确定20-24小时的温育为最佳。在本发明的某些方面，候选抗病毒剂的抗病毒效果通过评价发生的复制的量来测定。进行这些测定的方法的非限制性实例包括任何涉及靶扩增的DNA或RNA定量法，例如定量RT-PCR或PCR或转录介导的扩增；或者非扩增性DNA或RNA定量法，尤其是涉及信号扩增例如支链DNA的那些方法，而且也包括RNA或DNA杂交、原位杂交、分子信标等。为确定复制子拷贝数，可与RNA标准进行比较。对于任何特定的亚基因组病毒复制系统，合适的检测病毒复制的测定法将在熟练技术人员无需过度实验就能确定的能力范围之内。候选抗病毒剂的活性也可以通过靶向复制所需的特定病毒元件的方法确定。例如，如果候选抗病毒剂为与编码蛋白如病毒复制必需的酶的基因结合的反义寡核苷酸，此类测定法可能是期望的。对于这些靶向测定法，可使用定量特定蛋白的任何方法，例如免疫测定法如EIA、ELISA、免疫印迹法、免疫荧光法或免疫沉淀法；对特定病毒酶的酶活性的测定法，所述酶例如RNA或DNA聚合酶、蛋白酶、解旋酶、胸苷激酶、核糖核苷酸还原酶等；或者测定已与特定病毒蛋白融合或以其它方式插入到基因组中的报道基因的产物。这些报道蛋白的非限制性实例包括荧光素酶、绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶。在其它实施方案中，本发明涉及混合细胞培养物，包括第一细胞培养物，其包括含第一亚基因组病毒复制系统的细胞，以及第二细胞培养物，其包括含第二亚基因组病毒复制系统的细胞。这些在以前被称之为多亚基因组复制培养物或MSRC。预想可用于上文所述的筛选候选抗病毒剂的方法的任何混合细胞培养物落在这些实施方案的范围内。包括在内的是持有高到培养物中细胞数目的任何数目的亚基因组病毒复制系统的混合细胞培养物，例如持有3、4、5、10、20或更多个独立的亚基因组病毒复制系统。本发明优选的实施方案在下列实施例中描述。考虑到说明书或者如本文公开的本发明的实施，本文权利要求书范围之内的其它实施方案对本领域技术人员将是显而易见的。说明书连同实施例旨在仅作为例示性的，而本发明的范围和实质由实施例之后的权利要求书表示。实施例1.混合病毒复制子培养物中HCV/YFR/新培斯病毒的多重筛选为确定是否能在MVRC中观察到充分表征的抗病毒剂的效果，将含HCV、黄热病毒及新培斯病毒复制子的细胞系独立以及作为混合培养物在存在及不存在固定量的α-干扰素(IFNα)(一种充分表征的抗病毒剂(Constantinescu，1991))下培养。以前已证明干扰素在体内和体外都抑制HCV的复制(Podevin等，2001；Stewart和Sheaff，1969；Ryman等，2000；Saito，1990；Arroyo等，1988)。在暴露于抗病毒之后，从细胞中提取RNA，并通过qRT-PCR测定确定病毒复制子的水平。材料和方法病毒复制子培养。如以前所述建立称之为BHK/SR19/pac的新培斯病毒复制子系统和HCV复制子Ava.5细胞系(Frolov等，1999；Blight等，2000；Bredenbeek等，1993；Rice等，1987)。利用类似策略制备含黄热病毒(YFR)复制子的Huh7细胞(Rice等，1989)。以所示水平的抗病毒剂α-干扰素(Sigma，St.Louis，MO)，将细胞接种在标准12-孔微量滴定培养皿(大约5cm2)的极限必需培养基(MEM，LifeTechnologies，Gaithesburg，MD)加上10％胎牛血清中，并在标准条件下于37℃温育。每孔接种的细胞总数为200,000。当混合三种培养物时，各自的相对比例为30％含HCV复制子的细胞/40％含新培斯病毒复制子的细胞/30％含YFR复制子的细胞。qRT-PCR分析。来自细胞培养物的RNA通过商业上可获得的试剂盒(RNAeasyJ，Qiagen，Valencia，CA)制备。随后将RNA添加到由10μL5XEZ缓冲液、25μL10X醋酸锰、3μL5μM的各引物、1.5μL10mM的各dNTP、0.5μL尿嘧啶-N-糖苷酶(如所供应的)、2.0μLrTth聚合酶(2.5U/1μL)(EZrTthRNAPCR试剂盒，PerkinElmer，Boston，MA)以及5μL所供应的1∶10,000稀释度的SYBRGreenJ荧光染料(SYBRGreenJ，MolecularProbes，Eugene，OR)组成的qRT-PCR含水混合液(50μL)中。扩增HCV3′NTR序列的引物为5′-ggctccatcttagccctagtc(SEQIDNO1)和3′-agtatcggcactctctgcagt(SEQIDNO2)。YFR复制子由引物5′-ggatgcaggtaccactagaa(SEQIDNO3)和3′-cgtggtggatctggttgatt(SEQIDNO4)鉴定。新培斯病毒复制子由引物5′-gagagcgccacgttagtgta(SEQIDNO5)和3′-accttgtactgctcctcttc(SEQIDNO6)鉴定。利用BioRadI-cycler仪器，实现了对qRT-PCR反应的实时荧光监测以及阈PCR扩增循环(即观察到反应产物可检测的指数式扩增的热反应循环)的分配指定。已知浓度的RNA靶标准品稀释物的实验证实阈循环是对病毒复制子水平的准确测量。无干扰素对照的阈循环值被人为地设定为100％(即对照的100％)，而存在干扰素的数值表达为阴性对照的百分比。结果表2显示了利用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测量在混合病毒复制子培养物中测定的IFNα对三种病毒复制子的影响的实验结果。由于含各复制子的细胞均在完全相同条件下暴露于IFNα，IFNα对不同复制子的相对影响很容易确定。在这个实施例中，很显然IFNα的抑制效果在新培斯病毒中最为显著(100u/mlIFNα时＞98％抑制)，接着是HCV(100u/ml时＞91％)和YFR(100u/ml时＞81％)。这些结果与分别培养时IFNα对各病毒复制子的影响极其相似(图1、2和3)。当在混合培养物中测试利巴韦林时，即使是在测试的最高浓度(100ug/ml)，也未观察到对HCV复制的影响(表3)。不过，利巴韦林的确抑制混合培养物中新培斯病毒复制子的复制。这进一步表明抗病毒剂独立地作用于多亚基因组复制子培养物中的不同亚基因组病毒复制系统。表2.共培养的丙型肝炎病毒(HCV)、新培斯病毒和黄热病毒复制子在α-干扰素(IFNα)处理后的复制子RNA水平表3.利巴韦林和干扰素对混合病毒复制子培养物中HCV和新培斯病毒复制子复制的影响的比较实施例2.多重筛选稳定及瞬时病毒复制子混合培养物中HCV/RSV/新培斯病毒实施例1证明了测定培养于单个孔中的多种病毒复制子的可行性。实施例1中所分析的每个病毒复制子在其稳定维持的细胞系内能够自主复制。不过，存在不稳定维持的其它亚基因组病毒复制系统。这些系统要求使用通过转染或电穿孔向细胞中引入了病毒基因组的瞬时细胞培养物。一旦引入，这些瞬时复制子或小基因组将在缺乏病毒序列的细胞增殖并在培养物中占据优势之前的有限时间内表现出病毒蛋白介导的亚基因组复制。能够分析抗病毒剂对瞬时复制子或小基因组系统的影响显然有价值，因为某些病毒的稳定病毒复制子或小基因组系统尚需建立。呼吸道合胞病毒(RSV)是目前仅可获得瞬时小基因组系统的一个病毒实例。为确定含稳定和瞬时亚基因组病毒复制系统的多亚基因组复制培养物是否能够用于测定抗病毒剂的效果，将含稳定HCV复制子的细胞与已转染有瞬时RSV小基因组系统的含稳定新培斯病毒复制子的细胞混合。将该多亚基因组复制培养物进行利巴韦林和α-干扰素处理，接着对复制子/小基因组水平进行qRT-PCR分析。材料和方法病毒培养物。如以前所述建立称之为BHK/SR19/T7/pac的新培斯病毒复制子系统和HCV复制子Ava.5细胞系。RSV小基因组系统由下列5个质粒组成C2-LUCRSV小基因组cDNA(Collins等，1996)、pTM1-N、pTM1-P、pTM1-L(Grosfeld等，1995)和pM2-1。pM2-1载体通过反转录PCR(RT-PCR)由引物ccaaggatatttgtcagg(SEQIDNO7)和ggggcaaatatgtcacgaaggaatcc(SEQIDNO8)扩增RSV(病毒株2)M2-1cDNA而构建。将PCR产物克隆到pCR-Blunt(Invitrogen)中，以EcoRI切出，并克隆到T7表达载体pMH4的EcoRI位点中。pMH4表达载体通过消除NcoI位点而衍生自pTM1(Elroy-Stein等，1989；由国立卫生研究院的BernhardMoss馈赠)。为产生瞬时表达RSV小基因组C2-LUC的细胞系BHK/SR19/T7/pac/C2-LUC，将3×106BHK/SR19/T7/pac细胞接种到10cm2培养皿中。16小时后，利用转染试剂lipofectamine(GibcoInvitrogen，Carlsbad，CA)以每10cm2培养皿6μgC2-LUC、1.2μgpTM1-N、0.6μgpTM1-P，1.2μgpTM1-L和0.6μgpMH4-M2-1转染细胞。5-6小时后，用新的生长培养基替换转染培养基。转染后16小时，细胞以胰蛋白酶消化，对两种细胞系中的每种细胞计数并以8×103细胞/孔接种到96孔板中。BHK/SR19/T7/pac/C2-LUC、BHK/SR19/T7/pac和Ava.5细胞以8×103细胞/孔接种并作为对照组。所有的细胞组在存在多种浓度的利巴韦林或α-干扰素下建立。24小时后收集细胞，提取RNA。qRT-PCR分析同实施例1。结果同稳定复制子一样(HCV、YFR和新培斯病毒)，无论是在单一病毒培养物还是在混合培养物中，RSV瞬时小基因组细胞培养物对利巴韦林和α-干扰素表现出相似的敏感性(表4)。表4.利巴韦林和α-干扰素(IFN-α)对混合及单一病毒复制子培养物中RSV小基因组复制的效果的比较由此可见实现了本发明的许多有利之处并获得了其它有利之处。因为可对上述方法和组合物进行多种改变而不偏离本发明的范围，上述说明中所含的以及附图中显示的所有一切旨在理解为举例说明性的而并非限制意义的。特此将本说明书所引用的全部参考文献并入作为参考。本文对参考文献的讨论仅仅旨在概述作者的主张，而并未承认任何参考文献构成现有技术。申请人保留质疑所引用的参考文献的准确性和恰当性的权利。序列号SEQIDNO1-HCV3′NTR5′引物CB3N51ggctccatcttagccctagtcSEQIDNO2-HCV3′NTR3′引物CM38B5agtatcggcactctctgcagtSEQIDNO3-YFR5′引物2535ggatgcaggtaccactagaaSEQIDNO4-YFR3′引物2638cgtggtggatctggttgattSEQIDNO5-新培斯病毒5′引物SV1938gagagcgccacgttagtgtaSEQIDNO6-新培斯病毒3′引物SV2044accttgtactgctcctcttcSEQIDNO7-RSVM2-1克隆引物1ccaaggatatttgtcaggSEQIDNO8-RSVM2-1克隆引物2ggggcaaatatgtcacgaaggaatccSEQIDNO9-荧光素酶5′引物catcacgtacgcggaatactSEQIDNO10-荧光素酶3′引物cgcaactgcaactccgataa权利要求1.筛选候选抗病毒剂的抗病毒活性的方法，包括(a)制备包括含第一亚基因组病毒复制系统的细胞的第一细胞培养物，以及包括含第二亚基因组病毒复制系统的细胞的第二细胞培养物；(b)向各细胞培养物中添加所述候选抗病毒剂；(c)在足以检测候选抗病毒剂对所述亚基因组病毒复制系统的抗病毒效果的条件和时间下温育细胞培养物；且(d)确定候选抗病毒剂对各病毒复制系统的效果，其中第一亚基因组病毒复制系统在遗传上区别于第二亚基因组病毒复制系统。2.权利要求1的方法，其中将第一和第二细胞培养物在步骤(b)前组合。3.权利要求1的方法，进一步包括不含亚基因组病毒复制系统的细胞培养物。4.权利要求1的方法，其中至少一个亚基因组病毒复制系统是复制子。5.权利要求1的方法，其中至少一个亚基因组病毒复制系统是缺陷型基因组。6.权利要求1的方法，其中第一和第二细胞培养物中的细胞是哺乳动物细胞，且第一和第二亚基因组病毒复制系统来自哺乳动物病毒。7.权利要求6的方法，其中哺乳动物细胞是人类细胞，且哺乳动物病毒是人类病毒。8.权利要求7的方法，其中人类病毒选自丙型肝炎病毒、黄热病毒、呼吸道合胞病毒、新培斯病毒、脊髓灰质炎病毒、日本脑炎病毒、乙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、1型单纯疱疹病毒、EB病毒、腺伴随病毒、委内瑞拉脑炎病毒、风疹病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒、甲型肝炎病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒、星状病毒、狂犬病病毒、流感病毒A、流感病毒B、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、大地病毒、加利福尼亚脑炎病毒、汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、立夫特山谷热病毒、拉沙热病毒、阿根廷出血热病毒、波利维亚出血热病毒、科罗拉多蜱热病毒、JC病毒、BK病毒、2型单纯疱疹病毒、人类巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、6型人类单纯疱疹病毒、7型人类疱疹病毒、8型人类疱疹病毒、人类腺病毒、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、HTLV-2和人类细小病毒。9.权利要求7的方法，其中人类病毒选自丙型肝炎病毒、黄热病毒、呼吸道合胞病毒、新培斯病毒、脊髓灰质炎病毒、日本脑炎病毒、乙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、1型单纯疱疹病毒、EB病毒和腺伴随病毒。10.权利要求7的方法，其中人类病毒选自丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、黄热病毒和新培斯病毒。11.权利要求1的方法，其中候选抗病毒剂是不包括寡肽或寡核苷酸的化学物质。12.权利要求1的方法，其中候选抗病毒剂包括寡肽或寡核苷酸。13.权利要求1的方法，其中候选抗病毒剂包括寡核苷酸或多核苷酸。14.权利要求1的方法，其中候选抗病毒剂包括蛋白。15.权利要求14的方法，其中候选抗病毒剂包括抗体结合结构域。16.权利要求1的方法，其中候选抗病毒剂对至少一种亚基因组病毒复制系统的影响通过定量所述至少一种亚基因组病毒复制系统的核酸的一部分而测定。17.权利要求16的方法，其中定量通过核酸扩增实施。18.权利要求17的方法，其中核酸扩增通过RT-PCR进行。19.权利要求1的方法，其中抗病毒剂对至少一种亚基因组病毒复制系统的影响通过定量报道基因或者随其它病毒蛋白一起转录的融合蛋白的可测定部分而测定。20.权利要求1的方法，其中抗病毒剂对至少一种亚基因组病毒复制系统的影响通过定量病毒蛋白测定。21.权利要求20的方法，其中病毒蛋白是酶，且定量通过测定该酶的活性进行。22.权利要求1的方法，其中至少一种细胞培养物包括其中亚基因组病毒复制系统稳定维持的细胞。23.权利要求1的方法，其中至少一种细胞培养物包括其中亚基因组病毒复制系统不稳定维持的细胞。24.利要求1的方法，其中至少一种细胞培养物包括原代细胞。25.利要求1的方法，其中细胞培养物温育至少20小时。26.权利要求1的方法，进一步包括至少第三细胞培养物，其包括含第三亚基因组病毒复制系统的细胞，其中所述第三细胞培养物也经历步骤(a)、(b)、(c)和(d)，其中各亚基因组病毒复制系统在遗传上区别于每一个其它亚基因组病毒复制系统。27.权利要求26的方法，其中所有包含亚基因组病毒复制系统的细胞培养物在步骤(b)前组合。28.筛选候选抗病毒剂的抗病毒活性的方法，包括(a)将包括含第一亚基因组病毒复制系统的细胞的第一细胞培养物与包括含第二亚基因组病毒复制系统的细胞的第二细胞培养物组合，制备混合细胞培养物；(b)向混合细胞培养物中添加候选抗病毒剂；(c)在足以检测候选抗病毒剂对所述亚基因组病毒复制系统的抗病毒效果的条件和时间下温育所述混合细胞培养物；和(d)确定候选抗病毒剂对各病毒复制系统的效果，其中第一亚基因组复制系统在遗传上不同于第二亚基因组病毒复制系统。29.权利要求28的方法，其中至少一个亚基因组病毒复制系统是复制子。30.权利要求28的方法，其中至少一个亚基因组病毒复制系统是缺陷型基因组。31.权利要求28的方法，其中混合细胞培养物的所有细胞是相同的细胞系。32.权利要求28的方法，其中混合细胞培养物的细胞包括不止一种细胞系。33.权利要求28的方法，其中混合细胞培养物中的所有细胞是哺乳动物细胞，并且所有的亚基因组病毒复制系统来自于哺乳动物病毒。34.权利要求33的方法，其中哺乳动物细胞是人类细胞，并且哺乳动物病毒为人类病毒。35.权利要求34的方法，其中所述人类病毒选自丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、黄热病毒、新培斯病毒、脊髓灰质炎病毒、日本脑炎病毒、乙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、1型单纯疱疹病毒、EB病毒、腺伴随病毒、委内瑞拉脑炎病毒、风疹病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒、甲型肝炎病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒、星状病毒、狂犬病病毒、流感病毒A、流感病毒B、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、大地病毒、加利福尼亚脑炎病毒、汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、立夫特山谷热病毒、拉沙热病毒、阿根廷出血热病毒、波利维亚出血热病毒、科罗拉多蜱热病毒、JC病毒、BK病毒、2型单纯疱疹病毒、人类巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、6型人类单纯疱疹病毒、7型人类疱疹病毒、8型人类疱疹病毒、人类腺病毒、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、HTLV-2和人类细小病毒。36.权利要求34的方法，其中人类病毒选自丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、黄热病毒、新培斯病毒、脊髓灰质炎病毒、日本脑炎病毒、乙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、1型单纯疱疹病毒、EB病毒和腺伴随病毒。37.权利要求34的方法，其中人类病毒选自丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、黄热病毒和新培斯病毒。38.权利要求28的方法，其中候选抗病毒剂是不包括寡肽或寡核苷酸的化学物质。39.权利要求28的方法，其中抗病毒剂包括寡肽或寡核苷酸。40.权利要求28的方法，其中候选抗病毒剂包括寡核苷酸或多核苷酸。41.权利要求28的方法，其中候选抗病毒剂包括蛋白。42.权利要求41的方法，其中候选抗病毒剂包括抗体结合结构域。43.权利要求28的方法，其中候选抗病毒剂对至少一种亚基因组病毒复制系统的影响通过定量所述至少一种亚基因组病毒复制系统的核酸的一部分而测定。44.权利要求43的方法，其中定量通过核酸扩增实施。45.权利要求44的方法，其中核酸扩增通过RT-PCR进行。46.权利要求28的方法，其中抗病毒剂对至少一种亚基因组病毒复制系统的影响通过定量报道基因或者随其它病毒蛋白一起转录的融合蛋白的可测定部分而测定。47.权利要求28的方法，其中抗病毒剂对至少一种亚基因组病毒复制系统的影响通过定量病毒蛋白测定。48.权利要求47的方法，其中病毒蛋白是酶，且定量通过测定该酶的活性进行。49.权利要求28的方法，其中混合细胞培养物包括其中亚基因组病毒复制系统稳定维持的细胞。50.权利要求28的方法，其中混合细胞培养物包括其中亚基因组病毒复制系统不稳定维持的细胞。51.权利要求28的方法，其中混合细胞培养物包括原代细胞。52.权利要求28的方法，其中混合细胞培养物温育至少20小时。53.权利要求28的方法，其中混合细胞培养物进一步包括第三细胞培养物，其包括含第三亚基因组病毒复制系统的细胞。54.权利要求53的方法，其中混合细胞培养物进一步包括第四细胞培养物，其包括含第四亚基因组病毒复制系统的细胞。55.混合细胞培养物，包括第一细胞培养物，其包括含第一亚基因组病毒复制系统的细胞，以及第二细胞培养物，其包括含第二亚基因组病毒复制系统的细胞。56.权利要求55的混合细胞培养物，其中至少一种亚基因组病毒复制系统是复制子。57.权利要求55的混合细胞培养物，其中至少一种亚基因组病毒复制系统是缺陷型基因组。58.权利要求55的混合细胞培养物，其中混合细胞培养物的所有细胞是相同的细胞系。59.权利要求55的混合细胞培养物，其中混合细胞培养物的细胞包括不止一种细胞系。60.权利要求55的混合细胞培养物，其中混合细胞培养物中的所有细胞是哺乳动物细胞，并且所有的亚基因组病毒复制系统来自于哺乳动物病毒。61.权利要求60的混合细胞培养物，其中哺乳动物细胞是人类细胞，并且哺乳动物病毒为人类病毒。62.权利要求61的混合细胞培养物，其中人类病毒选自丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、黄热病毒、新培斯病毒、脊髓灰质炎病毒、日本脑炎病毒、乙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、1型单纯疱疹病毒、EB病毒、腺伴随病毒、委内瑞拉脑炎病毒、风疹病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒、甲型肝炎病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒、星状病毒、狂犬病病毒、流感病毒A、流感病毒B、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、大地病毒、加利福尼亚脑炎病毒、汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、立夫特山谷热病毒、拉沙热病毒、阿根廷出血热病毒、波利维亚出血热病毒、科罗拉多蜱热病毒、JC病毒、BK病毒、2型单纯疱疹病毒、人类巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、6型人类单纯疱疹病毒、7型人类疱疹病毒、8型人类疱疹病毒、人类腺病毒、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、HTLV-2和人类细小病毒。63.权利要求61的混合细胞培养物，其中人类病毒选自丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、黄热病毒、新培斯病毒、脊髓灰质炎病毒、日本脑炎病毒、乙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、1型单纯疱疹病毒、EB病毒和腺伴随病毒。64.权利要求61的混合细胞培养物，其中人类病毒选自丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、黄热病毒和新培斯病毒。65.权利要求55的混合细胞培养物，其中混合细胞培养物包括其中亚基因组病毒复制系统稳定维持的细胞。66.权利要求55的混合细胞培养物，其中混合细胞培养物包括其中亚基因组病毒复制系统不稳定维持的细胞。67.权利要求55的混合细胞培养物，其中混合细胞培养物包括原代细胞。68.权利要求55的混合细胞培养物，进一步包括第三细胞培养物，其包括含第三亚基因组病毒复制系统的细胞。69.权利要求68的混合细胞培养物，其中混合细胞培养物进一步包括第四细胞培养物，其包括含第四亚基因组病毒复制系统的细胞。全文摘要本发明提供了利用含亚基因组病毒复制系统例如复制子和小基因组的细胞筛选候选抗病毒剂的方法和组合物。所述方法涉及同时测定不止一个亚基因组病毒复制系统。也提供了可用于这些方法的组合物。文档编号G01N33/15GK1639358SQ03804897公开日2005年7月13日申请日期2003年1月28日优先权日2002年1月29日发明者J·德亚尔,C·P·罗马诺,P·D·奥利沃,R·M·罗斯申请人:阿帕斯有限责任公司