双生病毒复制抑制剂的制作方法

专利名称：双生病毒复制抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及对植物病毒有效的防除感染的手段。更具体地说，涉及针对植物病毒双生病毒的复制抑制剂以及对双生病毒感染具有抗性的植物等。
背景技术：
锌指与螺旋-转角-螺旋基序、亮氨酸拉链基序同为DNA结合基序的一种，其是在氨基末端一侧具有2个半胱氨酸和在羧基末端一侧具有2个组氨酸，在这些残基上配位有锌(Zn)而成的立体结构。锌指对DNA具有非常强的结合力，因此有人利用该基序提出了与DNA牢固结合的人工DNA结合蛋白(以下在本说明书中有时称为“AZP”)，并报道了使用识别密码表(Nondegenerate Recognition Code Table (非简并识别密码表))设计的AZP,其 可识别特定的碱基序列(日本特表2004-519211号公报biochemistry，41，7074-7081页，2002)。一个锌指基序可识别3bp或4bp并结合，通过用肽接头连接锌指来调节希望特异性结合的碱基序列的长度。锌指基序的第4号的识别碱基序列是反义链，与下一个锌指基序的第I号的识别喊基序列重置，因此，N个锋指基序识别3N+lbp的喊基序列并结合(参照

图1)。有报道称，使用该AZP可实现对植物DNA病毒感染的防除(J. Virology，79，2614-2619页，2005)。该出版物中报道了在拟南芥中AZP防除植物DNA病毒甜菜严重曲顶病毒(Beet Severe Curly Top Virus) (BSCTV)感染的效果，该方法采用通过AZP来抑制病毒复制起始所需的复制蛋白(Itep)与复制起点上的Rep结合位点(同向重复序列)结合的手段，是基于复制起点的同向重复序列设计具有比R印高的DNA结合能力的AZP来抑制病毒复制的方法。但是，在用AZP阻断R印的同向重复序列的该方法中，复制起点具有病毒特有的碱基序列，因此，为了与各种植物病毒对应，存在必须使用分别不同的AZP的问题。从上述角度出发，人们希望提供用单一的AZP实现对多种植物病毒感染的防除效果的手段。番爺黄化曲叶病是感染番爺的病毒病，通过烟粉風传播的番爺黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus TYLCV)感染而发病。番爺黄化曲叶病一旦发病，新叶自叶缘褪色、黄化，呈现曲叶症状，然后叶萎缩，植株全体矮化，生长停止。番茄黄化曲叶病在地中海沿岸、非洲、中近东、亚洲、中南美等地带来严重的灾害。TYLCV存在很多分离株，目前为止在日本国内报道的有TYLCV以色列株(急性型长崎株和土佐株)以及TYLCV温和株(温和型静冈株和爱知株)等。TYLCV属于双生病毒科(Geminiviridae)，双生病毒是感染植物、具有I个或2个单链环状DNA的病毒的总称。双生病毒包括马铃薯黄色花叶病毒(Potato yellow mosaicvirus)和菜豆金色花叶病毒(Bean golden mosaic virus)等各种植物病毒,期待的是,如果可以提供以双生病毒中高度保守的碱基序列为靶标的病毒复制抑制手段，则不仅限于TYLCV感染，也可有效地防除多种植物病毒感染。关于具有双生病毒持续抗性的转化植物的制作方法，已知有国际公开W02004/101798中公开的方法等，但与本发明的方法完全不同。
现有技术文献专利文献专利文献1:日本特表2004-519211号公报专利文献2 :国际公开W02004/101798非专利文献非专利文献I =Biochemistry, 41, 7074-7081 页，2002非专利文献2 J. Virology，79，2614-2619 页，2005。

发明内容
本发明的课题在于提供对双生病毒有效的防除感染的手段。更具体地说，本发明的课题是提供抑制双生病毒复制的药物以及对双生病毒具有抗性的植物等。双生病毒一旦进入到植物内，首先通过植物内源性的因子形成双链环状DNA。接着，来自病毒的复制蛋白(Rep)与位于基因间区(IR)的莖环上游的Rep结合位点结合。Rep是具有多功能的蛋白质，与Rep结合位点结合，在茎环的环部分的9个碱基的序列中加入切口后，与加入了切口的DNA的5’末端共价结合。之后，以-链作为模板，由3’末端开始DNA合成，在合成了 I个拷贝的基因组时，通过Rep再一次在新合成的9个碱基的序列中加入切口。同时切出的I个拷贝的基因组份的DNA通过R印连接，复制单链环状DNA，Rep与新合成的5’末端共价结合。通过该重复来进行双生病毒的复制，Rep以外的复制所必需的材料全部来自植物(参照图2以及，化学i生物，41，311-317页，2003等)。已知R印只切断单链DNA，为了使Rep切断病毒DNA，病毒DNA必须采取茎环结构。在双生病毒中，已知形成该茎环的碱基序列极为高度保守。通常茎区由9个GC对和2个AT对组成，环区由11个碱基或12个碱基组成，在TT、TTT、TA或ATA之后存在TAATATTAC的碱基序列(参照化学i生物，41，311-317页，2003中313页的图2等)。本发明人着眼于该茎环部分，为了提供可普遍抑制属于双生病毒的多种病毒复制的手段而进行了深入研究。结果发现通过使AZP与茎环部分的DNA特异性结合，使病毒DNA的双链结构稳定，抑制其向茎环结构变化，由此可以抑制只切断单链DNA的Rep对病毒DNA的切断。还确认了该病毒复制抑制作用实际在植物体中发挥作用。本发明基于上述认识完成。S卩，本发明提供复制抑制剂，其是针对双生病毒的复制抑制剂，含有锌指蛋白，且可以抑制茎环结构的形成，其中，该锌指蛋白可以与双生病毒的茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合。该发明的优选方案提供上述复制抑制剂，其含有可与选自双生病毒茎区的全长DNA的I处(I個)的部分DNA结合的单一锌指蛋白；上述复制抑制剂，其含有可与选自双生病毒茎区的全长DNA的2处以上的部分DNA结合的单一锌指蛋白；上述复制抑制剂，其中上述锌指蛋白为含有10个锌指结构域的锌指蛋白；上述复制抑制剂，其含有锌指蛋白，该锌指蛋白是通过接头将2个以上可分别与选自双生病毒茎区的全长DNA的2处以上的部分DNA结合的锌指蛋白连接而成；上述复制抑制剂，其含有2个锌指蛋白；上述复制抑制剂，其
中，2个锌指蛋白为含有3个锌指结构域的锌指蛋白和含有6个锌指结构域的锌指蛋白。本发明也提供编码上述锌指蛋白的核酸，以及是针对双生病毒的复制抑制剂的、含有编码上述锌指蛋白的核酸的复制抑制剂。根据上述发明的优选方案，提供上述复制抑制剂，其中，双生病毒为属于菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的病毒；上述复制抑制剂,其中,双生病毒为番爺黄化曲叶病毒。从另一角度出发，本发明提供抗双生病毒剂，其含有上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸；针对双生病毒的感染预防剂，其含有上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸；用于防除双生病毒感染的农药，该农药含有上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸。进一步从其它角度出发，本发明提供预防植物的双生病毒感染的方法，该方法包括对植物施用预防有效量的上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸的步骤；防除双生病 毒感染的方法，该方法包括对植物施用防除有效量的上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸的步骤。本发明还提供基因重组植物,其是对双生病毒具有抗性的植物,可表达上述锌指蛋白；转化植物，其是对双生病毒具有抗性的植物，导入了编码上述锌指蛋白的基因；使植物获得双生病毒抗性的方法，该方法包括用编码上述锌指蛋白的基因转化植物的步骤。本发明进一步提供含有编码上述锌指蛋白的核酸的重组载体，以及用于将植物转化为对双生病毒具有抗性的植物的上述重组载体。载体可使用植物用的病毒载体等。本发明的复制抑制剂是以在双生病毒中高度保守的茎环区作为靶标，因此可作为针对多种双生病毒感染的通用复制抑制剂起作用。因此，本发明的复制抑制剂不仅对于双生病毒中所包含的代表性病毒TYLCV感染，而且对于其它双生病毒也可发挥高有效性，因此，作为多种双生病毒的防除手段极为有用。附图简述图1是表示锌指基序与DNA结合方式的图。图2是双生病毒的复制步骤的示意图。图3是表示双生病毒与TYLCV的包含关系的图。 图4是表示TYLCV的茎环区的图。图5是表示包含在双生病毒中的数种病毒的茎环区同源性的图。图6是表示只以TYLCV为靶标的复制抑制剂的实例(上半部分)以及以多种双生病毒为靶标的复制抑制剂的实例(下半部分)的图。图7是表示TYLCV专用的AZP-2的制作步骤的方案。图8是表示双生病毒通用的AZP-3的制作步骤的方案。图9是表示通过凝胶移位试验评价TYLCV专用的AZP-2与靶DNA序列结合的能力的结果的图。图10是表示通过凝胶移位试验评价双生病毒通用的AZP-3与靶DNA序列结合的能力的结果的图。图11是表示为了进行比较，通过凝胶移位试验评价R印N与靶DNA序列结合的能力的结果的图。图12是表示GST-AZP (AZP-2)抑制Rep切断复制起点的活性的图。泳道I表示底物DNA，泳道2表示切断产物标志物，泳道3表示用2 μ M GST-Rep进行切断。
图13是表示GST-AZP (AZP-3)抑制Rep切断复制起点的活性的图。表示GST-Rep浓度2 μ Μ、反应温度25°C、反应时间30分钟下的切断物。图14是表示pUC35S0-TYLCV3/4/6的制作方法的图。35S:来自花椰菜花叶病毒的启动子；NLS :核定位信号；Ω :用于提高翻译效率的5’ -前导序列；N0ST :终止子；TYLCV3/4/6 :与所有TYLCV中的共有碱基序列结合的AZP (识别序列为5’-GGCCATCCGTATAATATTACCGGATGGCCGC-3，)。图15是表示转化用的AZP表达质粒的制作方法的图。NOS :正缬氨酸合成启动子(来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)) ;NPT2 :卡那霉素抗性基因；GUS β -半乳糖苷酶基因；RB(右边界)和LB(左边界):约25bp的重复序列(该序列之间的 DNA区被转移至植物基因组中)。
图16是表示转化体Tl的插入基因的结构以及用于检测卡那霉素抗性基因和AZP基因的PCR引物组的图。图17是表示检测转化体Tl的卡那霉素抗性基因和AZP基因的结果的图。泳道1-4表示使用由各Tl植物提取的DNA、N表示使用由野生型番茄提取的DNA、P表示使用转化中使用的双元载体(binary vector),分别进行PCR的结果。图18是表示AZP表达盒全部区中的插入基因的结构、以及用于确认插入基因组中的引物组的图。图19是表示通过PCR确认AZP基因插入在导入AZP-2所得的T2植物中的结果的图。为了检测AZP表达盒，泳道1-8表示使用由各Tl植物提取的DNA、P表示使用在转化中使用的双元载体，分别进行PCR的结果。图20是表示对于导入了 AZP-2得到的T2植物，通过PCR鉴定AZP插入基因的拷贝数的结果的图。泳道1-18表示使用由来自特定的转化体Tl的T2植物提取的DNA、N表示使用由野生型番茄提取的DNA、P表示使用在转化中使用的双元载体，分别进行PCR的结
果O图21是表示确认AZP在导入AZP-2得到的T2植物中的表达的结果的图。通过利用抗HA抗体的蛋白质印迹法，由图20所示的T2植物叶提取液中检出了 AZP。图中的泳道编号与图20对应。图22表示对于导入AZP-2得到的T3植物，通过PCR鉴定AZP插入基因的纯合T2系的结果的图。泳道1-16表示使用由来自特定的T2系的T3植物提取的DNA进行PCR的结果。将在全部的T3个体中确认了 AZP插入基因的该T2植物作为纯合进行筛选。图23是表示确认AZP在导入AZP-2得到的T3植物中的表达的结果的图。泳道1_4是使用来自T3植物的叶的提取液、N是使用来自野生型番茄叶的提取液、以及P是使用来自所使用的系的T2植物的叶的提取液，分别通过利用抗HA抗体的蛋白质印迹检出了 AZP。图24是表示通过土壤杆菌接种法(Agro-1noculation)向野生型Micro-Tom番爺注入具有TYLCV基因组的土壤杆菌，使TYLCV感染成立的结果的图。在生长后的个体(右)中明确观察到TYLCV感染的特征性症状一叶卷曲或黄化，同时可见明显的生长抑制。图25是表示对导入AZP-2得到的T3植物进行TYLCV感染试验的结果的图。转化体中未见感染症状。图26是表示从感染病毒30天后的AZP-2转化番茄回收叶，使用TYLCV检测用引物进行PCR的结果的图。图27是表示用TYLCV感染由导入AZP-3制作的Tl植物的I个个体得到的T3植物的结果的图。图28是表示在AZP-3的转化体中未检出病毒DNA的图。
具体实施例方式本发明的复制抑制剂是针对双生病毒的复制抑制剂，其特征在于，含有锌指蛋白，且可抑制茎环结构的形成，其中，该锌指蛋白可以与双生病毒茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合。本说明书中使用的“双生病毒”的术语是指感染植物的DNA病毒，其是具有I个或2个单链的环状DNA的病毒，该术语的含义例如在化学i生物，41，311-317页，2003等中有 具体说明。根据基因组结构、宿主范围以及昆虫媒介的种类，双生病毒分类为以下4个属，即，玉米线条病毒属(Mastrevirus)、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)、番爺伪曲顶病毒属(Topocuvirus)和菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus),本发明的复制抑制剂可以以属于其中任一属的任意病毒作为靶标。属于各属的病毒的基因组构成在上述出版物(化学i生物，41,311-317页，2003)的图2中具体给出。另外，属于双生病毒的病毒及其简写符号例如在国际公开W02004/101798中公开了详细的表格。通过参照，将国际公开W02004/101798的公开的全部内容包含作为本说明书的公开。双生病毒中除已知的双生病毒之外，当然也包含未知的双生病毒和已知的双生病毒变异而成的新种双生病毒等。例如可举出MSV(玉米条纹病毒(maize streak virus))、WDV(小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus))、BeYDV(菜豆黄矮病毒(Bean yellow dwarf virus))等属于玉米线条病毒属的病毒，BCTV(甜菜曲顶病毒(Beet cury top virus))等属于甜菜曲顶病毒属的病毒，TPCTV(番爺伪曲顶病毒(Tomato pseudo-cury top virus))等属于番爺伪曲顶病毒属的病毒，以及BGMV (菜豆金色花叶病毒(Bean golden mosaic virus))、ACMV (非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus))、SLCV (南瓜曲叶病毒(Squash leaf curlvirus))、TGMV (番爺金色花叶病毒(Tomato golden mosaic virus))、以及 TYLCV (番爺黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus))等，但并不限于这些。从为复制抑制剂的结合部位的茎环区的同源性角度出发，优选属于菜豆金色花叶病毒属的病毒。可优选举出TYLCCNV、TYLCGV, TYLCMalV, TYLCSV, TYLCTHV、TYLCV, ACMV,BGMV、CaLCuV、ToCMo V、TGMV、ToGMo V、ToMHV、ToMoTV、ToMo V、ToRMV、To SLCV、To SRV、棉花曲叶(CLCrV, CLCuAV, ClCuGV, CLCuKV, CLCuMV, CLCuRV)、东非木薯花叶(EACMCV、EACMMV, EACMV,EACMZV)、马铃薯黄花叶(PYMPV、PYMTV, PYMV)、南瓜曲叶(SLCCNV、SLCV, SLCYV)、甘薯曲叶(SPLCGV、SPLCV)、烟草曲叶(TbLCJV、TbLCKoV, TbLCYNV, TbLCZV)、番茄曲叶(ToLCBV、ToLCBDV、ToLCGV、ToLCKV、ToLCLV、ToLCMV、ToLCNDV、ToLCSLV、ToLCTffV, ToLCW、ToLCV)等，但并不限于它们。特别是属于菜豆金色花叶病毒属的TYLCV等是本发明的复制抑制剂的适合的适用对象。图3表示双生病毒与TYLCV的包含关系。本发明的复制抑制剂含有锌指蛋白，且具有抑制茎环结构的形成的作用，所述锌指蛋白可与双生病毒茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合。关于双生病毒的“茎环区”的术语，例如若以TYLCV为例进行说明，则茎环区是由彼此互补地结合的两个茎区(分别由11个碱基组成的区)，和存在于两者之间形成环的环区(由11个碱基组成的区)组成的33个碱基的区。已知TYLCV存在多种株，在所有TYLCV中，茎环区的碱基序列很保守。图4表示TYLCV的茎环区。本说明书中，茎环区的碱基序列“很保守”是指所比较的碱基序列的同源性在80%以上，优选90%以上，更优选95%以上，进一步优选97%以上，特别优选99%以上。该茎环区在属于菜豆金色花叶病毒属的其它病毒中也高度保守，例如在两种BGMV的DNA的CR(共同区)上存在由34个碱基组成的茎环区，该碱基序列与属于菜豆金色花叶病毒属的其它病毒茎环区的碱基序列同源性极高。并且，对于属于双生病毒其它属的病毒，茎环区也高度保守。图5表示有关包含在双生病毒中的多种病毒的茎环区的同源性。本发明的复制抑制剂可设计成，与如上所述高度保守的双生病毒茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合，该特异性结合的结果是可抑制茎环结构的形成。本发明的复制抑制剂还可设计成，除了与茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合的性质之外，还与连接至茎环区DNA的上 游和/或下游的DNA特异性结合。为了通过特异性结合来抑制茎环结构的形成，只要本发明的抑制剂可与茎环区结合而使病毒DNA的双链结构稳定即可，基于茎环区的碱基序列选择适当的锌指结构域，由此可以设计抑制茎环结构的形成的锌指蛋白。锌指蛋白中包含的锌指结构域可使用识别密码表(非简并识别密码表)，设计成可识别特定的碱基序列。本说明书中，锌指结构域是指构成存在于锌指蛋白上的DNA结合部位的结构域，有时也简称为“指”。代表性的锌指蛋白具有2个、3个、4个、6个或10个左右的锌指结构域。识别密码表、以及识别特定的碱基序列而特异性结合的锌指蛋白的设计方法例如记载于日本特表2004-519211号公报。通过参照，将上述专利公报公开的全部内容包含在本说明书的公开中。还可以参照Biochemistry，41，7074-7081页，2002等。如上所述，关于双生病毒基因组DNA茎环区碱基序列的信息可容易获得，本领域技术人员可以容易地设计制造至少可与茎环区的全长DNA或选自全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合的锌指蛋白。例如，为了设计只以TYLCV为靶标的复制抑制剂，设计可与包含在TYLCV之间很保守的茎环区DNA (33个碱基)的全长或几乎全长的DNA结合的锌指蛋白即可，通过使用选自这样的锌指蛋白的I种锌指蛋白作为本发明的复制抑制剂，可以抑制全部的TYLCV的复制。作为这样的锌指蛋白，例如可设计含有10个锌指结构域的锌指蛋白。能够将上述方法适当应用于以TYLCV以外的双生病毒科为靶标的复制抑制剂的设计，这是本领域技术人员容易理解的。为了设计以TYLCV之外的多种双生病毒为靶标的复制抑制剂，例如可从茎区的全长DNA中选择作为靶双生病毒中的共有序列的2处以上的部分DNA，设计与这些部分DNA结合的单一的锌指蛋白，或者设计分别与这些部分DNA结合的2个以上的锌指蛋白，将这些2个以上的锌指蛋白用适当的接头、例如肽接头等分别连接即可。接头除了使用氨基酸残基数为1-40个、优选1-20个、进一步优选1-10个左右的肽接头之外，例如还可以使用亚烷基链或聚乙二醇链等的合成接头或糖链等。在从茎区的全长DNA中选择2处以上的部分DNA时，优选选择不含有在作为靶标的多种双生病毒的茎区中为非共有序列的部分DNA，通常希望选择位于该非共有序列的上游和下游的共有序列的DNA作为部分DNA。
只以TYLCV为靶标的复制抑制剂的实例、以及以多种双生病毒为靶标的复制抑制剂的实例分别示于图6。图中，上侧是只以TYLCV为靶标的情形的实例，下侧是以多种双生病毒为靶标的情形的实例。作为本发明的复制抑制剂的优选实例，(a)只以TYLCV为靶标的复制抑制剂可举出具有序列表的SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的复制抑制剂，以及以多种双生病毒为靶标的复制抑制剂可举出具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的复制抑制剂。另外，(b)作为由在SEQ ID NO :1或2所限定的氨基酸序列中具有I至数个、优选1_5个左右氨基酸缺失、置换和/或添加的氨基酸序列组成的复制抑制剂，与由SEQ ID NO :1或2所限定的氨基酸序列组成的蛋白质实质上具有同样的复制抑制作用的蛋白质也可作为本发明的复制抑制剂使用，包含在本发明的范围中。并且，(c)与SEQ ID NO :1或2所限定的氨基酸序列具有 70%、优选80%、进一步优选90%以上的同源性，与由SEQ ID NO :1或2所限定的氨基酸序列组成的蛋白质实质上具有同样的复制抑制作用的蛋白质也可作为本发明的复制抑制剂使用，包含在本发明的范围中。作为用于制备本发明的复制抑制剂的核酸，除了编码上述(a)的蛋白质的DNA(由序列表的SEQ ID NO :3或4所不的喊基序列限定的DNA)之外,还可以使用含有编码上述(b)或(c)的蛋白质的DNA的核酸。作为编码上述(b)或(c)所示的蛋白质的DNA，例如包括可在严格条件下与由SEQ ID NO :3或4所示碱基序列限定的DNA杂交的DNA等。这样的DNA例如可举出使用DNA作为探针，在集落杂交法、噬菌斑杂交法或DNA印迹杂交法中，使用固定有来自集落或噬菌斑的DNA或DNA片段的滤器，在O. 7-1. OM左右的NaCl存在下、在65°C下进行杂交，然后用O. 1-2 X SSC溶液(I X SSC溶液含有150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)，在65°C条件下洗涤滤器，可由此鉴定的DNA等。例如，可优选使用与作为探针使用的DNA的碱基序列具有70 %以上、优选80 %以上、进一步优选90 %以上、特别优选95 %以上、最优选98%以上的同源性的DNA。本发明的复制抑制剂以上述锌指蛋白或编码该锌指蛋白的核酸的形式提供，通过将本发明的复制抑制剂直接作为农药施用于植物，可以防除双生病毒感染。本发明的复制抑制剂的施用方法没有特别限定，例如可以使用本领域周知的制剂用添加物制备作为农药用组合物。含有蛋白质或核酸作为有效成分的农药用组合物在本领域是已知的，可采用适当的手段制备农药用组合物。例如可举出使用掺入了上述核酸的质粒等载体，将上述核酸导入植物细胞内瞬时转化植物的方法；或者使用载体将上述核酸掺入植物基因组中的方法等，但并不限于这些方法。可在本发明的方法中利用的载体也包括感染植物的病毒载体。农药用组合物的形态没有特别限定，只要是本领域可利用的形态，就可采用任何形态。例如可以使用乳剂、液体剂、油剂、水溶性剂、水合剂、流动剂(7 口 7 )、粉剂、微粒剂、颗粒剂、烟雾剂、熏蒸剂或糊剂等形态的组合物。农药用组合物的制造方法也没有特别限定，可适当采用本领域技术人员可利用的方法。还可以将其它抗病毒剂、杀虫剂、杀菌剂、杀虫杀菌剂、除草剂等其它农药的有效成分掺混于农药用组合物中。本发明提供可表达上述复制抑制剂的转化植物。本发明中，作为转化对象的植物没有特别限定，除了完整植物体之外，还可以是植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅栏组织、海绵组织等)或植物培养细胞的任意一种。植物的种类没有特别限定，可以以任意的植物为对象，优选以双生病毒感染成立的植物种类作为对象。更具体地说，植物种类例如可举出属于锦葵科(秋葵等)、藜科(甜菜、菠菜等)、十字花科(芜菁、花椰菜、青花椰菜、卷心菜、油菜(- 7 f )、紫罗兰、萝卜、青梗菜、大白菜、山菜等)、鸢尾科(鸢尾、唐菖蒲、小苍兰等)、白花丹科(不凋花(Statice)等)、禾本科(水稻、结缕草、玉米、麦等)、苦苣苔科(Gesneriaceae)(非洲堇等)、五·加科(土当归等)、葫芦科(南瓜、黄瓜、越瓜、西瓜、甜瓜等)、柿树科(柿子等)、菊科(非洲菊、菊、金盏花、秋英属、牛蒡、瓜叶菊、苘蒿、大丽花、向日葵、蜂斗菜、雏菊、六月菊、莴苣等)、胡桃科(胡桃等)、桑科(无花果、桑树、蛇麻草等)、罂粟科(冰岛罂粟等)、玄参科(金鱼草等)、报春花科(仙客来、报春花等)、天南星科(、芋头等)、仙人掌科(仙人掌等)、唇形科(一串红、紫苏等)、秋海棠科(秋海棠属等)、姜科(姜、荷等)、睡莲科(莲藕等)、堇菜科(三色堇等)、伞形科(水芹、旱芹、胡萝卜、欧芹、鸭儿芹等)、金粟兰科(草珊瑚等)、杜鹃花科(浆果类等)、山茶科(茶等)、大戟科(一品红等)、茄科(马铃薯、烟草、番茄、茄子、柿子椒、狮子菜椒等)、石竹科(康乃馨、多年生满天星等)、蔷薇科(杏、草莓、梅、樱桃、李、梨、蔷薇、枇杷、桃、珍珠绣线菊、苹果、西洋梨等)、旋花科(牵牛花、甘薯等)、牛儿苗科(天竺葵等)、葡萄科(葡萄等)、山毛榉科(栗等)、牡丹科(牡丹、芍药等)、猕猴桃科(猕猴桃等)、豆科(红豆、扁豆、菜豆、毛豆、豌豆、香豌豆、蚕豆、大豆、花生等)、芸香科(柑橘等)、薯蓣科(山药等)、虎耳草科(兰花等)、百合科(芦笋、洋葱、郁金香、韭菜、蒜、葱、风信子、百合、头、冬葱等)、兰科(卡特兰属、绣球花、蝴蝶兰等)、龙舌兰科(龙血树类等)、龙胆科(洋桔梗、龙胆等)的植物，但并不限于这些。优选例如可举出番茄、胡椒、烟草、南瓜、木薯(manioc)、番薯、棉花、甜瓜、马铃薯、大豆、葡萄、玉米、小麦、甘蔗、豆、甜菜、西瓜、秋葵、木薯(cassava)等，但并不限于这些。进一步优选的植物是番茄、棉花、马铃薯等，特别优选的植物是番茄。作为要转化的植物源，可举出原生质体、种子、萌芽、苗、愈伤组织、培养细胞、植物体等，但并不特别限定。本领域的技术人员可根据对象植物的种类，选择适当的部位进行转化。用于转化的载体的种类没有特别限定，优选载体中含有用于使编码上述锌指蛋白的基因表达的启动子和/或增强子序列。启动子和增强子序列只要是在植物细胞中可使上述基因表达即可，其种类没有特别限定，可使用任意的启动子和增强子序列。例如可使用含有如土壤杆菌或根瘤菌的植物细胞内表达的基因、来自植物体、植物病毒或细菌的启动子等。启动子例如可使用来自根癌土壤杆菌的T-DNA的启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子、NOS启动子、核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisc0)启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、来自植物的肌动蛋白或组蛋白等的启动子/增强子等，但并不限于它们。载体中可以含有编码各种抗生素抗性基因或其它标记基因作为选择性标记基因的序列。标记基因的实例例如可举出抗大观霉素基因、链霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、抗抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)的除草剂的抗性基因、抗抑制谷氨酰胺合成酶的除草剂的抗性基因(例如bar基因)、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、荧光素酶基因等，但并不限于这些。为了提高基因表达效率，例如也可优选在基因的编码区的多核苷酸编码区的3’末端包含Poly (A) +序列。Poly (A) +序列可以使用来自各种植物基因或T-DNA的序列，但并不限于它们。也可以将对于使基因高水平表达有用的其它序列、例如特定的基因的内含子序列、5’非翻译区的序列等导入载体。为了促进向核内的转运，还优选掺入核定位信号(NLS)
坐寸ο对于高等植物的基因表达有用的载体是本领域所周知的，可使用任意的载体。例如将载体导入植物细胞时，作为可将载体DNA的一部分掺入宿主植物的基因组的载体，除了来自根癌土壤杆菌的Ti质粒的载体之外，还可举出来自Ti质粒的KYLX6、pKYLX7、pBI101、pBH2113、pBI121等，但并不限于这些。
对于表达载体，可采用用于将外源性基因导入植物细胞的公知的方法，例如基因枪法、电穿孔法、聚乙二醇(PEG)法、磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、显微注射、脂转染法、以及土壤杆菌法等微生物媒介转染法等，导入所需的植物细胞中。其中优选基因枪法、电穿孔法、聚乙二醇法和土壤杆菌法等，可特别优选米用土壤杆菌法(Methods Mol. Biol, 82, 259-266页，1998)。有时也可以通过采用双成分载体(双元载体)法高效率地进行基因重组。表达载体的构建方法以及植物的转化方法在本说明书的实施例中进一步具体说明，因此，本领域技术人员可参照上述一般说明和实施例的具体说明，通过将载体的种类或要导入载体中的序列、转化法等进行适当变化或改变，可以转化所需植物，使其表达本发明的复制抑制剂。实施例以下通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不限于下述实施例。例I1.材料和方法(I)AZP 的设计基于日本特表2004-519211号公报所记载的识别密码表设计分别识别以下两种DNA区的锌指蛋白(以下，在实施例中简称为“AZP”)。a. TYLCV中保守的茎环区b.双生病毒中保守的茎环区在图6的上半部分所示的AZP(TYLCV专用)中，连续地连接10个锌指结构域。图6的下半部分所示的AZP(双生病毒通用)中，是将识别在茎环区内的双生病毒中保守的两个区的2种AZP用短肽连接。(2) AZP表达质粒的制作按照图7所示方案制作TYLCV专用AZP (以下称为“AZP-2”)。首先通过PCR合成分别连接有3个锌指的基因，将各基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-21a(NoVagen制造)的BamH I/Hind III位点，然后确认所得质粒的碱基序列，由此获得pET_TYLCV_3、pET-TYLCV-4 和 pET-TYLCV-5。接着，通过 PCR 扩增 pET_TYLCV_3 和 pET_TYLCV_4 内的 3 指AZP的基因并连接，最终得到pET-TYLCV3/4。制作识别5’ -TATA-3’的锌指基因，按照上述方法与PET-TYLCV5内的3指AZP基因连接，由此制作pET_TYLCV6。最后，通过PCR，由PET-TYLCV3/4和pET_TYLCV6分别扩增6指AZP基因和4指AZP基因并连接，由此制作识别在形成茎环区的序列的33个碱基中的31个碱基的AZP-2表达用质粒(pET-TYLCV3/4/6)。按照图8所示方案制作双生病毒通用AZP(以下称为“AZP-3”)。首先，为了掺入识别在茎环区内的双生病毒中保守的2个区的2种AZP基因和接头肽基因，首先制作前体质粒(pET-MCS)。通过PCR，由pET-TYLCV3/4扩增识别双生病毒中保守的较长区的6指AZP基因，克隆到pET-MCS上，由此制作pET-TYLCV3/4-MCS。接着，通过PCR，由pET_TYLCV5扩增识别双生病毒中保守的较短区的3指AZP基因，克隆到pET-TYLCV34-MCS上，由此制作表达具有6个氨基酸作为接头肽的AZP-3的质粒(pET-TYLCV3/4-MCS-TYLCV5)。(3) AZP 的表达用AZP表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，将所得转化体在含有氨苄青霉素的LB培养基中37°C下培养，在0D_达到O. 6-0. 7时添加IPTG，使终浓度为ImM，诱导目标蛋白的表达。进一步培养3小时，然后通过离心回收大肠杆菌，在蛋白质纯化之前在-80°C下保存。(4) AZP 的纯化
各AZP按照基本相同的方法纯化。向在_80°C下保存的大肠杆菌中加入IOml裂解缓冲液(IOOmM Trs-HclUOOmM NaCUO.1mM ZnCl2、5mM DTT，pH8. O)，重复 3 次冷冻和融解，使大肠杆菌的细胞壁容易破坏。接着加入到超声波破碎机中，破碎大肠杆菌，然后通过离心回收含有目标蛋白质的上清。将该上清加载于阳离子交换树脂的Biorex-70 (Bio-Rad制造)中，使目标蛋白质吸附于树脂上，然后用洗涤缓冲液(50mM Trs-HCl、50mM NaCl,O.1mMZnCl2,0. 2mM DTT、pH8. 0)充分洗涤。接着用洗脱缓冲液(50mM Trs_HCl、300mM NaCl、0.1mMZnCl2,0. 2mM DTT、pH8. 0)洗脱目标蛋白质。只收集含有目标蛋白质的级分，用超滤膜浓缩，然后加入等量的甘油，搅拌，然后在_80°C下保存。AZP纯度通过SDS-PAGE上的考马斯蓝染色的条带的量判断。各蛋白质浓度使用Protein Assay ESL(Roche制造)确定。(5) RepN表达质粒的制作RepN是病毒复制蛋白R印的N末端区(191个氨基酸残基)，具有DNA结合能力。为了应用于AZP抑制Rep与同向重复序列结合的试验，按照以下方法制备R印N。使用从受感染的番茄中回收的TYLCV基因组，通过PCR，由TYLCV基因组扩增R印N基因，与AZP的情形同样，克隆到pET-21a的BamH I/Hind III位点。通过确认所得质粒的碱基序列来制作RepN表达用的质粒(pET-RepN)。(6) RepN蛋白的表达和纯化RepN的表达与AZP表达的情形同样进行，获得足够量的表达。所得大肠杆菌在进行蛋白质纯化之前保存于_80°C。R印N的纯化与AZP的情形同样进行。在使用Biorex-70的离子交换色谱中，用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl、250mM NaCl,O. 2mM DTT、pH8. O)洗脱，由此获得纯度高的R印N。(7) AZP和R印N与复制起点结合的能力的评价各蛋白质与靶DNA序列结合的能力的评价是通过凝胶移位试验进行。制作含有靶DNA序列的DNA寡聚物，将5’末端用32P标记。接着，在含有标记DNA的结合缓冲液(IOmMTris-HCl、IOOmM NaCl、5mM MgCl2、0.1mM ZnCl2,0. 05% BSA、10%甘油，ρΗ7· 5)中添加规定量的蛋白质，在冰上反应I小时。将该反应物施加于6%非改性丙烯酰胺凝胶上,在4°C下电泳2小时(电泳缓冲液45mM Tris-硼酸)。电泳后将凝胶置于色谱纸上进行干燥。在充分干燥后使其感光到X射线胶片，检测标记DNA的条带。游离DNA和与蛋白质的DNA复合体的量比为1:1时的蛋白质浓度相当于与靶DNA序列的解离常数。根据该蛋白质浓度进行AZP和R印N的结合能力的比较。(8) AZP抑制病毒复制蛋白切断的能力的评价
(a) Rep表达质粒的制作-1在抑制切断的能力的评价中，具有切断活性的全长的Rep是必需的，因此进行了Rep表达质粒的制作。与R印N表达质粒的制作同样，Rep基因是通过PCR由TYLCV基因组扩增，克隆到pET-21a的BamH I/Hind III位点。确认所得质粒的碱基序列，由此制作了 Rep表达用的质粒(pET-Rep)。(b)Rep表达质粒的制作_2如果是单独的R印，在大肠杆菌破碎后可能无法以溶解的状态检测，因此，以与促进难溶的蛋白质溶解且纯化简便的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合体的形式制作R印。通过PCR，由GST融合蛋白表达用质粒(pET-41a，Novagen制造)扩增含有T7启动子和GST基因的DNA区，克隆到pET-R印的BamH I/Sph I位点。确认DNA碱基序列，由此制作GST-R印蛋白表达用的质粒(pET-GST-R印)。
(C) GST-Rep融合蛋白的表达用pET-GST-Rep 分别转化三种大肠杆菌 BL21 (DE3)、Rosetta2 (DE3) pLysS 和BL21-Codon-Plus(DE3)-RIL，与R印N蛋白表达时同样，在37°C下用ImM IPTG诱导所得各克隆表达。在各大肠杆菌中的表达量相同，但大肠杆菌破碎后的GST-Rep的溶解量是在BL21(DE3)中最高。因此，使用BL21(DE3)转化体进行30°C下的蛋白质表达。(d) GST-Rep 蛋白的纯化将大肠杆菌沉淀悬浮于3mL裂解缓冲液(4. 3mM Na2HPO4、1. 47mM KH2P04、137mMNaCl,2. 7mM KCl, pH7. 3,0.1mM ZnCl2、5mM DTT)中，进行超声处理。通过 SDS-PAGE 确认GST-Rep蛋白的溶解，然后离心，只取出上清。将预先用20倍量的IXGST-结合洗涤缓冲液(GST-Bind Wash Buffer)洗涤的GST结合树脂转移至15mL锥形管中，进一步用5mLIXGST-结合洗涤缓冲液(4. 3mM Na2HPO4U. 47mM KH2P04、137mM NaCl、2. 7mM KC1、ρΗ7· 3)洗涤，以400Xg、25°C离心5分钟，小心除去上清。将含有超声处理后的GST-R印蛋白的上清用O. 45 μ m膜滤器过滤，将所得滤液添加于进行了上述前处理的树脂中。在4°C下振荡过夜，使GST-AZP蛋白吸附于树脂上。将该树脂过柱，用洗涤缓冲液(4. 3mM Na2HPO4、1. 47mMKH2PO4U37mM NaCl、2. 7mM KC1、0.1mM ZnCl2)洗涤，然后用洗脱缓冲液(50mM Tris · HCl，pH8.0、0.1mM ZnCl2、IOmM还原型谷胱甘肽)洗脱。通过SDS-PAGE确认洗脱的各级分，收集含有GST-Rep蛋白的级分，通过超滤膜浓缩至总量为300 μ L。蛋白质浓度通过市售的试剂盒(Protein Assay ECL)确定。(e) GST-AZP融合蛋白的表达制作AZP与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合体，使该GST-AZP基因位于T7启动子下游，将这样的表达载体导入大肠杆菌。将该大肠杆菌在120mL LB-Amp液体培养基中培养至0D_达到O. 65-0. 75。培养后添加IPTG，使终浓度为ImM，进一步培养3小时，由此诱导GST-AZP蛋白表达。将诱导后的大肠杆菌离心后回收，保存于_80°C。GST-AZP蛋白的纯化按照与GST-Rep蛋白纯化同样的方法进行。(f) AZP抑制病毒复制蛋白切断的能力的评价在含有由含Rep结合位点的200个碱基对组成的标记DNA (5nM)的反应溶液(25mMTris-HCl，pH7. 5、75mM NaCl、2. 5mM DTT)中添加GST-AZP (或者为了进行性能比较试验而添加GST-RepN，或者为了进行对照试验而添加GST)，混合，在冰上静置30分钟。然后分别添加GST-R印和MgCl2,使终浓度为2 μ M和5mM，然后在25°C下反应。30分钟后添加2 μ LO. 5Μ EDTA,使反应终止，进行苯酚处理和乙醇沉淀。用3 μ L加样缓冲液(80%甲酰胺、IOmMEDTA)溶解，将制作的样品在8%改性丙烯酰胺凝胶中进行电泳。2.结果(I)AZP与靶DNA序列结合的能力的评价通过凝胶移位试验评价纯化的AZP和RepN与祀DNA序列结合的能力。该试验中，在用32P标记的DNA中，以各种浓度添加蛋白质，进行结合反应，然后将游离DNA和与蛋白质的DNA复合体在非改性凝胶上分离。求出游离DNA和与蛋白质的DNA复合体的条带比为I I时的蛋白质浓度(相当于解离常数)，此时可知，TYLCV专用的ΑΖΡ-2的解离常数为O. 3-lnM(图9)，双生病毒通用的ΑΖΡ-3的解离常数为< IOnM (图10)。而R印N的解离常数为30ηΜ(图11)。通过该试验确认所设计的ΑΖΡ-2和ΑΖΡ-3与靶DNA序列结合的强度均 比RepN强ο⑵AZP抑制病毒复制蛋白切断的能力的评价如图12的泳道4-7所示，纯化的TYLCV专用的GST-AZP (ΑΖΡ-2)可有效地抑制R印对复制起点的切断。其抑制效果依赖于AZP浓度，可见在20 μ M下完全抑制。而在R印的显性失活体R印N中完全未见对切断的抑制(图12的泳道8-11)。R印N具有DNA结合结构域，当然DNA结合与要抑制的Rep的完全相同。对于GST，如泳道12所见，完全未见切断抑制，由此也可确认在泳道4-7中确认的GST-AZP的切断抑制活性全部来自于ΑΖΡ。另外，对于GST-AZP(ΑΖΡ-3)也同样地评价了切断抑制能力。其结果如图13所示。例21.材料和方法(I)AZP转化番茄的制作(a) AZP的植物用稳定表达载体的制作将编码AFP-2的基因插入到植物基因组中是通过土壤杆菌法进行。在原生质体试验中，按照图 14 的方法，由 pUC35S0-MCS 制备 pUC35S0-TYLCV3/4/6，用 EcoR I 和 Hind III从该质粒中切出含有35S启动子-AZP基因-NOS终止子的区。将片段在琼脂糖凝胶上纯化，然后克隆到双元质粒PBI121的EcoR I/Hind III位点，得到pBI_0TYLCV3/4/6。通过测序确认碱基序列正确。对于AZP-3也进行同样的操作。(b)Micro-Tom 的育种在72孔塑料托盘中装入栽培土，用喷壶轻轻打湿土壤，然后一个一个地播种Micro-Tom种子,在其上轻轻覆盖湿润的土,将全体用Saran Wrap覆盖。将该托盘在人工气候室(光期25°C，16小时；暗期22°C，8小时)中培养。在确认发芽时除去Saran Wrap，在同一条件下继续培养。播种后经过约2周后，将苗移栽至直径12cm的塑料花盆中，培养至回收种子。(c)Micro-Tom 的种的制备回收红色成熟的Micro-Tom的果实，在其赤道线上用刀分成两部分，用抹刀将所有的种子回收至50ml塑料管中。用水轻轻洗涤，然后用I %盐酸水洗涤10分钟，使种子周围的明胶层溶解。接着用流水将种子洗涤10分钟，将多余的水分用纸巾吸取，然后在室温下风干2天。干燥的种子在4°C下保存。
(d)基因导入Micro-Tom子叶将10-20粒Micro-Tom种子用10%稀释的Haiter (花王制造)杀菌，然后用无菌水洗漆4次。将该种子播种于固定有播种用培养基(I X Murashige-Skoog (MS)培养基、15g/L蔗糖、3g/L脱乙酰吉兰糖胶)的苗木箱中，在25°C、16小时昼长条件下生长6天。将真叶达到数毫米左右的个体用于转化。在进行土壤杆菌感染的前一天，将20 μ L用pB1-0TYLCV3/4/6转化的土壤杆菌C58ClRifR(GV2260)的甘油贮液接种于 2mL 的 LB 培养基(Kan 100mg/L、Amp 50mg/L)，在30°C下培养24小时。在感染当天，将ImL 土壤杆菌菌液取至Eppendorf管中，以5，OOOrpm离心5分钟，收集菌体。将该菌体悬浮于40mL含有100 μ M乙酰丁香酮、10 μ M的巯基乙醇的MS培养基中。用刀片切取Micro-Tom的子叶，自前端至一半附近切成两段。将这些子叶切片浸泡于上述土壤杆菌悬浮液中，静置10分钟使其感染。放在灭菌后的Kim纸巾(々A夕才 ^ )上，吸取多余的悬浮液，将叶置于共培培养基(1父15培养基、3(^/1蔗糖、38/1脱乙酰吉兰糖胶、1. 5mg/L反式玉米素、40 μ M乙酰丁香酮、O. l%MES,pH5. 7)。将盖子用外科胶带密封，用铝箔遮光，在25°C下培养。3-4天后，将感染的子叶切片转移至愈伤组织诱导培养基(1XMS培养基、3g/L脱乙酰吉兰糖胶、1. 5mg/L反式玉米素、100mg/L Kan、667mg/L安美汀(Augmentin)、O.1 % MES, pH 5.7)。由感染了约2周的一部分切片中形成愈伤组织,也可见形成枝条。每隔2周移种在新的愈伤组织诱导培养基中。由愈伤组织中切除形成了 3-4片叶的个体的子叶切片部分，转移至枝条诱导培养基(SIM培养基，将CIM培养基的反式玉米素浓度降至1. Omg/L),促进枝条的生长。在枝条生长至l_2cm长度时,在枝条最下端将其从愈伤组织上切离，移种于生根培养基(RM培养基，1/2 XMS培养基、3g/L脱乙酰吉兰糖胶、50mg/L Kan、375mg/L安美汀、O. 1% MES, ρΗ5· 7)。将在生根培养基中2周以内生根的个体的根切除，移种在苗木箱内固化的生根培养基中，进行生根的二次筛选。将在苗木箱中生根的个体转移至以下的驯化步骤。对于在最初的生根培养基(平板)中2周以内未生根的个体，薄薄地切除切口，移种于新的生根培养基中，再次诱导生根。对于在苗木箱的生根培养基中可见生根的个体，为了使其结实获得种子而植于土壤。此时，要缓慢地降低湿度进行驯化，使植物不会因湿度环境等变化而枯死。具体来说，在苗木箱中加入湿润的土壤，在其中种植生根个体，最初是高湿度状态，渐渐将盖子松开，缓慢降低湿度。将在苗木箱内用约I个月进行充分驯化的植物种植于盆中生长。对于第二次的生根筛选之后的植物，通过PCR确认是否导入了目标基因。切取约5mm的I片真叶，通过CTAB法提取基因组DNA。最终使用300 μ L悬浮于TE中的基因组DNA溶液中的I μ L，通过PCR法检查基因导入。作为引物，设计使用使卡那霉素抗性基因(ΝΡΤ2基因)得到扩增的引物组、和使含有人工转录基因和NOS终止子的区得到扩增的引物组。(e)从转化体中提取蛋白质将转化植物的l_2cm的叶采集至微量管中。向其中加入液氮使其冷冻，使用匀浆杵细细粉碎。液氮气化后加入200 μ L SDS样品缓冲液(O. 125Μ Tris-HCl (pH6. 8)、4% SDS、20%甘油、0. 01% ΒΡΒ、10 % 2-ΜΕ)，进一步磨碎。在95°C下保温10分钟，离心，然后将上清转移至新的微量管中。将其作为植物提取蛋白质的样品。(f)蛋白质印迹使用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶对提取的蛋白质中的I μ L进行电泳。同时对作为分子量标记的Perfect Protein Western Marker (Novagen制造)进行电泳。将蛋白质由丙烯酰胺凝胶转印至PVDF膜，然后使用丽春红S确认蛋白质。将膜在封闭液(5%脱脂乳、O. 05%吐温20，PBS)中振荡，然后使其与过氧化物酶标记-抗HA抗体反应。作为抗分子量标记的抗体，也同时使S-蛋白HRP反应。使用ECL化学发光系统使X射线胶片感光，检测信号。由该信号的大小和信号强度验证在转化植物内是否有AZP表达。(2)病毒感染试验(a)病毒感染用质粒的制作
病毒感染是利用土壤杆菌的感染性进行。为了将具有2个复制起点的病毒基因组拷贝导入双元质粒，对于TYLCV和TYLCV-mild这两种，按照以下所示2个阶段进行目标质粒的制作。TYLCV-mild与TYLCV的不同在于Rep所结合的同向重复序列不同，为了研究对双生病毒的通用性而使用。通过PCR，由TYLCV的病毒基因组DNA扩增包含复制起点的O. 5个拷贝份的DNA片段，克隆到双元质粒PBI121的EcoR I/Hind III位点，得到pBI_TYLCV(0. 5)。通过测序确认碱基序列正确。在导入TYLCV的I个拷贝份的DNA片段时，如果对用PCR扩增的DNA进行克隆，则必须确认所制作的质粒的喊基序列，但是，目标质粒含有1. 5个拷贝的病毒基因组，因此一定有重复的DNA区，无法通过测序确认碱基序列正确。这里，一旦在克隆质粒pBluescript II KS+中掺入I个拷贝份的病毒基因组，确认全部碱基序列后，不进行PCR，将用限制酶切出的DNA片段导入pBI_TYLCV(0. 5)。通过PCR，由TYLCV的病毒基因组DNA扩增包含复制起点的I个拷贝份的DNA片段，克隆到pBluescript II KS+的Pst I/Hind III位点,得到pBS-TYLCV。通过测序确认全部碱基序列正确。接着用BsrG I和Hind III从pBS-TYLCV切出病毒基因组I个拷贝份的DNA片段，在琼脂糖凝胶上纯化，然后克隆到pBI_TYLCV(0. 5)的BsrG I/Hind III位点上，最终得到目标质粒pB1-TYLCV(l. 5)。对于TYLCV-mild也进行同样的操作，最终可得到目标质粒 pB1-TYLCV-mild(l. 5)。(b)病毒感染用质粒的感染能力的确认制作土壤杆菌C58ClRifR(GV2260)的感受态细胞。在该感受态细胞中导入所制作的具有1. 5个拷贝的TYLCV基因组或TYLCV-mild基因组的双元载体，制作土壤杆菌接种法用的土壤杆菌的甘油贮液，保存于_80°C。在对野生型番茄进行感染的前一天，将该甘油贮液接种于6mL的LB培养基(Kan 100mg/L、Amp 50mg/L)，在30°C下培养一昼夜。接着收集土壤杆菌，悬浮于ImL缓冲液中。将该悬浮液注入到播种后约10天的苗的子叶中，使其感染。感染后定期进行植物个体的观察以及叶中病毒DNA的检测。用于此目的的DNA样品的制作如上所述进行，通过对使用对各TYLCV特异性的引物组进行PCR所得产物的分析，在分子水平上评价病毒感染。(3) TYLCV感染抗性的评价在来自转化体T3的苗中注入保有病毒双元载体的土壤杆菌的悬浮液，随时间变化用肉眼确认感染症状。另外，从感染的番茄的叶中提取DNA，按照前项的方法，通过PCR验证植物体内病毒是否增殖。2.结果(I)AZP转化番茄的制作分别通过土壤杆菌向Micro-Tom番茄中导入AZP基因。将用图15所示的具有各AZP表达盒的双元载体转化的土壤杆菌感染子叶切片，导入基因。接着，使用含有卡那霉素的培养基诱导愈伤组织、枝条，接着诱导根。选择生根较深地伸入琼脂培养基的个体，由此，在诱导生根时进一步筛选转化体，驯化，然后移栽于土壤中，从而得到转化体。通过PCR法确认了这些转化体Tl具有AZP基因。为了检测卡那霉素抗性基因和AZP基因，使用图16所示的PCR引物组(各图中以橙色和蓝色的箭头表示)进行PCR。通过图17所得到的转化体检测两者的基因，确认转化操作顺利进行。为防止万一，还用其它的引物组确认了 AZP表达盒全部区插入到番茄基因组中(图18 :用粉色箭头表示)。如图19所示，确认了从35S启动子至NOS终止子，AZP表达盒全部区均导入到植物基因组中。(2)T2和Τ3植物的制作以及各系的分析对于所得Tl植物中的AZP基因的拷贝数，调查Τ2植物中插入了 AZP基因的个体的比例，通过卡方检验来鉴定。即，由各Tl系回收Τ2种子，播种这些种子，通过PCR鉴定所得各Τ2个体中的AZP基因的有无。在导入ΑΖΡ-2得到的Τ2植物中，各以一个系为例表示于图19。以图19为例，在由通过PCR法确定的Tl系得到的Τ2植物的18个个体中，13个个体具有AZP基因，分离比为13 5。如果该Tl系具有I个拷贝的AZP基因，则其分离比应该为3 I。因此，如果通过卡方检验假定为I个拷贝，则卡方值为O. 074，P = O. 01的临界值为6. 63，因此该虚假设不能放弃。另一方面，如果假定插入了 2个拷贝，则卡方值为14. 2，比临界值大，该虚假设可放弃。由以上验证结果可知，该Tl系是单拷贝插入体。对其它的Tl个体也同样进行了单拷贝插入体的筛选(图20)。进一步通过蛋白质印迹确认各方法的转化体中AZP的表达。在各方法用的AZP表达盒中，预先加有HA附加表位，使得通过使用抗HA抗体的蛋白质印迹法，可以验证转化体中AZP蛋白的表达。如图21所示，对于导入了 AFP-2的Τ2植物，也可确认AZP蛋白质强烈表达。由确认了有I个拷贝的AZP基因插入的Tl植物得到的各Τ2系是纯合或杂合，这通过来自各Τ2植物的Τ3苗的PCR分析确定。通过由来自各Τ2系的Τ3苗(各系使用约20个个体的苗)的叶中提取的DNA样品的PCR分析，如果确认所有的苗中均保有AZP基因，则可以断定其亲本Τ2系为纯合(如果分离比为1: 3，则其亲本Τ2系为杂合)。在来自同一Τ2系的所有的Τ3植物中均保有AZP基因，因此可知该Τ2系为纯合(图22)。也通过统计处理确认为纯合。还通过蛋白质印迹确认了 Τ3植物中AZP的表达(图23)。对于使用AFP-3转化的植物，对于来自各Τ2植物的Τ3苗也进行同样的操作，得到了同样的结果。[表 I]
权利要求
1.复制抑制剂，所述复制抑制剂含有锌指蛋白，且可以抑制茎环结构的形成，其中，所述锌指蛋白可以与双生病毒茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I或2处以上的部分 DNA特异性结合。
2.权利要求1的复制抑制剂，所述复制抑制剂含有可与选自双生病毒茎区的全长DNA 的I处的部分DNA结合的单一的锌指蛋白，或者可与选自该全长DNA的2处以上的部分DNA 结合的单一的锌指蛋白。
3.权利要求1的复制抑制剂，所述复制抑制剂含有锌指蛋白，所述锌指蛋白是通过接头将2个以上可分别与选自双生病毒茎区的全长DNA的2处以上的部分DNA结合的锌指蛋白质连接而成。
4.权利要求3的复制抑制剂，其中，2个锌指蛋白为含有3个锌指结构域的锌指蛋白以及含有6个锌指结构域的锌指蛋白。
5.权利要求3或4的复制抑制剂，其中，接头为妝接头。
6.权利要求1-5中任一项的复制抑制剂,其中，双生病毒为属于菜豆金色花叶病毒属的病毒。
7.权利要求6的复制抑制剂，其中，双生病毒为番茄黄化曲叶病毒。
8.编码权利要求1-7中任一项的锌指蛋白的核酸。
9.植物转化用的重组载体，所述重组载体含有权利要求8的核酸。
10.含有权利要求1-7中任一项的锌指蛋白或编码该锌指蛋白的核酸作为有效成分的农药。
11.预防植物的双生病毒感染的方法，所述方法包括对植物施用预防有效量的权利要求1-7中任一项的锌指蛋白或编码该锌指蛋白的核酸的步骤。
12.基因重组植物，所述基因重组植物对双生病毒具有抗性，可表达上述锌指蛋白。
13.通过导入编码权利要求1-7中任一项的锌指蛋白的核酸转化的植物。
14.使植物获得双生病毒抗性的方法，所述方法包括将编码权利要求1-7中任一项的锌指蛋白的核酸导入该植物进行转化的步骤。
15.植物转化用载体，所述植物转化用载体含有编码权利要求1-7中任一项的锌指蛋白的核酸。
全文摘要
本发明涉及复制抑制剂，其为抑制双生病毒的复制的药物，含有锌指蛋白，该锌指蛋白至少可与双生病毒的茎环区DNA的全长或其一部分特异性结合，且可抑制茎环结构的形成。
文档编号C07K14/00GK103003425SQ20118003022
公开日2013年3月27日 申请日期2011年6月6日 优先权日2010年6月7日
发明者世良贵史 申请人:世良贵史