双生病毒复制抑制剂的制作方法

双生病毒复制抑制剂的制作方法
【专利摘要】复制抑制剂，其是针对属于双生病毒科的玉米线条病毒属的病毒的复制抑制剂，所述复制抑制剂含有锌指蛋白并且可以抑制茎环结构的形成，所述锌指蛋白可以与该病毒的茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的1处或2处以上的部分DNA特异性结合。
【专利说明】双生病毒复制抑制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及对植物病毒有效的感染防除方法。更具体地，涉及针对作为植物病毒的双生病毒中所包含的属于玉米线条病毒属的植物病毒的复制抑制剂和对属于玉米线条病毒属的植物病毒所致的感染具有抗性的植物等。
【背景技术】
[0002]锌指与螺旋-转角-螺旋基序、亮氨酸拉链基序同为DNA结合基序之一，其是在氨基末端侧具有2个半胱氨酸和在羧基末端侧具有2个组氨酸，且在这些残基上配位有锌(Zn)的立体结构。锌指对DNA具有非常强的结合力，因此提出了利用该基序与DNA牢固结合的人工DNA结合蛋白((以下，本说明书中有时称为“AZP”)，并报道了使用识别密码表(Nondegenerate Recognition Code Table (非简并识别密码表))设计的 AZP,该 AZP 可以识别特定的碱基序列(日本特表2004-519211号公报；Biochemistry, 41，pp.7074-7081，2002)。
[0003]一个锌指基序可识别并结合3bp或4bp，通过用肽接头来连接锌指可以调节想要特异性结合的碱基序列的长度。锌指基序的第4号识别碱基序列是反义链，并与下一锌指基序的第I号识别喊基序列重置，因此N个锋指基序识别并结合3N+lbp的喊基序列(参照图1)。
[0004]报道了使用该AZP可以实现对植物DNA病毒的感染防除(J.Virology, 79，pp.2614-2619，2005)。该出版物中报道了，在拟南芥中AZO对植物DNA病毒甜菜严重曲顶病毒(Beet Severe Curly Top Virus, BSCTV)的感染防除效果，该方法采用通过AZP来抑制病毒复制起始所需的复制蛋白(Itep)与复制起点上的Rep结合位点(同向重复序列)结合的方法，是基于复制起点的同向重复序列设计具有比R印高的DNA结合能力的AZP来抑制病毒复制的方法。然而，在用AZP阻断R印的同向重复序列的该方法中，复制起点具有病毒固有的碱基序列，因而为了与各种植物病毒对应，存在必须使用各自不同的AZP的问题。从该观点出发，人们希望提供利用单一的AZP实现针对多种植物病毒的感染防除效果的方法。
[0005]另一方面，在中华人民共和国的陕西省汉中发现了引起小麦萎缩、斑叶、黄化和出穂降低的病害，作为其原因病毒，鉴定为小麦萎缩病病毒(Wheat Dwarf Virus: WDV、以下有时将该病毒简称为 “WDV”) (Zhiwu BaohudSSN: 0529-1542)，Vol.34，N0.2，pp.17-21，2008)。还明确了汉中分离所得数种WDV的基因组结构是相同的，属于双生病毒(Geminiviridae)科的玉米线条病毒(Masterevirus)。关于 W)V,除了 Plant Pathology,57, pp.838-841, 2008; Plant Pathology, 58, pp.1161-1169，2009 之外，还有 Virusgenes, 34，pp0.359-366，2007 等报道。
[0006]双生病毒是 感染植物、具有I个或2个单链环状DNA的病毒的总称，虽然包括多种植物病毒，但大致分类为菜豆金色花叶病毒(Begomovirus)属、番茄伪曲顶病毒(Topocuvirus)属、甜菜曲顶病毒(Curtovirus)属、和玉米线条病毒属4种。作为属于菜豆金色花叶病毒(Begomovirus)属的病毒，除了番爺黄化曲叶病毒(TomatoYellowLeaf CurlVirus: TYLCV)之外，可举出例如:马铃薯黄色花叶病毒(Potato Yellow Mosaic Virus:PYMV)、菜豆金色花叶病毒(Bean Golden Mosaic Virus: BGMV)等；作为属于玉米线条病毒属的病毒，除了上述WDV之外,还可举出:玉米条斑病毒(Maize Streak Virus: MSV)、芒属条斑病毒(Miscanthas Streak Virus: MiSV)、烟草黄萎病毒(Tobacco Yellow Dwarf Virus:TYDV)、虎尾草条点花叶病毒(Chloris Straite Mosaic Virus: CSMV)等。此外,属于番爺伪曲顶病毒属的病毒可举出番爺伪曲顶病毒(Tomato Pseudo-curly Top Virus: TPCTV),属于甜菜曲顶病毒属的病毒可举出甜菜轻型曲顶病毒(Beet Mild Curly Top Virus: BMCTV)(参照图3)。
[0007]双生病毒一旦进入到植物内，首先通过植物内源性的因子形成双链环状DNA。接着，来自病毒的复制蛋白(Rep)与位于基因间区(IR)的莖环上游的Rep结合位点结合。Rep是具有多功能的蛋白质，与Rep结合位点结合，在茎环的环部分的9个碱基序列中加入切口后，与加入了切口的DNA的5’末端共价结合。然后，以-链为模板，由3’末端开始DNA合成，在合成了 I个拷贝的基因组时，通过R印再次于新合成的9个碱基序列中加入切口。同时切出的I个拷贝的基因组份的DNA通过R印连接，复制单链环状DNA，Rep与新合成的5’末端共价结合。通过该重复来进行双生病毒的复制，Rep以外的复制所需的材料全部来自植物(参照图2以及，化学与生物(化学i生物)，41，pp.311-317，2003等)。
[0008]已知Rep只切断单链DNA，为了使Rep切断病毒DNA，病毒DNA需要采取茎环结构。在双生病毒中，已知形成该茎环的碱基序列在菜豆金色花叶病毒属中极为高度保守。通常，茎区由9个GC对和2个AT对组成，环区由11个碱基或12个碱基组成，在TT、TTT、TA或ATA之后存在TAATATTAC的碱基序列(参照化学和生物，41，pp.311-317，2003中p.313的图2等)。
[0009]如果可以 提供以双生病毒中玉米线条病毒属中保守的碱基序列为标靶的病毒复制抑制方法，则不仅可期待有效防除WDV感染，还可期待有效防除属于玉米线条病毒属的多种植物病毒感染。应予说明，对于具有双生病毒持续抗性的转化植物的制作方法，已知有国际公开W02004/101798中公开的方法等，但与本发明的方法完全不同。
[0010]现有技术文献 专利文献
专利文献1:日本特表2004-519211号公报 专利文献2:国际公开W02004/101798 非专利文献
非专利文献 I biochemistry, 41，pp.7074-7081，2002 非专利文献 2 J.Virology, 79，pp.2614-2619，2005
非专利文献 3:Zhiwu Baohu(ISSN: 0529-1542)，Vol.34, N0.2, pp.17-21，2008
非专利文献 4:Plant Pathology, 57，pp.838-841，2008
非专利文献 5:Plant Pathology, 58，pp.1161-1169，2009
非专利文献 6:Virus genes, 34，pp0.359-366，2007
非专利文献7:化学和生物(化学i生物)，41，pp.311-317，2003。

【发明内容】
[0011]发明要解决的技术问题
本发明的课题在于提供对双生病毒有效的感染防除方法。更具体地，本发明的课题在于提供对属于双生病毒所包含的玉米线条病毒属的植物病毒的复制进行抑制的药剂和对属于玉米线条病毒属的植物病毒具有抗性的植物等。
[0012]用于解决技术问题的方法
本发明人着眼于该茎环部分，为了提供可以普遍抑制属于双生病毒的多种病毒的复制的方法而进行了深入研究。结果发现:通过使AZP与茎环部分的DNA特异性结合，使病毒DNA的双链结构稳定化，抑制向茎环结构变化，由此可以抑制仅切断单链DNA的Rep所致的病毒DNA的切断。此外，本发明人还确认了该病毒复制抑制作用实际上在植物体中发挥作用。该方法对通过利用例如在双生病毒的菜豆金色花叶病毒属中尤其高度保守的茎环部来提供对属于菜豆金色花叶病毒属的病毒通用的病毒复制抑制剂极其有用。
[0013]进而，本发明人推进了研究，结果发现:通过利用在属于双生病毒的玉米线条病毒属的病毒中保守的茎环部和其周边区域并适用相同的方法，可以提供对包含小麦萎缩病病毒(WDV)等的属于玉米线条病毒属的病毒通用的病毒复制抑制剂，从而完成了本发明。
[0014]即，根据本发明，提供复制抑制剂，其是针对属于双生病毒科的玉米线条病毒属的病毒的复制抑制剂，所述复制抑制剂含有锌指蛋白并且可以抑制茎环结构的形成，所述锌指蛋白可以与该病毒的茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合。
[0015]根据上述发明的优选方式，提供:上述复制抑制剂，其含有可以与选自属于玉米线条病毒属的病毒的茎环区的全长DNA的I处(I個)的部分DNA结合的单一的锌指蛋白；上述复制抑制剂，其含有可以与连续DNA结合的单一的锌指蛋白，所述连续DNA由选自属于玉米线条病毒属的病毒的茎环区的全长DNA的I处的部分DNA、和结合于该DNA并选自周边区域的I处的DNA构成；以及上述复制抑制剂，其含有锌指蛋白，该锌指蛋白是通过接头将2个以上各自可以与选自由茎环区和结合于该茎环区的周边区域构成的DNA的2处以上的部分DNA结合的锌指蛋白结合而成。
[0016]进而根据优选方式，提供上述复制抑制剂，其中，上述锌指蛋白是含有8个至13个、优选9个至12个锌指结构域的锌指蛋白。
[0017]此外，根据本发明，还提供编码上述锌指蛋白的核酸、和针对双生病毒的复制抑制剂，该复制抑制剂含有编码上述锌指蛋白的核酸。
[0018]根据上述发明的优选方式，提供上述复制抑制剂，其中，属于玉米线条病毒属的病毒是小麦萎缩病病毒(WDV)。
[0019]从其他观点出发，根据本发明，提供含有上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸的针对属于玉米线条病毒属的病毒的抗病毒剂；含有上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸的针对属于玉米线条病毒属的病毒的感染预防剂；针对属于玉米线条病毒属的病毒所致的感染的防除用农药，其含有上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸。
[0020]进而从其他观点出发，根据本发明，提供预防植物的属于玉米线条病毒属的病毒感染的方法，该方法包括对植物施用预防有效量的上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸的步骤；针对属于玉米线条病毒属的病毒感染的防除方法，该方法包括对植物施用防除有效量的上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸的步骤。[0021]此外，根据本发明，提供基因重组植物，其是对属于玉米线条病毒属的病毒具有抗性的植物，其可表达上述锌指蛋白；转化植物，其是对属于玉米线条病毒属的病毒具有抗性的植物，并且导入有编码上述锌指蛋白的基因；使植物获得针对属于玉米线条病毒属的病毒的抗性的方法，其包括用编码上述锌指蛋白的基因转化植物的步骤。
[0022]进而根据本发明，提供含有编码上述锌指蛋白的核酸的重组载体；和上述重组载体，其用于将植物转化为对属于玉米线条病毒属的病毒具有抗性的植物。作为载体，可使用植物用的病毒载体等。
[0023]发明效果
本发明的复制抑制剂是以在属于双生病毒科的玉米线条病毒属的病毒中保守的茎环区作为靶标，因而可作为针对属于玉米线条病毒属的多种病毒所致感染的通用复制抑制剂发挥作用。因此，本发明的复制抑制剂不仅对属于玉米线条病毒属的病毒的代表性病毒WDV感染，而且对属于玉米线条病毒属的其它病毒也可发挥高度有效性，因而作为针对属于玉米线条病毒属的多种病毒的防除方法极其有用。
【专利附图】

【附图说明】
[0024][图1]示出锌指基序和DNA的结合方式的图。
[0025][图2]双生病毒的复制步骤的示意图。
[0026][图3]示出双生病毒和TYLCV的包含关系的图。
[0027][图4]示出TYLCV的茎环区的图。
[0028][图5]示出包含于双生病毒中的数种病毒的茎环区同源性的图。
[0029][图6]示出只以TYLCV为靶标的复制抑制剂的实例(上半部分)和以多种双生病毒为靶标的复制抑制剂的实例(下半部分)的图。
[0030][图7]示出TYLCV专用AZP-2的制作步骤的方案。
[0031][图8]示出双生病毒通用AZP-3的制作步骤的方案。
[0032][图9]示出通过凝胶移位试验评价TYLCV专用AZP-2对靶标DNA序列的结合能力的结果的图。
[0033][图10]示出凝胶移位试验评价双生病毒通用AZP-3对靶标DNA序列的结合能力的结果的图。
[0034][图11]示出为了比较而通过凝胶移位试验评价R印N对靶标DNA序列的结合能力的结果的图。
[0035][图12]示出GST-AZP(AZP-2)抑制R印切断复制起点的活性的图。泳道I表示底物DNA、泳道2表示切断产物标志物，泳道3表示用2 μ M GST-Rep进行切断。
[0036][图13]示出GST-AZP(ΑΖΡ-3)抑制R印切断复制起点的活性的图。示出GST-R印浓度2 μ Μ、反应温度25°C、反应时间30分钟下的切断物。
[0037][图14]示出PUC35S0-TYLCV3/4/6的制作方法的图。35S:来自花椰菜花叶病毒的启动子；NLS:核定位信号；Ω:用于提高翻译效率的5’-前导序列；N0ST:终止子；TYLCV3/4/6:与所有TYLCV中的共有碱基序列结合的AZP(识别序列为5’ -GGCCATCCGTATAATATTACCGGATGGCCGC-3’)。
[0038][图15]示出转化用APZ表达质粒的制作方法的图。N0S:正缬氨酸合成启动子(来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) ) ；NPT2:卡那霉素抗性基因；⑶S:β -半乳糖苷酶基因；RB (右边界)和LB (左边界):约25bp的重复序列(该序列之间的DNA区转移至植物基因组中)。
[0039][图16]示出转化体Tl的插入基因的结构、以及用于检测卡那霉素抗性基因和AZP基因的PCR引物组的图。
[0040][图17]示出检测转化体Tl的卡那霉素抗性基因和AZP基因的结果的图。泳道I~4表示使用由各Tl植物提取的DNA、N表示使用由野生型番茄提取的DNA、P表示使用转化中所用的双元载体(binary vector),分别进行PCR的结果。
[0041][图18]示出AZP表达盒全部区域中的插入基因的结构、以及用于确认插入基因组的引物组的图。
[0042][图19]示出通过PCR确认AZP基因插入在导入AZP-2而得的T2植物中的结果的图。为了检测AZP表达盒，泳道I~8表示使用由各Tl植物提取的DNA、P表示使用转化中所用的双元载体，分别进行PCR的结果。
[0043][图20]示出对于导入AZP-2而得的T2植物，通过PCR鉴定AZP插入基因的拷贝数的结果的图。泳道I~18示出使用由来自特定转化体Tl的T2植物提取的DNA、N示出使用由野生型番茄提取的DNA、P示出使用转化中所用的双元载体，分别进行PCR的结果。
[0044][图21]示出确认AZP在导入AZP-2而得的T2植物中的表达的结果的图。通过利用抗HA抗体的蛋白质印迹法，由图20所示的T2植物的叶提取液中检出了 AZP。图中的泳道编号与图20中对应。
[0045][图22]示出对于导入AZP-2而得的T3植物，通过PCR鉴定AZP插入基因的纯合T2品系的结果的图。泳道I~16示出使用由来自特定T2品系的T3植物提取的DNA进行PCR的结果。将在全部T3个体中确认了 AZP插入基因的该T2植物作为纯合进行筛选。
[0046][图23]示出确认AZP在导入AZP-2而得的T3植物中的表达的结果的图。泳道I~4是使用来自T3植物的叶的提取液、N是使用来自野生型番茄的叶的提取液、和P是使用来自所用品系的T2植物的叶的提取液，分通过利用抗HA抗体的蛋白质印迹检出了 AZP。
[0047][图24]示出通过土壤杆菌接种法(Agro-1noculation)向野生型Micro-Tom番爺注入具有TYLCV基因组的土壤杆菌，使TYLCV感染成立的结果的图。在生长后的个体(右)中明确观察到TYLCV感染的特征性症状即叶的卷曲或黄化，同时可见明显的生长抑制。
[0048][图25]示出对导入AZP-2而得的T3植物进行TYLCV感染试验的结果的图。转化体中未见感染症状。
[0049][图26]示出由感染病毒30天后的AZP-2转化番茄回收叶，使用TYLCV检测用引物进行PCR的结果的图。
[0050][图27]示出使TYLCV感染由导入AZP-3制作的Tl植物的I个个体得到的T3植物的结果的图。
[0051][图28]示出在AZP-3的转化体中未检出病毒DNA的图。
[0052][图29]示出小麦萎缩病病毒(WDV)的突变体的图。[0053][图30]示出针对含有WDV的属于玉米线条病毒属的病毒的3种复制抑制剂的靶标位点的图。AZPll和AZP13设计为识别正义链，AZP12基于反义链侧的序列设计(实施例1)。[0054][图31]示出AZP-1l的制作步骤的图。
[0055][图32]示出AZP-12的制作步骤的图。
[0056][图33]示出AZP-13的制作步骤的图。
[0057][图34]示出用于制备具有AZP-1l和AZP-12表达盒的双元载体的前体载体的结构的图。
[0058][图35]示出用于扩增泛素启动子和AZP的片段的引物组的图。
[0059][图36]示出用PCR扩增泛素启动子和AZP的片段的结果的图。
[0060][图37]示出用于扩增含AZP的区域的引物组的图。
[0061][图38]示出AZP在导入AZPlI和AZP12的Tl个体中强表达的结果的图。
[0062][图39]示出使WDV感染导入AZPll或AZP12基因制作的Tl转化体后通过PCR检测WDV基因组DNA的结果的图。
【具体实施方式】
[0063]本发明的复制抑制剂是针对属于双生病毒科的玉米线条病毒属的病毒的复制抑制剂，其特征在于，含有锌指蛋白并且可以抑制茎环结构的形成，所述锌指蛋白可以与上述病毒的茎环区的全长DN A或选自该全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合。 [0064]本说明书中所用的术语“双生病毒”意指感染植物的DNA病毒，其是具有I个或2个单链环状DNA的病毒，该术语的含义在例如化学与生物，41，pp.311-317，2003等中有具体说明。根据基因组结构、宿主范围和媒介昆虫的种类，双生病毒分类为以下4个属，即，玉米线条病毒(Mastrevirus)属、甜菜曲顶病毒(Curtovirus)属、番爺伪曲顶病毒(Topocuvirus)属、和菜豆金色花叶病毒(Begomovirus)属,本发明的复制抑制剂可以以它们之中尤其是属于玉米线条病毒属的任意病毒为靶标。属于各属的病毒的基因组构成在上述出版物(化学和生物，41，pp.311-317，2003)的图2中具体例示。此外，属于双生病毒的病毒及其缩写符号在例如国际公开W02004/101798中公开有详细的表单。通过参照，将国际公开W02004/101798的全部公开内容包含作为本说明书的公开。双生病毒中除了已知的双生病毒之外，还包含未知的双生病毒和已知的双生病毒变异而成的新种双生病毒等。
[0065]作为双生病毒中包含的病毒，可举出例如:MSV(玉米条纹病毒(Maize streakvirus))、WDV (小麦萎缩病病毒(Wheat dwarf virus))、BeYDV (菜豆黄矮病毒(Beanyellow dwarf virus))等属于玉米线条病毒属的病毒，BCTV(甜菜曲顶病毒(Beet cury topvirus))等属于甜菜曲顶病毒属的病毒,TPCTV(番爺伪曲顶病毒(Tomato pseudo-cury topvirus))等属于番爺伪曲顶病毒属的病毒，以及BGMV(菜豆金色花叶病毒(Bean goldenmosaic virus))、ACMV (非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus))、SLCV (南瓜曲叶病毒(Squash leaf curl virus)) > TGMV (番爺金色花叶病毒(Tomato golden mosaicvirus))、和TYLCV(番爺黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus))等属于菜豆金色花叶病毒属的病毒，但并不限定于此。本发明的复制抑制剂提供为以MSV (玉米条纹病毒)、WDV (小麦萎缩病病毒)、BeYDV(菜豆黄矮病毒)等属于玉米线条病毒属的病毒为对象的复制抑制剂，其中，WDV是特别优选的对象。
[0066]属于菜豆金色花叶病毒属的病毒中，已知作为复制抑制剂的结合部位的茎环区高度保守。作为属于菜豆金色花叶病毒属的病毒，可举出例如:TYLCCNV、TYLCGV、TYLCMalV、TYLCSV、TYLCTHV、TYLCV、ACMV、BGMV、CaLCuV、ToCMoV、TGMV、ToGMoV、ToMHV、ToMoTV、ToMoV, ToRMV, ToSLCV、ToSRV、棉花曲叶(CLCrV、CLCuAV, CICuGV、CLCuKV, CLCuMV,CLCuRV)、东非木薯花叶(EACMCV、EACMMV, EACMV、EACMZV)、马铃薯黄色花叶(PYMPV、PYMTV、PYMV)、南瓜曲叶(SLCCNV、SLCV, SLCYV)、甘薯曲叶(SPLCGV、SPLCV)、烟草曲叶(TbLCJV、TbLCKoV、TbLCYNV、TbLCZV)、番茄曲叶(ToLCBV、ToLCBDV、ToLCGV、ToLCKV、ToLCLV、ToLCMV, ToLCNDV, ToLCSLV, ToLCTffV, ToLCVV, ToLCV)等，但并不限定于此。以下，为了说明本发明复制抑制剂的设计手法和作用机制等，作为参考，有时特别会提及属于菜豆金色花叶病毒属的TYLCV。图3示出双生病毒和TYLCV和WDV的包含关系。
[0067]本发明的复制抑制剂含有锌指蛋白，并且具有抑制茎环结构的形成的作用，所述锌指蛋白可以与属于玉米线条病毒属的病毒的茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合。对于双生病毒的“茎环区”的术语，若以例如属于菜豆金色花叶病毒属的TYLCV为例进行说明，则茎环区是由彼此互补地结合的2个茎区(分别由11个碱基组成的区域)、和存在于其间并形成环的环区(由11碱基组成的区域)组成的33个碱基的区域。已知TYLCV存在多种株，在所有TYLCV中，茎环区的碱基序列高度保守。图4示出TYLCV的茎环区。该茎环区在属于菜豆金色花叶病毒的其它病毒中也高度保守，例如，在两种BGMV的DNA的CR (共同区)上存在由34个碱基组成的茎环区，该碱基序列与属于菜豆金色花叶病毒的其它病毒的茎环区的碱基序列的同源性极高。
[0068]本说明书中，茎环区的碱基序列“高度保守”意指所要比较的碱基序列的同源性在80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选97%以上、特别优选99%以上。对于属于玉米线条病毒属的病毒也一样，通常也存在与属于菜豆金色花叶病毒属的病毒相比，茎环区的同源性 低的情形，但属于玉米线条病毒属的病毒中的茎环区的碱基序列也保守，同源性通常在60%以上、优选70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上、特别优选95%以上。进而，对于属于双生病毒的其它属的病毒，茎环区也高度保守。图5示出包含于双生病毒中的数种病毒的茎环区同源性。
[0069]本发明的复制抑制剂可以设计为，与如上所述在属于玉米线条病毒属的病毒中保守的茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合，该特异性结合的结果是可以抑制茎环结构的形成。本发明的复制抑制剂还可以设计为，除了与茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合的性质之外，还与连接至茎环区DNA的上游和/或下游的侧翼区的DNA特异性结合，这种方式在本发明中是优选方式。
[0070]特别优选的方式之一是(a)复制抑制剂，其含有可以与连续DNA结合的单一的锌指蛋白，所述连续DNA由选自属于玉米线条病毒属的病毒的茎环区的全长DNA的I处的部分DNA、和结合于该DNA并选自侧翼区的I处的DNA构成。作为该特别优选的方式的复制抑制剂的具体例，在本说明书的实施例1中公开有AZP-1l和12(图30)。此外，在特别优选的其它方式中，为(b)复制抑制剂，其含有锌指蛋白，所述锌指蛋白与选自茎环区的该全长DNA的I处的部分DNA特异性结合。作为该特别优选的方式的复制抑制剂的具体例，在本说明书的实施例1中公开有AZP-13(图30)。进而，还优选(c)上述复制抑制剂，其含有锌指蛋白，该锌指蛋白是通过接头将2个以上各自可以与选自由茎环区和结合于该茎环区的周边区域构成的DNA的2处以上的部分DNA结合的锌指蛋白结合而成。为了通过特异性结合抑制茎环结构的形成，只要本发明的抑制剂可与选自茎环区的DNA结合、或与选自茎环区的DNA以及选自该茎环区的周边区域即侧翼区的DNA结合，并将病毒DNA的双链结构稳定化即可，通过基于茎环区和根据需要的其周边区域的碱基序列，选择适当的锌指结构域，可以设计抑制属于玉米线条病毒属的病毒的茎环结构的形成的锌指蛋白。
[0071]锌指蛋白中所含的锌指结构域可使用识别密码表(非简并识别密码表)，设计成可识别特定的碱基序列。本说明书中，锌指结构域意指构成存在于锌指蛋白上的DNA结合部位的结构域，有时也简称为“指”。代表性的锌指蛋白具有2个、3个、4个、6个、或10个左右的锌指结构域。识别密码表和识别特定碱基序列而特异性结合的锌指蛋白的设计方法记载于例如日本特表2004-519211号公报中。通过参照，将上述专利公报的全部公开内容包含于本说明书的公开中。此外，也可以参照Biochemistry, 41, pp.7074-7081, 2002等。如上所述，属于玉米线条病毒属的病毒的基因组DNA的茎环区的碱基序列信息可容易获得，本领域技术人员可容易地设计制造至少可以与茎环区的全长DNA或选自全长DNA的I或2处以上的部分DNA特异性结合的锌指蛋白。
[0072]为了参考，例如，在实施例的参考例I中示出只以TYLCV为靶标的复制抑制剂的设计方法。设计可以与包含在TYLCV之间高度保守的茎环区DNA (33个碱基)的全长或大致全长的DNA结合的锌指蛋白即可，通过使用选自这种锌指蛋白的I种锌指蛋白来作为本发明的复制抑制剂，可以抑制全部的TYLCV的复制。作为这种锌指蛋白，可以设计例如含有10个锌指结构域的锌指蛋白。能够将上述方法适宜应用于以TYLCV以外的双生病毒家族为靶标的复制抑制剂的设计，这是本领域技术人员容易理解的。
[0073]此外，为了参考，在实施例的参考例2中也示出了以TYLCV之外的包含属于菜豆金色花叶病毒属的病毒的多种双生病毒为靶标的复制抑制剂的设计方法。例如，可从茎区的全长DNA中选择作为靶标双生病毒中的共同序列的2处以上的部分DNA，设计与这些部分DNA结合的单一的锌指 蛋白，或设计分别与这些部分DNA结合的2个以上的锌指蛋白，将这些2个以上的锌指蛋白用适当的接头，例如，肽接头等分别连接即可。接头除了使用氨基酸残基数为I~40个、优选I~20个、进一步优选I~10个左右的肽接头之外，例如还可以使用亚烷基链或聚乙二醇链等合成接头或糖链等。在从茎区的全长DNA中选择2处以上的部分DNA时，优选选择为不含有在作为靶标的包括属于菜豆金色花叶病毒属的病毒的多种双生病毒的茎区中为非共有序列的部分DNA，通常期望选择位于该非共有序列的上游和下游的共有序列的DNA来作为部分DNA。
[0074]作为参考，只以TYLCV为靶标的复制抑制剂的实例、和以包含属于菜豆金色花叶病毒属的病毒的多种双生病毒为靶标的复制抑制剂的实例分别示于图6。图中，上侧为只以TYLCV为靶标时的实例，下侧为以包含属于菜豆金色花叶病毒属的病毒的多种双生病毒为靶标时的实例。
[0075]例如，(a)只以TYLCV为靶标的复制抑制剂可举出具有序列表的序列编号I所示的氨基酸序列的复制抑制剂，以及以包含属于菜豆金色花叶病毒属的病毒的多种双生病毒为靶标的复制抑制剂可举出具有序列编号2所示的氨基酸序列的复制抑制剂。此外，(b)作为由在序列编号I或2所限定的氨基酸序列中具有I至数个、优选I~5个左右氨基酸的缺失、置换和/或添加的氨基酸序列组成的复制抑制剂的与由序列编号I或2所限定的氨基酸序列组成的蛋白实质上具有相同的复制抑制作用的蛋白也可用作复制抑制剂。进而，(C)与序列编号I或2所限定的氨基酸序列具有70%、优选80%、进一步优选90%以上的同源性，与由序列编号I或2所限定的氨基酸序列组成的蛋白实质上具有相同的复制抑制作用的蛋白也可以用作复制抑制剂。
[0076]作为用于制备只以TYLCV为靶标的复制抑制剂的实例、和以包含属于菜豆金色花叶病毒属的病毒的多种双生病毒为靶标的复制抑制剂的核酸，除了编码上述(a)的蛋白的DNA (序列表的序列编号3或4所示的碱基序列所限定的DNA)之外，可使用含有编码上述(b)或(c)的蛋白的DNA的核酸。作为编码上述(b)或(c)所示蛋白的DNA，例如，包含可在严格条件下与由序列编号3或4所示碱基序列限定的DNA杂交的DNA等。作为这样的DNA，可举出例如:使用DNA作为探针，在集落杂交法、噬菌斑杂交法、或DNA印迹杂交法中，使用固定有来自集落或噬菌斑的DNA或DNA片段的滤器，在0.7~1.0 M左右的NaCl存在下、在65°C下进行杂交，然后使用0.1~2 X SSC溶液(I X SSC溶液含有150 mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)在65°C条件下洗涤滤器，可由此鉴定的DNA等。例如，可优选使用与作为探针使用的DNA的碱基序列具有70%以上、优选80%以上、进一步优选90%以上、特别优选95%以上、最优选98%以上的同源性的DNA。
[0077]本发明所提供的针对属于玉米线条病毒属的病毒的复制抑制剂的设计可如下所述进行。作为属于玉米线条病毒属的病毒的代表例，可举出WDV，但对于WDV，已知图29所示的突变体，茎环区高度保守，进而分别连接至茎区的下游和上游的周边区域(侧翼区)也高度保守(关于WDV的基因组序列和突变体，可参照Plant Pathology, 57，pp.838-841，2008; Plant Pathology, 58，pp.1161-1169，2009; Virus genes, 34，pp0.359-366，2007等)。本发明的复制抑制剂的设计中要考虑的周边区域的碱基数，例如从茎区的末端起为200个以下，优选为100个以下，进一步优选为50个以下，特别优选为30个以下左右。进而，这些区域在属于玉米线条病毒属的其它病毒中也保守，该区域的同源性通常在60%以上、优选70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上、特别优选95%以上。
[0078]因此，为了抑制WDV的复制，可以使用与WDV的茎环区特异性结合的锌指蛋白，或者使用与WDV的茎环区的一部分结合、同时与连接至WDV的茎区的上游和/或下游的DNA特异性结合的锌指蛋白。作为一例，图30示出针对含有WDV的属于玉米线条病毒属的病毒的本发明的复制抑制剂的靶标位点。为了抑制WDV的复制，除了与正义链特异性结合的锌指蛋白之外，还可以使用与反义链特异性结合的锌指蛋白。
[0079]本说明书的实施例1中，作为识别正义链的锌指蛋白，具体公开有AZPll和AZP13，作为基于反义链侧的序列设计的锌指蛋白，具体公开有AZP12。此外，AZP11、AZP12和AZP13的设计方法分别示于图31、图32、和图33，AZPlU AZP12和AZP13的氨基酸序列分别示于序列表的序列编号5、6、和7。作为本发明的复制抑制剂，也可以使用(d)作为由在序列编号5、6或7所限定的氨基酸序列中具有I至数个、优选I~5个左右氨基酸的缺失、置换、和/或添加的氨基酸序列组成的复制抑制剂的、具有与由序列编号5、6、或7所限定的氨基酸序列组成的蛋白实质上相同的针对属于玉米线条病毒属的病毒的复制抑制作用的蛋白。进而，还可以使用(e)与由序列编号5、6、或7所限定的氨基酸序列具有70%、优选80%、进一步优选90%以上的同源性，且具有与由序列编号5、6、或7所限定的氨基酸序列组成的蛋白实质上相同的复制抑制作用的蛋白来作为本发明的复制抑制剂。
[0080]作为用于制备针对属于玉米线条病毒属的病毒的复制抑制剂的核酸，例如，除了编码上述AZP11、AZP12和AZP13的DNA (分别由序列表的序列编号8、9和10所示碱基序列所限定的DNA)之外，还可使用包含编码上述(d)或(e)的蛋白的DNA的核酸。作为编码上述(d)或(e)所示蛋白的DNA，例如，包含可在严格条件下与由序列编号8、9和10所示碱基序列所限定的DNA杂交的DNA等。作为这样的DNA，可举出例如:使用DNA作为探针，在集落杂交法、噬菌斑杂交法、或DNA印迹杂交法中，使用固定有来自集落或噬菌斑的DNA或DNA片段的滤器，在0.7~1.0 M左右的NaCl存在下、在65°C下进行杂交，然后使用0.1~2 X SSC溶液(I X SSC溶液含有150 mM氯化钠和15 mM柠檬酸钠)在65°C条件下洗涤滤器，可由此鉴定的DNA等。例如，可优选使用与作为探针使用的DNA的碱基序列具有70%以上、优选80%以上、进一步优选90%以上、特别优选95%以上、最优选98%以上的同源性的DNA。
[0081]本发明的复制抑制剂以上述锌指蛋白或编码该锌指蛋白的核酸的形式提供，通过将本发明的复制抑制剂直接作为农药对植物施用，可以进行针对属于玉米线条病毒属的病毒的感染防除。本发明的复制抑制剂的施用方法没有特别限定，例如，可以使用本领域周知的制剂用添加物来制为农药用组合物。含有蛋白或核酸作为有效成分的农药用组合物在本领域是已知的，可采用适宜的方法制备农药用组合物。可举出例如:使用引入了上述核酸的质粒等载体，将上述核酸导入植物细胞内并瞬时转化植物的方法；或者使用载体将上述核酸引入植物基因组的方法等，但并不限于该方法。本发明的方法中可利用的载体也包含感染植物的病毒载体。
[0082]农药用组合物的形态没有特别限定，只要是本领域可利用的形态则可采用任何形态。例如，可以使用乳剂、溶液剂、油剂、水溶剂、水合剂、流动剂(7 口 7 7''^ )、粉剂、微粒剂、颗粒剂、气溶 胶、熏蒸剂、或糊剂等形态的组合物。农药用组合物的制造方法也没有特别限定，可适当采用本领域技术人员可利用的方法。此外，也可以将其它抗病毒剂、杀虫剂、杀菌剂、杀虫杀菌剂、除草剂等其它农药的有效成分配合于农药用组合物中。
[0083]根据本发明，提供可表达上述复制抑制剂的转化植物。本发明中作为转化对象的植物没有特别限定，除了植物体整体之外，还可以是植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、柵状组织、海棉状组织等)、或植物培养细胞的任一种。植物的种类没有特别限定，可以以任意植物为对象，优选以属于玉米线条病毒属的病毒感染成立的植物种类为对象。
[0084]更具体地，作为植物种类，可举出例如:属于锦葵科(秋葵等)、藜科(甜菜、菠菜等)、十字花科(芜菁、花椰菜、青花椰菜、卷心菜、油菜( = t )、紫罗兰、萝卜、青梗菜、大白菜、山嵛菜等)、鸢尾科(鸢尾、唐菖蒲、小苍兰等)、白花丹科(不凋花(Statice)等)、禾本科(水稻、结缕草、玉米、麦等)、苦苣苔科(Gesneriaceae)(非洲堇等)、五加科(土当归等)、葫芦科(南瓜、黄瓜、越瓜、西瓜、甜瓜等)、柿树科(柿子等)、菊科(非洲菊、菊、金盏花、秋英属、牛蒡、瓜叶菊、茼蒿、大丽花、向日葵、蜂斗菜、雏菊、六月菊、莴苣等)、胡桃科(胡桃等)、桑科(无花果、桑树、蛇麻草等)、罂粟科(冰岛罂粟等)、玄参科(金鱼草等)、报春花科(仙客来、报春花等)、天南星科(筠篛、芋头等)、仙人掌科(仙人掌等)、唇形科(一串红、紫苏等)、秋海棠科(秋海棠属等)、姜科(姜、囊荷等)、睡莲科(莲藕等)、堇菜科(三色堇等)、伞形科(水芹、旱芹、胡萝卜、欧芹、鸭儿芹等)、金粟兰科(草珊瑚等)、杜鹃花科(浆果类等)、山茶科(茶等)、大戟科(一品红等)、茄科(马铃薯、烟草、番茄、茄子、柿子椒、狮子菜椒等)、石竹科(康乃馨、多年生满天星等)、蔷薇科(杏、草莓、梅、樱桃、李、梨、蔷薇、枇杷、桃、珍珠绣线菊、苹果、西洋梨等)、旋花科(牵牛花、甘薯等)、栊牛儿苗科(天竺葵等)、葡萄科(葡萄等)、山毛榉科(栗等)、牡丹科(牡丹、芍药等)、猕猴桃科(猕猴桃等)、豆科(红豆、扁豆、菜豆、毛豆、豌豆、香豌豆、蚕豆、大豆、花生等)、芸香科(柑橘等)、薯蓣科(山药等)、虎耳草科(兰花等)、百合科(芦笋、洋葱、郁金香、韭菜、蒜、葱、风信子、百合、Il头、冬葱等)、兰科(卡特兰属、绣球花、蝴蝶兰等)、龙舌兰科(龙血树类等)、龙胆科(洋桔梗、龙胆等)、禾本科(小麦、水稻等)的植物，但并不限定于此。
[0085]优选可举出例如:番茄、胡椒、烟草、南瓜、木薯、甘薯、棉花、甜瓜、马铃薯、大豆、葡萄、玉米、小麦、水稻、甘蔗、豆、甜菜、西瓜、秋葵、树薯等，但并不限定于此。进一步优选的植物是小麦或水稻等，特别优选的植物是小麦。
[0086]作为 要转化的植物源，可举出:原生质体、种子、萌芽、苗、愈伤组织、培养细胞、植物体等，并无特别限定。根据对象植物的种类，本领域技术人员可以选择适当的部位进行转化。
[0087]用于转化的载体的种类没有特别限定，优选载体中含有用于使编码上述锌指蛋白的基因表达的启动子和/或增强子序列。作为启动子和增强子序列，只要是在植物细胞中可使上述基因表达即可，其种类没有特别限定，可使用任意的启动子和增强子序列。例如，可使用含有如土壤杆菌或根瘤菌的植物细胞内表达的基因、来自植物体、植物病毒或细菌的启动子等。作为启动子，可使用例如:来自根癌土壤杆菌的T-DNA的启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子、NOS启动子、核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisc0)启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、来自植物的肌动蛋白或组蛋白等的启动子/增强子等，但并不限定于此。
[0088]载体中可以含有编码各种抗生素抗性基因或其它标记基因作为筛选标记基因的序列。作为标记基因的实例，可举出例如:抗大观霉素基因、链霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、抗抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)的除草剂的抗性基因、抗抑制谷氨酰胺合成酶的除草剂的抗性基因(例如bar基因)、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、荧光素酶基因等，但并不限定于此。
[0089]为了提高基因表达效率，例如，有时也优选在基因的编码区的核苷酸编码区的3’末端包含Poly (A) +序列。作为Poly (A) +序列，可使用来自各种植物基因或T-DNA的序列，但并不限定于此。也可将对使基因高水平表达有用的其它序列、例如特定基因的内含子序列、5’非翻译区的序列等导入载体。此外，为了促进向核内的转运，还优选引入核定位信号(NLS)等。
[0090]对于高等植物的基因表达有用的载体是本领域所周知的，可使用任意的载体。例如，将载体导入植物细胞时，作为可将载体DNA的一部分引入宿主植物的基因组的载体，除了来自根癌土壤杆菌的Ti质粒的载体之外，还可举出:来自Ti质粒的KYLX6、pKYLX7、ρΒΙ101、ρΒΗ2113、ρΒΙ121等，但并不限定于此。
[0091]对于表达载体，可采用用于将外源性基因导入植物细胞的公知方法，例如基因枪法、电穿孔法、聚乙二醇(PEG)法、磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、显微注射、脂质体转染法、以及土壤杆菌法等微生物媒介转染法等，导入所需的植物细胞中。其中优选基因枪法、电穿孔法、聚乙二醇法和土壤杆菌法等，可特别优选采用土壤杆菌法(Methods Mol.Biol, 82，pp.259-266，1998)。有时也可以通过采用双成分载体(双元载体)法高效地进行基因重组。
[0092]应予说明，表达载体的构建方法以及植物的转化方法在本说明书的实施例中进一步具体说明，因此，本领域技术人员可参照上述一般说明和实施例的具体说明，通过将载体的种类或要导入载体中的序列、转化法等进行适当变化或改变，可以转化所需植物，使其表达本发明的复制抑制剂。
实施例
[0093]以下通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不限于下述实施例。
[0094]参考例I 1.材料与方法 (I)AZP的设计
基于日本特表2004-519211号公报所记载的识别密码表设计分别识别以下两种DNA区的锌指蛋白(以下，在实施例中简称为“AZP”)。
a.TYLCV中保守的茎环区
b.双生病毒中保守的茎环区
在图6的上半部分所示的AZP(TYLCV专用)中，连续地连接10个锌指结构域。图6的下半部分所示的AZP(双生病毒通用)中，是将识别茎环区内的、双生病毒中保守的两个区的2种AZP用短肽连 接。
[0095](2) AZP表达质粒的制作
按照图7所示方案制作TYLCV专用AZP (以下，称为“AZP-2”)。首先通过PCR合成分别连接有3个锌指的基因，将各基因克隆至大肠杆菌表达载体的pET-2la (Novagen社)的BamHI/Hind III位点，然后确认所得质粒的碱基序列，由此得到pET-TYLCV-3、pET_TYLCV_4、和pET-TYLCV-5。接着通过PCR扩增pET_TYLCV_3和pET_TYLCV_4内的3指AZP的基因并连接，最终得到PET-TYLCV3/4。制作识别5’ -TATA-3’的锌指基因，按照上述方法与pET_TYLCV5内的3指AZP基因连接，由此制作pET-TYLCV6。最后通过PCR，由pE_TYLCV3/4和pET_TYLCV6分别扩增6指AZP基因和4指AZP基因并连接，由此制作识别在形成茎环区的序列的33个碱基中的31个碱基的AZP-2表达用质粒(pET-TYLCV3/4/6)。
[0096]按照图8所示方案制作双生病毒通用AZP(以下称为“AZP-3”)。首先，为了引入识别在茎环区内的、双生病毒中保守的2个区的2种AZP基因和接头肽基因，首先制作前体质粒(pET-MCS)。通过PCR，由pET-TYLCV3/4扩增识别双生病毒中保守的较长区的6指AZP基因，克隆至pET-MCS，由此制作pET-TYLCV3/4-MCS。接着，通过PCR由pET_TYLCV5扩增识别双生病毒中保守的较短区的3指AZP基因，克隆至pET-TYLCV3/4-MCS，由此制作表达具有6个氨基酸作为接头肽的AZP-3的质粒(pET-TYLCV3/4-MCS-TYLCV5)。
[0097](3) AZP 的表达
用AZP表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，将所得转化体在含有氨苄青霉素的LB培养基中于37°C下培养，在0D_达到0.6-0.7时添加IPTG，使终浓度为I mM，诱导目标蛋白的表达。进一步培养3小时，然后通过离心回收大肠杆菌，在蛋白纯化之前在-80°C下保存。
[0098](4) AZP 的纯化
各AZP按照基本相同的方法纯化。向在-80°C下保存的大肠杆菌中加入IOml裂解缓冲液(100 mM Trs-HCl、100 mM NaCl、0.I mM ZnCl2,5 mM DTT、pH 8.0)，重复 3 次冷冻和融解，使大肠杆菌的细胞壁容易破坏。接着加入到超声波破碎机中，破碎大肠杆菌，然后通过离心回收含有目标蛋白质的上清。将该上清加载于阳离子交换树脂的Biorex-70 (Bio-Rad制造)中，使目标蛋白质吸附于树脂，然后用洗涤缓冲液(50 mM Trs-HCl,50 mM NaCU0.1 mMZnCl2、0.2 mM DTT,pH 8.0)充分洗涤。接着用洗脱缓冲液(50 mM Trs-HCl,300 mM NaCU0.1mMZnCl2、0.2mMDTT、pH8.0)洗脱目标蛋白质。只收集含有目标蛋白质的级分，用超滤膜浓缩，然后加入等量的甘油，进行搅拌后，在_80°C下保存。AZP纯度通过SDS-PAGE上的考马斯蓝染色的条带的量来判断。各蛋白质的浓度使用Protein Assay ESL(Roche制造)来确定。
[0099](5) RepN表达质粒的制作
R印N是病毒复制蛋白R印的N末端区部分(191个氨基酸残基)，具有DNA结合能力。为了应用于AZP抑制R印与同向重复序列结合的试验，按照以下方法制备R印N。使用从受感染的番茄中回收的TYLCV基因组，通过PCR，由TYLCV基因组扩增R印N基因，与AZP的情形同样，克隆至pET-21a的BamH I/Hind III位点。通过确认所得质粒的碱基序列，制作了RepN表达用的质粒(pET-RepN)。
[0100](6) RepN蛋白的表达和纯化
RepN的表达与AZP表达的情形同样进行，获得足够量的表达。所得大肠杆菌在进行蛋白质纯化之前保存于_80°C。R印N的纯化与AZP的情形同样进行。在使用Biorex-70的离子交换色谱中，用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl、250mMNaCl、0.2mMDTT、pH8.0)洗脱，由此获得高纯度的R印N。
[0101](7) AZP和R印N对复制起点的结合能力的评价
各蛋白质对靶DNA序列的结合能力的评价是通过凝胶移位试验进行的。制作含有靶DNA序列的DNA寡聚物，将5’末端用32P标记。接着，在含有标记DNA的结合缓冲液(10 mMTris-HCl、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.1 mMZnCl2、0.05% BSA、10% glycerol、ρΗ7.5)中添加规定量的蛋白质，在冰上反应I小时。将该反应物上样于6%非改性丙烯酰胺凝胶上，在4°C下电泳2小时(电泳缓冲液:45mM Tris-硼酸)。电泳后将凝胶置于色谱纸上进行干燥。在充分干燥后使其感光到X射线胶片，检测标记DNA的条带。游离DNA和与蛋白质的DNA复合体的量比为1:1时的蛋白质浓度相当于与靶DNA序列的解离常数。根据该蛋白质浓度进行AZP和R印N的结合能力的比较。
[0102](8) AZP抑制病毒复制蛋白切断的能力的评价 (a) Rep表达质粒的制作-1
在抑制切断的能力的评价中，具有切断活性的全长的Rep是必需的，因此进行了 Rep表达质粒的制作。与RepN表达质粒的制作同样地，Rep基因通过PCR由TYLCV基因组扩增，并克隆至pET-21a的BamH I/Hind III位点。确认所得质粒的碱基序列，由此制作了 Rep表达用的质粒(pET-Rep)。
[0103](b) Rep表达质粒的制作-2
如果是Rep单独，则在大肠杆菌破碎后可能无法以溶解的状态检测，因此，以与促进难溶的蛋白质溶解且纯化简便的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合体的形式制作R印。通过PCR,由GST融合蛋白表达用质粒(pET-41a，Novagen制造)扩增含有T7启动子和GST基因的DNA区，克隆至pET-R印的BamH I/Sph I位点。确认DNA碱基序列，由此制作GST-R印蛋白表达用的质粒(pET-GST-R印)。
[0104](C) GST-Rep融合蛋白的表达
用 pET-GST-Rep 分别转化三种大肠杆菌 BL21(DE3)、Rosetta2 (DE3) pLysS 和BL21-Codon-Plus(DE3)-RIL，与R印N蛋白表达时同样地，在37°C下用I mM IPTG诱导得到的各克隆表达。在各大肠杆菌中的表达量相同，但大肠杆菌破碎后的GST-Rep的溶解量是在BL21(DE3)中最高。因此，使用BL21(DE3)转化体进行30°C下的蛋白质表达。
[0105](d) GST-Rep 蛋白的纯化
将大肠杆菌沉淀悬浮于3mL裂解缓冲液(4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 137 mMNaCl, 2.7 mM KCl, pH7.3，0.1 mM ZnCl2, 5 mM DTT)中，进行超声处理。通过 SDS-PAGE 确认GST-Rep蛋白的溶解，然后离心，只取出上清。将预先用20倍量的IXGST-结合洗涤缓冲液(GST-Bind Wash Buffer)洗涤的GST结合树脂转移至15mL锥形管中，进一步用5mL I XGST-结合洗涤缓冲液(4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl,PH7.3)洗涤，以400Xg、25°C离心5分钟，小心除去上清。将含有超声处理后的GST-R印蛋白的上清用0.45 μ m膜滤器过滤，将所得滤液添加于进行了上述前处理的树脂中。在4°C下振荡过夜，使GST-AZP蛋白吸附于树脂上。将该树脂过柱，用洗涤缓冲液(4.3 mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1 mM ZnCl2)洗涤，然后用洗脱缓冲液(50 mMTris HCl, pH8.0, 0.1 mM ZnCl2, 10 mM还原型谷胱甘肽)洗脱。通过SDS-PAGE确认洗脱的各级分，收集含有GST-Rep蛋白的级分，通过超滤膜浓缩至总量为300 μ L。蛋白质浓度通过市售的试剂盒(ProteinAssayECL)确定。
[0106](e) GST-AZP融合蛋白的表达
制作AZP与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合体，使该GST-AZP基因位于T7启动子下游，将这样的表达载体导入大肠杆菌。将该大肠杆菌在120mL LB-Amp液体培养基中培养至OD600达到0.65~0.75。培养后添加IPTG，使终浓度为ImM，进一步培养3小时，由此诱导GST-AZP蛋白表达。将诱导后的大肠杆菌离心后回收，保存于-80 °C。GST-AZP蛋白的纯化按照与GST-Rep蛋白纯化同样的方法进行。
[0107](f)AZP抑制病毒复制蛋白切断的能力的评价
在含有由含R印结合位点的200个碱基对组成的标记DNA (5nM)的反应溶液(25 mMTris-HCl, pH7.5，75 mM NaCl, 2.5 mM DTT)中添加GST-AZP (或者为了进行性能比较试验而添加GST-R印N，或者为了进行对照试验而添加GST)，混合，在冰上静置30分钟。然后分别添加GST-Rep和MgCl2,使终浓度为2 μ M和5mM，然后在25°C下反应。30分钟后添加2 μ L
0.5Μ EDTA,使反应终止，进行苯酚处理和乙醇沉淀。用3 μ L加样缓冲液(80%甲酰胺、IOmMEDTA)溶解，将制作的样品在8%改性丙烯酰胺凝胶中进行电泳。
[0108]2.结果
(I) AZP对靶标DNA序列的结合能力的评价
通过凝胶移位试验评价纯化的AZP和RepN与祀DNA序列结合的能力。该试验中，在用32P标记的DNA中，以各种浓度添加蛋白质，进行结合反应，然后将游离DNA和与蛋白质的DNA复合体在非改性凝胶上分离。求出游离DNA和与蛋白质的DNA复合体的条带比为1:1时的蛋白质浓度(相当于解离常数)，此时可知，TYLCV专用的ΑΖΡ-2的解离常数为0.3~InM(图9)，双生病毒通用的AZP-3的解离常数为〈ΙΟηΜ(图10)。另一方面，ItepN的解离常数为30nM(图11)。由该试验确认到:所设计的AZP-2和AZP-3对靶DNA序列的结合力均比RepN强ο
[0109](2) AZP抑制病毒复制蛋白切断的能力的评价
如图12的泳道4~7所示，纯化的TYLCV专用的GST-AZP (AZP-2)可有效地抑制R印对复制起点的切断。其抑制效果依赖于AZP浓度，且在20 PM下观察到完全抑制。另一方面，在R印的显性失活体R印N中完全未见对切断的抑制(图12的泳道8~11)。RepN具有DNA结合结构域，当然DNA结合与要抑制的R印的完全相同。对于GST，如泳道12所见，完全未见切断抑制，由此也可确认:在泳道4~7中确认的GST-AZP的切断抑制活性全部来自于ΑΖΡ。此外，对于GST-AZP(ΑΖΡ-3)也同样地评价了切断抑制能力。其结果示于图13。
[0110]参考例2
1.材料与方法 (I)AZP转化番茄的制作 (a) AZP的植物用稳定表达载体的制作
将编码AFP-2的基因插入到植物基因组中是通过土壤杆菌法进行的。为了原生质体试验用，按照图 14 的方法，由 pUC35S0-MCS 制备 pUC35S0_TYLCV3/4/6，用 EcoR I 和 Hind III从该质粒中切出含有35S启动子-AZP基因-NOS终止子的区。将片段在琼脂糖凝胶上纯化，然后克隆至双元质粒PBI121的EcoR I/Hind III位点，得到pBI_0TYLCV3/4/6。通过测序确认碱基序列正确。对于AZP-3也进行同样的操作。
[0111](b)Micro-Tom 的育种
在72孔塑料托盘中装入栽培土，用喷壶轻轻打湿土壤，然后一个一个地播种Micro-Tom种子,在其上轻轻覆盖湿润的土,将全体用Saran Wrap覆盖。将该托盘在人工气候室(光期:25°C，16小时；暗期:22°C，8小时)中培养。在确认发芽时除去Saran Wrap，在同一条件下继续培养。播种后经过约2周后，将苗移栽至直径12cm的塑料花盆中，培养至回收种子。
[0112](c)Micro-Tom 的种的制备
回收红色成熟的Micro-Tom的果实，在其赤道线上用刀分成两部分，用抹刀将所有的种子回收至50ml塑料管中。用水轻轻洗涤，然后用1%盐酸水洗涤10分钟，使种子周围的明胶层溶解。接着用流水将种子洗涤10分钟，将多余的水分用纸巾吸取，然后在室温下风干2天。干燥的种子在4°C下保存。
[0113](d)基因导入Micro-Tom子叶
将10~20粒Micro-Tom种子用10%稀释的Haiter (花王制造)杀菌，然后用无菌水洗漆4次。将该种子播种于固定有播种用培养基(IXMurashige-Skoog(MS)培养基、15g/L蔗糖、3g/L脱乙酰吉兰糖胶)的苗木箱中，在25°C、16小时昼长条件下生长6天。将真叶达到数毫米左右的个体用于转化。
[0114]在进行土壤杆菌感染的前一天，将20 μ L用pB1-0TYLCV3/4/6转化的土壤杆菌C58ClRifR(GV2260)的甘油贮液接种于 2mL 的 LB 培养基(Kan 100mg/L、Amp 50mg/L)，在30°C下培养24小时。在感染当天，将ImL 土壤杆菌菌液取至Eppendorf管中，以5000rpm离心5分钟，收集菌体。将该菌体悬浮于40mL含有100 μ M乙酰丁香酮、10 μ M的巯基乙醇的MS培养基中。
[0115]用刀片切取Micro-Tom的子叶，自前端至一半附近切成两段。将这些子叶切片浸泡于上述土壤杆菌悬浮液中，静置10分钟使其感染。放在灭菌后的Kim纸巾(々A夕才^ )上，吸取多余的悬浮液，将叶置于共培培养基(1父15培养基、3(^/1蔗糖、38/1脱乙酰吉兰糖胶、1.5mg/L反式玉米素、40 μ M乙酰丁香酮、0.l%MES，pH5.7)。将盖子用外科胶带密封，用铝箔遮光，在25°C下培养。3~4天后，将感染的子叶切片转移至愈伤组织诱导培养基(I XMS培养基、3g/L脱乙酰吉兰糖胶、1.5 mg/L反式玉米素、100 mg/L Kan>667 mg/L安美汀(Augmentin)、0.1% MES, pH 5.7)。由感染了约2周的一部分切片中形成愈伤组织，也可见形成枝条。
[0116]每隔2周移种在新的愈伤组织诱导培养基中。由愈伤组织中切除形成了 3~4片叶的个体的子叶切片部分，转移至枝条诱导培养基(SIM培养基，将CM培养基的反式玉米素浓度降至1.0mg/L),促进枝条的生长。在枝条生长至I~2cm长度时,在枝条最下端将其从愈伤组织上切离，移种于生根培养基(RM培养基，1/2 XMS培养基、3g/L脱乙酰吉兰糖胶、50mg/L Kan、375mg/L安美汀、0.l%MES，pH5.7)。将在生根培养基中2周以内生根的个体的根切除，移种至苗木箱内固化的生根培养基中，进行生根的二次筛选。将在苗木箱中生根的个体转移至以下的驯化步骤。
[0117]对于在最初的生根培养基(平板)中2周以内未生根的个体，薄薄地切除切口，移种于新的生根培养基中，再次诱导生根。对于在苗木箱的生根培养基中可见生根的个体，为了使其结实获得种子而植于土壤。此时，要缓慢地降低湿度进行驯化，使植物不会因湿度环境等变化而枯死。具体来说，在苗木箱中加入湿润的土壤，在其中种植生根个体，使最初为高湿度状态，渐渐将盖子松开，缓慢降低湿度。将在苗木箱内用约I个月进行充分驯化的植物种植于盆中生长。
[0118]对于第二次的生根筛选之后的植物，通过PCR确认是否导入了目标基因。切取约5mm的I片真叶，通过CTAB法提取基因组DNA。使用最终悬浮于300 μ LTE中的基因组DNA溶液中的I μ L，通过PCR法检查基因导入。作为引物，设计使用使卡那霉素抗性基因(ΝΡΤ2基因)得到扩增的引物组、和使含有人工转录基因和NOS终止子的区得到扩增的引物组。
[0119](e)从转化体中提取蛋白
将转化植物的I~2cm的叶采集至微量管中。向其中加入液氮使其冷冻，使用匀浆杵细细粉碎。液氮气化后加入200 μ L SDS样品缓冲液(0.125Μ Tris-HCl (pH6.8)、4%SDS、20%甘油、0.01%BPB、10% 2-ME)，进一步磨碎。在95°C下保温10分钟，离心，然后将上清转移至新的微量管中。将其作为植物提取蛋白的样品。
[0120](f)蛋白质印迹
使用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶对提取的蛋白质中的IyL进行电泳。同时对作为分子量标记的Perfect Protein Western Marker (Novagen制造)进行电泳。将蛋白质由丙烯酰胺凝胶转印至PVDF膜，然后使用丽春红S确认蛋白质。将膜在封闭液(5%脱脂乳、0.05%吐温20，PBS)中振荡，然后使其与过氧化物酶标记-抗HA抗体反应。作为抗分子量标记的抗体，也同时使S-蛋白 HRP反应。使用ECL化学发光系统使X射线胶片感光，检测信号。由该信号的大小和信号强度验证在转化植物内是否有AZP表达。
[0121](2)病毒感染实验(a)病毒感染用质粒的制作
病毒感染是利用土壤杆菌的感染能力来进行。为了将具有2个复制起点的病毒基因组拷贝导入双元质粒，对于TYLCV和TYLCV-mild这两种，按照以下所示2个阶段进行目标质粒的制作。TYLCV-mild与TYLCV的不同在于Rep结合的同向重复序列不同，为了研究对双生病毒的通用性而使用。
[0122]通过PCR，由TYLCV的病毒基因组DNA扩增包含复制起点的0.5个拷贝份的DNA片段，克隆至双元质粒PBI121的EcoR I/Hind III位点，得到pBI_TYLCV(0.5)。通过测序确认碱基序列正确。在导入TYLCV的I个拷贝份的DNA片段之际，对用PCR扩增的DNA进行克隆时，必须确认所制作的质粒的碱基序列，但是由于目标质粒含有1.5个拷贝的病毒基因组，因此必然存在重复的DNA区，无法通过测序确认碱基序列正确。因此，一旦在克隆质粒pBluescript II KS+中引入I个拷贝份的病毒基因组，即确认全部碱基序列，然后不进行PCR而将用限制酶切出的DNA片段导入pBI_TYLCV(0.5)。
[0123]通过PCR，由TYLCV的病毒基因组DNA扩增包含复制起点的I个拷贝份的DNA片段，克隆至pBluescript II KS+的Pst I/Hind III位点,得到pBS-TYLCV。通过测序确认全部碱基序列正确。接着用BsrG I和Hind III从pBS-TYLCV切出病毒基因组I个拷贝份的DNA片段，在琼脂糖凝胶上纯化，然后克隆至pBI_TYLCV(0.5)的BsrG I/Hind III位点，最终得到目标质粒pB1-TYLCV (1.5)。对于TYLCV-mild也进行同样的操作，最终可得到目标质粒 PB1-TYLCV-mild(1.5)。
[0124](b)病毒感染用质粒的感染能力的确认
制作土壤杆菌C58ClRifR(GV2260)的感受态细胞。在该感受态细胞中导入所制作的具有1.5个拷贝的TYLCV基因 组或TYLCV-mild基因组的双元载体，制作土壤杆菌接种法用的土壤杆菌的甘油贮液，保存于_80°C。在对野生型番茄进行感染的前一天，将该甘油贮液接种于6mL的LB培养基(Kan 100mg/L、Amp 50mg/L),在3(TC下培养一昼夜。接着收集土壤杆菌，悬浮于ImL缓冲液中。将该悬浮液注入到播种后约10天的苗的子叶中，使其感染。感染后定期进行植物个体的观察以及叶中病毒DNA的检测。用于此目的的DNA样品的制作如上所述进行，使用对各TYLCV为特异性的引物组进行PCR，根据所得PCR产物的分析而在分子水平上评价病毒感染。
[0125](3) TYLCV感染抗性的评价
在来自转化体T3的苗中注入具有病毒双元载体的土壤杆菌的悬浮液，随时间变化用肉眼确认感染症状。此外，从感染的番茄的叶中提取DNA，按照前项的方法，通过PCR验证植物体内病毒是否增殖。
[0126]2.结果
(I)AZP转化番茄的制作
分别通过土壤杆菌向Micro-Tom番茄中导入AZP基因。将用图15所示的具有各AZP表达盒的双元载体转化的土壤杆菌感染子叶切片，导入基因。接着，使用含有卡那霉素的培养基诱导愈伤组织、枝条，接着诱导根。选择生根较深地伸入琼脂培养基的个体，由此，在诱导生根时进一步筛选转化体，驯化，然后移栽于土壤中，从而得到转化体。
[0127]通过PCR法确认了这些转化体Tl具有AZP基因。为了检测卡那霉素抗性基因和AZP基因，使用图16所示的PCR引物组(各图中以橙色和蓝色的箭头表示)进行PCR。如图17所示，在所得转化体中检出了两者的基因，确认转化操作顺利进行。为防止万一，还用其它的引物组确认了 AZP表达盒全部区插入到番茄基因组中(图18:用粉色箭头表示)。如图19所示，确认到从35S启动子至NOS终止子，AZP表达盒全部区均导入到植物基因组中。
[0128](2) T2和T3植物的制作和各品系的分析
对于所得Tl植物中的AZP基因的拷贝数，调查T2植物中插入了 AZP基因的个体的比例，通过卡方检验来鉴定。即，由各Tl品系回收T2种子，播种这些种子，通过PCR鉴定所得各T2个体中的AZP基因的有无。在导入AZP-2得到的T2植物中，各以一个品系为例示于图19。以图19为例，在由通过PCR法确定的Tl品系得到的T2植物的18个个体中，13个个体具有AZP基因，分离比为13:5。如果该Tl品系具有I个拷贝的AZP基因，则其分离比应该为3:1。因此，如果通过卡方检验假定为I个拷贝，则卡方值为0.074，P=0.01的临界值为6.63，因此该虚假设不能放弃。另一方面，如果假定插入了 2个拷贝，则卡方值为14.2，比临界值大，该虚假设可放弃。由以上验证结果可知，该Tl品系是单拷贝插入体。对其它的Tl个体也同样进行了单拷贝插入体的筛选(图20)。
[0129]进一步通过蛋白质印迹确认各方法的转化体中AZP的表达。在各方法用的AZP表达盒中，预先加有HA附加表位，使得通过使用抗HA抗体的蛋白质印迹法，可以验证转化体中AZP蛋白的表达。如图21所示，对于导入了 AFP-2的T2植物，也可确认AZP蛋白质强烈表达。
[0130]由确认了有I个拷贝的AZP基因插入的Tl植物得到的各T2品系是纯合或杂合，这通过来自各T2植物的T3苗的PCR分析确定。通过由来自各T2品系的T3苗(各品系使用约20个个体的苗) 的叶中提取的DNA样品的PCR分析，如果确认所有苗中均具有AZP基因，则可以断定其亲本T2品系为纯合(如果分离比为1: 3，则其亲本T2品系为杂合)。在来自同一 T2品系的所有T3植物中均具有AZP基因，因此可知该T2品系为纯合(图22)。通过统计处理也确认为纯合。此外，还通过蛋白质印迹确认了 T3植物中AZP的表达(图23)。对于使用AFP-3转化的植物，对于来自各T2植物的T3苗也进行同样的操作，得到了同样的结果。
[0131][表1]



|AZP-2~
正常型Tl植物Τ?
Ii天?个拷贝的τι~2
插入多个拷贝的Tl_2_
(拷贝数未鉴定的Tl) ~Τ5)~
具有纯合Τ2的Tl_6_
采蕩到纯合的Τ2的Tl ~
(未鉴定纯合性的Tl)I (5)
注)“具有纯合的Τ2的Tl”品系表示对于所得的插入I个拷贝的Tl进行分析得到的结果。
[0132](3) TYLCV双元质粒的制作和感染能力的确认
验证了是否可通过土壤杆菌接种法来使MiciO-Tom番茄感染。向多种野生型Micro-Tom中注入具有TYLCV基因组的土壤杆菌，尝试TYLCV感染。进行了多次试验，结果是每次均能以高效率感染。感染后约10天，在幼叶中观察到TYLCV感染的特征性的叶的萎缩(縮退)。也进一步在生长后的个体中明确观察到TYLCV感染的特征性症状即叶的卷曲或黄化。感染的个体中可见明显的生长抑制(图24)，开花虽然多但结实的概率显著较低。
[0133]在分子水平上也确认了利用土壤杆菌接种法的TYLCV的感染。感染成立后，回收各阶段的叶，在所有的感染的叶中，通过PCR法可检测出TYLCV基因组DNA。此外，对于TYLCV-mild也进行同样的试验，但与TYLCV不同，其感染症状温和。特别是感染初期的症状的程度是叶周边颜色变浅，有时很难从表型(表現系)进行感染的判断。因此，除了通过表型判定，通过利用PCR法在分子水平上鉴定感染个体中的TYLCV-mild的复制也可进行准确的判定。
[0134](4)通过AZP表达获得TYLCV感染抗性
从导入AZP-2制作的Tl植物中的3个个体分别得到纯合T2品系(参照表1)，再由该纯合T2品系得到T3植物，与上述同样地使其感染TYLCV。如图25所示，在转化番茄中未见到如在感染的野生型(图左侧的植物)中见到的叶的萎缩或黄化。进而通过PCR在分子水平上评价感染抗性。如图26所示，在T3纯合体中未检测出病毒DNA。此外，不仅纯合体，而且杂合体也未检测出病毒DNA,未见病毒的增殖。
[0135]对于由导入AZP-3制作的Tl植物的I个个体得到的T3植物也同样使其感染TYLCV，结果如图27所示，在转化番茄中未见到如在感染的野生型中见到的叶的萎缩或黄化。进而，如图28所示，AZP-3的转化体中也未检测出病毒DNA。
[0136]实施例1
(I)以WDV为靶标的AZP的设计
基于日本特表2004-519211号公报所记载的识别密码表设计分别识别以下两种DNA区的锌指蛋白。
a.上游侧的茎区与其侧翼区
b.茎环区
c.下游侧的茎区与其侧翼区
AZP-1l设计为:连续地连接10个锌指结构域而可识别图30所示的31个碱基对。AZP-12则设计为:连续地连接12个锌指结构域而可识别如图30所示的37个碱基对(其中AZP-12基于反义链侧的序列进行设计)。AZP-13则设计为:连续地连接9个锌指结构域而可识别图30所示的28个碱基对。
[0137](2) AZP表达质粒的制作
按照图31所示的方案制作ΑΖΡ-ll。首先通过PCR合成分别连接有3个锌指的基因，将各基因克隆至大肠杆菌表达载体的pET-2la(Novagen社)的BamH I/Hind III位点，然后确认所得质粒的碱基序列，由此得到pET-WDV3-l、pET- WDV3-2、和pET- WDV3-3。接着，通过PCR扩增pET- WDV3-2和pET- WDV3-3内的3指AZP的基因并连接，最终得到pET_WDV6。制作识别5’ -GGGT-3’的锌指基因，按照上述方法与pET-WDV3-l内的3指AZP基因连接，由此制作PET-WDV4。最后通过PCR，由pET_WDV4和pET_WDV6分别扩增6指AZP基因和4指AZP基因并连接，由此制作编码识别包含上游侧的茎区和其侧翼区的连续的31个碱基的AZP-1l 的质粒(pET-WDVlO)。
[0138] 按照图32所示的方案制作AZP-12。首先通过PCR合成分别连接有3个锌指的基因，将各基因克隆至大肠杆菌表达载体的pET-2 la (Novagen社)的BamH I/Hind III位点，然后确认所得质粒的碱基序列，由此得到pET-WDV3-4、pET-WDV3-5、pET-WDV3_6、和PET-WDV3-7。接着，通过PCR扩增pET_WDV3_4和pET_WDV3_5内的3指AZP的基因并连接，最终得到PET-WDV6-2。此外，通过PCR扩增pET_WDV3_6和pET_WDV3_7内的3指AZP的基因并连接，最终得到PET-WDV6-3。最后，通过PCR由pE_WDV6_2和pET-WDV6_3分别扩增6指AZP基因并连接，由此制作编码识别包含下游侧的茎区和其侧翼区的连续的37个碱基的AZP-12 的质粒(pET-WDV12)。
[0139]按照图33所示的方案制作AZP-13。首先通过PCR合成分别连接有3个锌指的基因，将各基因克隆至大肠杆菌表达载体的pET-21a(N0vagen社)的BamH I/Hind III位点，然后确认所得质粒的碱基序列，由此得到pET-WDV3-8、pET-WDV3-9、和pET-WDV3-10。接着，通过PCR扩增pET-WDV3-9和pET_WDV3_10内的3指AZP的基因并连接，最终得到pET_WDV6_4。最后通过PCR由pE-WDV6-4扩增6指AZP基因并连接，由此制作编码识别茎环区28个碱基的 AZP-13 的质粒(pET-WDV9)。
[0140]实施例2
1.材料与方法
(I) AZP的植物用稳定表达载体的制作
将上述实施例1中设计的编码AZPll和AZP12的各基因片段插入双元载体pUBIN_ZH2的多克隆位点中的该酶切位点。双元载体PUBIN-ZH2是在pPZP202 (P.Hajdukiewicz, Z.Svab, P.Maliga, 1994.Plant Molecular Biology 25: 989-994)的 T-DNA 部分引入在花椰菜花叶病毒35S启动子和胭脂碱合成酶终止子之间导入有潮霉素抗性基因的盒、和在玉米泛素基因启动子(Plant physiology Volume 100, 1992, Pages 1503-1507)和厕脂喊合成酶终止子之间具有多克隆位点的基因表达用盒而成的(图34)。如此，制作出含有AZPll和AZP12的2种植物用稳定表 达载体。
[0141](2)使用土壤杆菌将小麦AZP基因导入小麦
使用上述⑴中所得转化用载体，通过冻融法(Hofgen et al.(1998) Storageof competent cells for Agrobacterium transformation.Nucleic Acids Res.0ct25;16(20):9877)转化土壤杆菌(LBA4404株)。进而，使用由上述方法获得的土壤杆菌的转化体，实施小麦(品种:Haruyokoi)的转化。小麦的转化采用日本专利第4754968号所记载的植物原位转化法。
[0142](3)T0代中的基因导入确认
将上述(2)中所得的转化处理个体移至装有培养土的罐中，以23°C、长日条件(16小时光期、8小时暗期)生长。通过PCR确认目的基因导入与否。在TO代的转化个体生长到6叶期的阶段，切取约5 mm的真叶I片，通过CTAB法提取基因组DNA。使用基因组DNA溶液(IOng/1 μ L ) I μ L，通过PCR法检查基因导入。作为引物，设计并使用对包含泛素启动子和AZP的区域进行扩增的引物组。
[0143](4) Tl代中的基因导入确认
使可确认到PCR条带的TO代个体生长，获得Tl种子。使所得Tl种子发芽，由生长后个体的叶提取基因组，实施PCR。方法以与上述(3)实施的方法相同的方法来实施。
[0144](5)从Tl转化体中提取RNA、进行cDNA合成
将Tl代转化体的叶(第I~第2叶)采集至微量管中，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN社制)，提取总RNA。方法依照试剂盒说明书。使用所得的总RNA I μ g，通过HighCapacity RNA-to-cDNA (注册商标)Kit ( 7 7。9 4 F /1M 才 '> 7 f Λ 文' 社制)来合成cDNA。
[0145](6) Tl代中的导入基因的表达确认(RT-PCR)
使用(5)中所制备的cDNA溶液I μ L，通过PCR法检查导入基因表达。PCR的循环数设为30个循环。作为引物，设计使用对包含AZP的区域进行扩增的引物组。此外，通过序列分析确认所得条带为AZP片段。
[0146]2.结果
(I)AZP转化小麦的制作
分别通过土壤杆菌来实施AZP基因向小麦中的导入。在图34所示的双元载体中导入AZP基因，制备具有AZP表达盒的双元载体，使经该载体转化的土壤杆菌感染小麦种子，导入基因。将转化处理后的种子移至装有培养土的罐中，以25°C、长日条件(16小时光期、8小时暗期)生长。
[0147](2)T1代中的基因导入确认
由进行了转化处理的个体得到种子(Tl种子)并使之发芽，通过PCR法确认生长后的Tl代的个体具有AZP基因。为了扩增泛素启动子和AZP的片段，使用图35所示的PCR引物组进行PCR。如图36所示，数个个体(N0.4，5，7)中检测出了目标片段，因而可确认转化操作良好进行。应予说明，通过序列分析确认所得片段为泛素启动子和AZP基因的片段。
[0148](3) Tl代中的导入基因的表达确认(RT-PCR)
进而通过RT-PCR确认各转化体中的AZP表达。作为引物，设计使用对包含AZP的区域进行扩增的引物组(图37)。如图38所示，在导入有AZPll和ΑΖΡ12的Tl个体中可确认AZP有强表达。应予说明，通过序列分析确认所得片段为AZP基因的片段。
[0149]实施例3
1.材料与方法
(I)WDV感染用质粒的制作
感染使用了 TOV 中的 Yunnnan Kunming 型(Accession Number: EU541489)。感染用的WDV双元质粒的制作如下所示以3个阶段进行。
[0150]首先，将WDV的I个拷贝份的DNA片段克隆至克隆质粒pBluescript II KS+。即，通过PCR由合成DNA寡聚物重构并合成WDV的I个拷贝份的DNA片段，然后将DNA末端用Bsa I和Hind III切断，然后将所得DNA片段克隆至pBluescript II KS+的Acc65 I/HindIII位点，得到pBS-WDV。通过测序确认碱基序列正确。
[0151]接着，通过PCR，由pBS-WDV上的WDV的病毒基因组DNA扩增包含复制起点的0.5个拷贝份的DNA片段，克隆至双元质粒pBI121的Cla I/ EcoR I位点，得到pBI_WDV(0.5)。通过测序确认碱基序列正确。
[0152]在导入WDV的I个拷贝份的DNA片段之际，对用PCR扩增的DNA进行克隆时，必须确认所制作的质粒的碱基序列，但是由于目标质粒含有1.5个拷贝的病毒基因组，因此必然存在重复的DNA区，无法通过测序确认碱基序列正确。因此，不进行PCR而通过限制酶从制作的pBS-WDV中切出DNA片段，并将该片段导入pB1-ffDV(0.5)。即，用Bsiff I和HindIII从pBS-WDV切出病毒基因组I个拷贝份的DNA片段，在琼脂糖凝胶上纯化，然后克隆至pB1-WDV(0.5)的 Bsiff I/Hind III 位点，最终得到目标质粒的 pB1-ffDV(l.5)。[0153](2) WDV 的感染
制作土壤杆菌C58ClRifR(GV2260)的感受态细胞。在该感受态细胞中导入所制作的具有1.5个拷贝的WDV基因组的双元质粒，制作土壤杆菌接种法用的土壤杆菌的甘油贮液，保存于_80°C。在对小麦进行感染的前一天，将该甘油贮液接种于6mL的LB培养基(Kan100mg/L、Amp 50mg/L),在3(TC下培养一昼夜。接着收集土壤杆菌，悬浮于ImL缓冲液中。将该悬浮液注入到播种后约20天的苗的茎中，使其感染。感染后对植物个体叶中的病毒DNA进行检测。用于此目的的DNA样品的制作如上所述进行,使用对WDV的Yunnnan Kunming型为特异性引物组进行的PCR，根据对PCR产物的分析而在分子水平上评价病毒感染。
[0154](3) WDV感染抗性的评价
由导入AZPll或AZP12基因而得的Tl转化体获得苗，在该苗中注入具有WDV病毒双元质粒的土壤杆菌的悬浮液。从感染小麦的叶中提取DNA，依照前项的方法，通过PCR验证植物体内病毒是否增殖。
[0155]2.结果
(I)WDV双元质粒的制作和病毒感染的确认
验证了是否可通过土壤杆菌接种法来使小麦感染。向多种野生型小麦(品种:“春来^ ”)中注入具有WDV基因组的土壤杆菌，尝试WDV感染。在土壤杆菌注入后20天回收幼叶，提取DNA。通过使用该DNA样品的PCR法，可以在注入了土壤杆菌的野生型小麦个体中，在回收的叶中检测WDV基因组DNA。其一例示于图39。 [0156](2)通过AZP表达获得WDV感染抗性
在导入AZPll或AZP12基因制作的Tl转化体中随机选择3个个体，与上述相同地分别对其接种WDV，在接种后20天回收叶，通过PCR法调查WDV基因组DNA检出与否。如图39所示，所有转化小麦中均为检测出TOV病毒DNA，未见病毒的增殖。
[0157]产业实用性
本发明的复制抑制剂可以对属于玉米线条病毒属的WDV或其它病毒发挥高有效性，因而作为针对属于玉米线条病毒属的多种病毒的防除方法极其有用。
【权利要求】
1.复制抑制剂，其是针对属于双生病毒科的玉米线条病毒属的病毒的复制抑制剂，所述复制抑制剂含有锌指蛋白并且可以抑制茎环结构的形成，所述锌指蛋白可以与该病毒的茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的I处或2处以上的部分DNA特异性结合。
2.权利要求1所述的复制抑制剂，其含有可以与选自属于玉米线条病毒属的病毒的茎环区的全长DNA的I处的部分DNA结合的单一的锌指蛋白。
3.权利要求1所述的复制抑制剂，其含有可以与连续DNA结合的单一的锌指蛋白，所述连续DNA由选自属于玉米线条病毒属的病毒的茎环区的全长DNA的I处的部分DNA、和结合于该DNA并选自侧翼区的I处的DNA构成。
4.权利要求1至3中任一项所述的复制抑制剂，其中，上述锌指蛋白是含有9个至12个锌指结构域的锌指蛋白。
5.权利要求1至4中任一项所述的复制抑制剂，其中，属于玉米线条病毒属的病毒是小麦萎缩病病毒。
6.核酸，其编码权利要求1至5中任一项所述的锌指蛋白。
7.植物转化用的重组载体，其含有权利要求6所述的核酸。
8.农药，其含有权利要求1至5中任一项所述的锌指蛋白或编码该锌指蛋白的核酸作为有效成分。
9.预防属于双生 病毒科的玉米线条病毒属的病毒所致的植物的感染的方法，其包括对植物施用预防有效量的权利要求1至5中任一项所述的锌指蛋白或编码该锌指蛋白的核酸的步骤。
10.基因重组植物，其对属于双生病毒科的玉米线条病毒属的病毒具有抗性，并且其可表达权利要求1至5中任一项所述的锌指蛋白。
11.通过导入编码权利要求1至5中任一项所述的锌指蛋白的核酸而转化的植物。
12.使植物获得针对属于双生病毒科的玉米线条病毒属的病毒的抗性的方法，其包括将编码权利要求1至5中任一项所述的锌指蛋白的核酸导入该植物进行转化的步骤。
13.植物转化用载体，其含有编码权利要求1至5中任一项所述的锌指蛋白的核酸。
【文档编号】A01N63/00GK104011205SQ201280052566
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年10月26日 优先权日:2011年10月27日
【发明者】世良贵史 申请人:世良贵史