专利名称：一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的 shRNA及其应用。
背景技术：
乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一种严重的人畜共患虫媒病毒性疾病。该病对人类危害 巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，广泛分布于亚洲，特别是远东一些国家和 地区。近年来其流行分布范围不断扩大，流行频率也不断增强。乙脑病毒属于黄病毒科黄病毒属。病毒粒子呈20面体对称，在核酸外面包有致密 的脂蛋白囊膜。JEV基因组为单股正链RNA分子，本身具有传染性。其基因组编码产物为3 个结构蛋白(C、prM、E)和 7 个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。乙脑属于自然疫源性疾病，蚊虫是该病的主要传播媒介。本病的发生与气候环境 有着密切的关系，呈明显的季节性。我国一般流行高峰在7、8、9三个月。多种动物均可 感染本病，感染后成为传染源。经检查发现，在流行病区，畜禽的隐性感染率均很高，特别是 猪，其次是马和牛。病毒在感染动物血液内存留时间很短，主要存在于中枢神经系统及肿胀 的睾丸内，但猪感染后病毒血症期维持时间长，血液中病毒滴度高，对乙脑的传播起重要作 用。同时，猪是乙脑传播给人类最重要的宿主，一般情况下JEV的感染呈猪-蚊-人链状。 猪感染乙脑时间的早晚和感染率的高低与人乙脑的流行密切相关。感染后，人、猴、马和驴 出现明显的脑炎临诊症状，病死率较高。猪群不发生脑炎症状，怀孕母猪可表现高热、流产、 死胎和木乃伊胎，死产胎儿出现脑缺损症状，公猪则出现睾丸炎，给养猪业发展带来巨大的 损失。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指双链RNA介导的序列特异的基因沉默现 象。RNA干扰现象最初在植物和低等生物中被发现，随着研究的深入，近来在高等的真核生 物中也被发现，并且证明是一种重要的进化保守现象。已证明短的双股干扰RNA(SiRNA)是 由dsRNA特异的核酸内切酶，Dicer酶，剪切而来。RNA诱导沉默复合物(RISC)是由siRNA 和一种多酶复合物结合构成，它位于mRNA特定的部位，并且发挥核酸内切酶和外切酶的活 性来作用mRNA。除了在转录水平的基因沉默(降解mRNA)，siRNA也被证明通过DNA甲基化 沉默启动子而降低蛋白表达。短发卡RNA(shRNA)通常利用载体导入细胞，并且可被传递到 子代细胞中去，从而使基因沉默可被遗传。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA， 然后按上述机制达到降解mRNA的目的。它最大的优点在于具有高度的有效性和特异性并 且具有快速的防御与治疗效果。它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤 其是病毒性疾病的治疗领域已显示出不可估量的价值，例如在抗艾滋病毒(HIV)，丙型肝炎 病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)等病毒的研究中都发现 RNAi对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的，更有效的途 径。毫无疑问，随着对RNAi机制的深入了解以及技术的进一步完善，RNAi技术必将为生命科学研究和临床疾病的防治带来新的革命。乙型脑炎的流行是世界性的公共卫生问题之一。目前对于乙脑尚无特效治疗手 段，因此预防乙脑的发生尤为重要。而传统的疫苗生产不能满足人类日益发展的需要，因 而，科研人员不断地寻求新的治疗方式。RNAi这项新兴技术即是其中颇有潜力的新途径。 目前，国内外运用RNAi治疗乙脑还处在科研院所的理论研究中，并未大规模地投入到临床 治疗中，但其研究结果显示出卓越的抑制病毒复制与感染的能力，在临床治疗中有着极大 的潜力与良好的前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种能快速、特异和显著抑制JEV在动物细胞与个体中复制 和感染的shRNA及其应用。本发明的另一目的是提供含有该shRNA的真核表达质粒及其应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现
一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA，以JEV基因组中高度保守的E、NS3和 NS4b基因序列作为其靶序列，所述的靶序列为=SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11、 SEQ ID NO. 12。本发明所述shRNA的模板序列如下
shRNA-El 正义链模板序列SEQ ID NO. 1，反义链模板序列SEQ ID N0. 2 ； shRNA-E2 正义链模板序列SEQ ID N0. 3，反义链模板序列SEQ ID N0. 4 ； shRNA-NS3 正义链模板序列SEQ ID N0. 5，反义链模板序列SEQ ID N0. 6 ； shRNA-NS4b 正义链模板序列SEQ ID N0. 7，反义链模板序列SEQ ID N0. 8。其中ShRNA-El针对的靶基因序列为SEQ ID N0. 9，shRNA_E2针对的靶基因序列为 SEQ ID N0. 10，shRNA-NS3针对的靶基因序列为SEQ ID N0. 11，shRNA_NS4b针对的靶基因 序列为 SEQ ID N0. 12。一种靶向乙型脑炎病毒基因组不同区域的shRNA真核表达质粒即是将本发明所 述的shRNA的模板与线性化的载体pGPTO/GFP/Neo连接得到分别针对乙型脑炎病毒E、NS3 或NS4b基因mRNA序列的shRNA真核表达质粒，分别简写为pGP_El、pGP_E2、pGP_NS3及 pGP-NS4b。本发明所述的抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA在制备抑制乙型脑炎病毒 复制和/或感染的药物中的应用。本发明所述的靶向乙型脑炎病毒基因组不同区域的shRNA真核表达质粒在制备 抑制乙型脑炎病毒复制和/或感染的药物中的应用。本发明的有益效果
先向动物细胞中转染本发明的shRNA真核表达质粒，再用病毒攻击细胞进行一系列试 验(图Γ图8)，结果表明本发明的shRNA可有效地抑制JEV在细胞上的复制，对细胞有良好 的保护作用。先将本发明的shRNA真核表达质粒注入动物体内，再用不同剂量的病毒攻击动物 机体(图10 A、B);或者将本发明的ShRNA真核表达质粒与不同剂量的病毒同时注入动物体 内(图10 C、D)，结果表明本发明的shRNA均能有效地降低动物的发病率和死亡率，动物存活率达50%以上，显著高于无干扰作用组。可见，本发明的shRNA真核表达质粒在动物个体 水平上既有良好的预防JEV感染的作用也有治疗JEV感染的功效。综上所述，本发明所提供的shRNA以及shRNA真核表达质粒能够在制备治疗和/ 或预防JEV感染的药物中应用，为治疗和预防JEV感染提供一种新的可选药物。
图1 JEV基因组结构及本发明中所选取的保守区段示意图。箭头处为shRNA所 选的靶基因位点。图 2 pGPU6/GFP/Neo 载体结构图。图3 shRNA真核表达质粒的酶切鉴定。M: lamda/^bo730I; A1-5和B1-5分别为 pGP-El 与 pGP-E2 Bbsl 酶切结果；A，1-5 和 B，1-5 分别为 pGP-El 与 pGP_E2 BairMl 酶切 结果；C1-5和D1-5分别为pGP-NS3与pGP_NS4b Bbsl酶切结果；C，1-5和D，1-5分别为 PGP-NS3 与 pGP-NS4b BairMl 酶切结果。图4 间接免疫荧光结果。A、B、C、D、E、F 分别是 pGP-El、pGP-E2、pGP-NS3、 pGP-NS4b、pGP-NC 和 Mock 组结果。图5经shRNA作用后的细胞培养液的TCID5tl的测定结果。图6 流式细胞术结果。A、B、C、D、E、F 分别是pGP_E 1、pGP_E2、pGP_NS3、pGP_NS4b、 pGP-NC和Mock组结果。图7 Real time RT-PCR结果。mRNA的相对表达量是指经过shRNA干扰作用后 JEV的目的基因3’段非编码区的表达量与阴性对照组目的基因表达量的比值。图 8 Western blotting 结果。泳道 1 6 分别为 pGP-El、pGP_E2、pGP_NS3、 pGP-NS4b、pGP-NC 和 Mock 组结果。图9 免疫组化结果。六、8、(、0』、？分别是？6 41、？6 42、？6 -赂3、？6 -赂413、 Virus control 和 Mock 组结果。图10 动物保护性实验结果。A、B分别为先注射shRNA真核表达质粒后攻毒 20LD5(1和IOOLD5tl JEV (NJ2008)组；C、D分别为同时注射shRNA真核表达质粒和20LD5(1 JEV (NJ2008)组，同时注射shRNA真核表达质粒和IOOLD5tl JEV (NJ2008)组。
具体实施例方式实施例1 shRNA的制备 (1)寡核苷酸的设计与合成
以JEV的E、NS3、NS4b基因mRNA序列为靶序列(图1)，利用Ambion公司的siRNA 设计软件，通过同源分析，分别针对JEV基因的1553 1571bp (El)、1679 1697bp (E2)、 6083 6101bp (NS3)和7350 7368bp (NS4b)设计合成4对shRNA寡核苷酸链。其loop结 构选用了 TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模 板的5’端添加了 CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了 GATC， 与BamHI酶切后形成的粘端互补；如果shRNA的靶序列第一个碱基不是G，则在其模板链的 CACC后补加一个G。所设计的四个shRNA的模板链序列如下shRNA_El 正义链模板SEQ ID N0. 1，反义链模板SEQ ID N0. 2 ;shRNA_E2 正义链模板SEQ ID N0. 3，反义链模板SEQ IDNO. 4 ； shRNA-NS3 正义链模板 SEQ ID NO. 5，反义链模板 SEQ ID NO. 6 ； shRNA_NS4b 正义链模板SEQ ID NO. 7，反义链模板SEQ ID NO. 8。上述序列合成委托上海吉玛制药技 术有限公司进行。(2) shRNA模板的退火
将shRNA模板单链分别用TE (pH8. 0)溶解，浓度为100 μ Μ。取相应的正义链模板和反 义链模板溶液，按照表1配比配置退火反应体系。表 权利要求
1.一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA，其特征在于以乙型脑炎病毒基因组 中高度保守的序列作为其靶序列，所述的靶序列为SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 或 SEQ ID NO. 12。
2.根据权利要求1所述的抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA，其特征在于其该 shRNA的模板序列如下shRNA-El 正义链模板序列SEQ ID NO. 1，反义链模板序列SEQ ID NO. 2 ； shRNA-E2 正义链模板序列SEQ ID NO. 3，反义链模板序列SEQ ID NO. 4 ； shRNA-NS3 正义链模板序列SEQ ID NO. 5，反义链模板序列SEQ ID NO. 6 ； shRNA-NS4b 正义链模板序列SEQ ID NO. 7，反义链模板序列SEQ ID NO. 8。
3.—种权利要求2所述的shRNA真核表达质粒，其特征在于该shRNA真核表达质粒是 将所述的shRNA的模板与线性化的载体pGPTO/GFP/Neo连接得到分别针对乙型脑炎病毒E、 NS3或NS4b基因mRNA序列的shRNA真核表达质粒。
4.权利要求1所述的shRNA在制备抑制乙型脑炎病毒复制和/或感染的药物中的应用。
5.一种权力要求3所述的shRNA真核表达质粒在制备抑制乙型脑炎病毒复制和/或感 染的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA及其应用。该shRNA以乙型脑炎病毒基因组中高度保守的序列作为其靶序列，所述的靶序列为SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11或SEQIDNO.12。该shRNA真核表达质粒是将所述的shRNA的模板与线性化的载体pGPU6/GFP/Neo连接得到分别针对乙型脑炎病毒E、NS3或NS4b基因mRNA序列的shRNA真核表达质粒。本发明所提供的shRNA以及shRNA真核表达质粒能够在制备治疗和/或预防JEV感染的药物中应用，为治疗和预防JEV感染提供一种新的可选药物。
文档编号C12N15/85GK102002499SQ201010507298
公开日2011年4月6日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者刘珂, 周斌, 曹瑞兵, 沈婷, 陈溥言 申请人:南京农业大学