Bk病毒的检测方法、试剂盒及其应用
Bk病毒的检测方法、试剂盒及其应用
【专利摘要】本申请公开了BK病毒的检测方法,包括如下步骤：采用磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA，获得待测样本；PCR扩增反应；采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针BKV?FP5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号。本申请还公开了检测BK病毒的试剂盒。本发明的检测方法、试剂盒敏感性高，最低检出可达到500copies/mL；同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如JC病毒(JCV)，丙肝病毒(HCV)，人巨细胞病毒(HCMV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
【专利说明】
BK病毒的检测方法、试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种病毒的检测方法、试剂盒及其应用，具体讲，涉及BK病毒的检测方 法、试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] BK病毒(BKV)是一种无囊膜的环状双链DNA病毒，与JC病毒(JC virus，JCV)、SV40 病毒同属于多瘤病毒家族，是多瘤病毒属的一个亚群，以人为自然宿主。
[0003] BK病毒原发感染发生在在儿童时期，一般存在于人体泌尿道及外周血白细胞中， 约0.5%~20%感染者会出现BKV激活，导致病毒复制，一般不会引起肾功能损害。但在接受 免疫抑制剂治疗的人群中，特别是肾移植术后患者，BKV再激活率会明显增高，并可能导致 BKV相关性肾病（BKV associated nephropathy，BKVAN)〇
[0004] 肾脏是健康人BKV潜伏感染的主要部位，10%~60%肾移植术后患者可在尿液中 检测到BKV，其中多数患者表现为无症状病毒血症或暂时的移植肾功能异常，偶可在切除的 移植肾样本中发现病毒引起的组织损伤。BKVAN相关研究发现，约5%的肾移植受者可发生 BKVAN，其中约45 %会出现移植肾失功。
[0005] 近年研究发现，初次感染BKV后，BKV常潜伏于肾小管上皮细胞及尿路移行上皮细 胞内，当宿主免疫力下降时，BKV可再次激活并开始迅速大量复制。肾移植术后患者中BKV再 激活的发生率约为10%~68%，约1 %~7%的肾移植患者术后会出现BKVAN。肾移植术后的 免疫抑制剂治疗可使BKV发生较高水平的复制，造成受感染细胞出现松解和破坏，并发生组 织炎性细胞浸润，导致肾脏组织结构破坏，最终影响其功能。
[0006] BKV-DNA常规检测方法主要有细胞学检查-尿中诱饵细胞检测、病理穿刺活检以及 荧光定量PCR检测。穿刺活检是诊断BKVAN的金标准、优点在于可以明确的诊断，对治疗有一 定帮助，但是穿刺活检是创伤性检查，患者比较痛苦，且费用较高。
[0007] 荧光定量PCR技术是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量 检测技术。荧光定量PCR使用特异性探针，能够对靶序列进行特异性识别，具有引物探针双 重控制，在扩增指数期进行定量，具有很高的特异性、准确性、灵敏性及假阳性率低等特点。
[0008] 本产品采用荧光定量PCR技术，用于定量检测人类晨尿样本中的BKV DNA。以BK病 毒保守基因序列为检测目的片段，该检测结果不得作为患者病情单独的评价指标，必须结 合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行评价，还可通过对患者BKV DNA水平和 变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。本试剂不用作BK病毒的血 源筛查。
[0009] 目前，国内外临床应用BK病毒荧光定量PCR主要如下：
[001 0] 1.核酸提取方法:磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法。
[0011] 2.定量标准品：大多标准品不参与核酸提取，不能全面真实反映核酸提取和扩增， 不能对待测样本进行准确定标。
[0012 ] 3. BK V阳性质控品和BKV临界阳性质控品：大多数定量检测试剂盒未设置BK V阳性 质控品和BKV临界阳性质控品，不能很好监控核酸提取与扩增。
[0013] 使用本发明中的ΒΚ病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法），使用磁珠提取方法， 可以有效进行核酸提取，在本发明中，我们使用的定量标准品、BKV阳性质控品及BKV临界阳 性质控品均来源于灭活阳性尿液样本，可以与待测样本同时进行提取与扩增，从而可以全 程监控样本提取与扩增，从而对待测样本进行准确定标。
【发明内容】
[0014] 本申请解决的主要问题是提供ΒΚ病毒的检测方法及试剂盒，以解决无法实现的技 术问题。
[0015]为了解决上述技术问题，本发明公开了 ΒΚ病毒的检测方法，包括如下步骤：
[0016] 待测样本获取：
[0017] 采用磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA，获得待测样本；
[0018] PCR扩增反应：
[0019] 将提取的BKV DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增；
[0020] 所述PCR反应混合液，包括:PCR反应液、BKV引物探针混合液，
[0021] 所述BKV引物探针混合液，包括，上游引物BKV-F，下游引物BKV-R，Taqman荧光探针 BKV-FP，纯化水；
[0022] 所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID N0:1所示的碱基序列；
[0023] 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列；
[0024] 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID N0: 3所示的碱基序列，所述Taqman荧 光探针BKV-FP5 '端有荧光报告基团，3 '端有荧光淬灭基团；
[0025]结果检测：
[0026]采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针BKV-FP5'端荧光基团对应的荧光素，在60°C收集荧光信号，
[0027] 进一步地，所述PCR扩增反应的条件为：37°C，2min; 95°C，3min;然后，94°C，10s，60 °C，35s，10个循环;然后，94°C，10s，60 °C，35s，35个循环;25 °C，lmin。
[0028] 进一步地，所述BKV引物探针混合液，还包括：内标上游引物，内标下游引物，内标 探针。
[0029] 进一步地，所述PCR扩增反应，还包括:平行设置BKV阴性质控品、BKV阳性质控品、 BKV临界阳性质控品和BKV定量标准品I~IV反应组，所述BKV阴性质控品为无菌生理盐水， 所述BKV临界阳性质控品为浓度1.0乂10 4〇叩1^/1^的他￥阳性尿液样本;81^阳性质控品为 浓度1.0 X 106copies/mL的BKV阳性尿液样本;BKV定量标准品I~IV，包括BKV定量标准品I、 BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。
[0030] 进一步地，所述的Taqman荧光探针BKV-FP的荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六 氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹 明、磺酰罗丹明、6-羧基-4'，5_二氯-2'，7'_二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或 花菁5.5中的至少一种;所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯 偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。
[0031] 进一步地，所述PCR反应液，包括UDG酶防污染体系，所述UDG酶防污染体系，包括： UDG 酶及 dUTP。
[0032]本申请还提供检测BK病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的上游引物 BKV-F，下游引物 BKV-R，Taqman 荧光探针 BKV-FP，
[0033] 所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID N0:1所示的碱基序列；
[0034] 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列；
[0035] 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID N0:3所示的碱基序列。
[0036] 进一步地，该试剂盒还包括：内标上游引物、内标下游引物、内标探针、BKV阴性质 控品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品和BKV定量标准品I~IV，其中BKV阴性质控品无 菌生理盐水，BKV定量标准品I~IV的待测模板分别为BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、 BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。
[0037] 进一步地，所述试剂盒包括:裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉 剂、BKV引物探针混合液、PCR反应液、BKV定量标准品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、 BKV阴性质控品、BKV内标质控品，各组分含量为： 蛋白酶丨（ 240 μLχ?; 助沉剂 196μ|χΙ ; 裂解液 4.8m|xl ; 磁珠 480 μ1χ1 洗液 1 6 6 ml.xl 洗液 2 3.6 mix 1 ? 洗脱液 1200 μLχ? ; 引物探针混合液 120μ1><1
[0038] PCR 反应液 600 μ Μ; BKV阳性质控品 600 μLχ? BKV临界阳性质控品 600 μ丨X1 BKV阴性质控品 600 μΜ ; BKV定量标准品I 600 μ丨X丨； BKV定量标准品II 600 μLχ? ; BKV定量标准品III 600 μ1χ[; BKV定量标准品IV 600 μΜ ; BKV内标质控品 ]30μ|χ1。
[0039] 本申请提供的检测BK病毒的试剂盒，用于BK病毒的检测。
[0040] 与现有技术相比，本发明所述的BK病毒的检测方法、试剂盒，达到了如下效果：
[0041] 1.本发明中磁珠法实现了人类尿液样本中BKV提取操作，磁珠法有效快速的提取 了样本DNA。
[0042] 2.本发明中所涉及的试剂盒中设置BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、定量标 准品均为尿液样本，参与核酸提取及扩增，全面真实反映核酸提取和扩增，对待测样本进行 准确定标。
[0043] 3.本发明使用尿苷酶(UDG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止 先前PCR扩增产物的污染。
[0044] 4.本发明采用内标质控体系，内标参与样本提取与扩增，用于监测反应体系可能 存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突 的另一检测通道。
[0045] 5.本发明的检测方法、试剂盒敏感性高，最低检出可达到500copies/mL;同时，本 发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如JC病毒(JCV)，丙肝病 毒(HCV)，人巨细胞病毒(HCMV)和乙型肝炎病毒(HBV);
[0046] 6.本发明的检测方法反应快速，一般1.5到2小时即可得到检测结果，并且成本低， 适合于大规模临床开展。从而实现对BK病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及 时的病理诊治及治疗效果监测。
【附图说明】
[0047]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： [0048]图1是本发明实施例2所述BK病毒定性检测结果图。
[0049]图2是本发明实施例3所述BK病毒定量检测标准品检测结果图。
[0050]图3是本发明实施例3所述BK病毒定量检测标准品和待测样品检测结果图。
【具体实施方式】
[0051]如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应 可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名 称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通 篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为一开放式用语，故应解释成"包含但不限定 于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述 技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述 描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围 当视所附权利要求所界定者为准。
[0052]以下结合附图对本申请作进一步详细说明，但不作为对本申请的限定。下文为了 叙述方便，下文中所称的"左""右""上""下"等与附图本身左、右、上、下等方向一致。
[0053] 实施例1
[0054]本实施例提供待测样本获取的方法：
[0055] 采用磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA，获得待测样本。磁珠法提取核酸使用独 特的裂解液和蛋白酶K迅速裂解细胞并灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA选择性吸附于磁 珠，再通过一系列快速的漂洗-分离的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等 杂质去除，最后用双蒸水即可将纯净基因组DNA从磁珠上洗脱。
[0056] 1、磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA所用试剂及成分
[0057] (1)裂解液：1 OOmL用量为例，盐酸胍40.47g、三(羟甲基)氨基甲烷0.5132g、氯化钠 0.0932g、吐温-20 6.78mL，加入16mL纯水，于恒温加热磁力搅拌器中约70°C加热搅拌至完 全溶解，泡沫消除后定容至100mL后，盐酸调节至pH7.0。
[0058]此外，关于裂解液配制成分中盐酸胍可替换成异硫氰酸胍、三(羟甲基）氨基甲烷 可替换成三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、吐温-20可替换成曲拉通100。
[0059] (2)洗液l:100mL用量为例，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐0.5731g、乙二胺四乙酸二 钠0.1353g，加入纯水约80mL，溶解后纯水定容至终体积100mL后，NaOH溶液调节液体pH至 6.5〇
[0060]此外，关于洗液1配制成分可三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐可替换成三(羟甲基)氨 基甲烷，乙二胺四乙酸二钠可替换成乙二胺四乙酸。
[0061 ] (3)洗液2:纯水。
[0062] (4)洗脱液：100mL用量为例，三（羟甲基）氨基甲烷0.1211g，10.00mL10mMEDTA， 70mL纯水，溶解均匀，盐酸调节为pH8.5，定容。
[0063] (5)磁珠:购买商品化磁珠。
[0064] (6)蛋白酶K:将购买商品化蛋白酶K稀释至20mg/mL。
[0065] (7)助沉剂:将购买商品化助沉剂。
[0066] 2、采用磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA具体方法如下：
[0067]①使用前向裂解液中加入2.4mL异丙醇，向洗液1中加入5.4mL乙醇，洗液2中加入 8.4mL乙醇，摇匀后若裂解液中有不溶物，请于70°C下温育至溶解，冷却后即可使用。
[0068]②将尿液送检管振荡15s，彻底混匀后立即取lmL至1.5mL离心管中（若样本不足 lmL，请用生理盐水稀释一定倍数后移取lmL)，13000rpm离心10min后小心弃去上清(可残余 10yL左右液体以免遗弃目的物），注意避免触碰离心管底。
[0069] 注:BKV阴性质控品、BKV临界阳性质控品、BKV阳性质控品及定量标准品I-Ι V:融化 并振荡混勾后取200yL各加到1.5mL离心管中，补加生理盐水至lmL，13000rpm离心10min后 小心弃去上清。
[0070] ③向离心管内加入10yL蛋白酶K、4yL助沉剂、300yL裂解液，20yL磁珠(每次吸取前 需颠倒或使用移液器吹吸混匀磁珠），5yL内标质控品，漩涡振荡混匀各离心管10s，于室温 轻柔颠倒混匀l〇min，使磁珠和核酸充分结合。
[0071] ④将离心管放在磁分离架上，反复颠倒磁分离架将离心管盖上的磁珠冲洗下来， 静置lmin后弃去上清液。
[0072]⑤加入500yL洗液1，漩涡振荡3~5s使磁珠重新悬浮，然后置于磁分离架上，反复 颠倒磁分离架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置lmin后弃去上清液。
[0073]⑥加入500yL洗液2,漩涡振荡3~5s使磁珠重新悬浮，然后置于磁分离架上，反复 颠倒磁分离架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置lmin后弃去上清液，并尽量吸弃管底残 余液体，瞭干5min。
[0074] ⑦加入50yL洗脱液，用移液枪缓慢吹打管壁上的磁珠使之浸于洗脱液中，55°C温 育5min，期间轻轻晃动溶液两次。
[0075] ⑧将离心管置于磁分离架上静置lmin，磁分离后及时将上清液转移至新的无核酸 酶离心管中，此上清即为提取到BKV DNA，即待测样本。
[0076] 实施例2
[0077] BK病毒的定性检测
[0078]本实施例2提供一种BK病毒的定性检测方法：
[0079] 1、BKV DNA的PCR扩增反应
[0080] 1)BKV DNA的PCR扩增反应所用试剂及成分
[0081] (l)BKV引物探针混合液：
[0082] BKV引物探针混合液具体组成成分为:上游引物BKV-F( 20μΜ) lyL，下游引物BKV-R (20μΜ) lyL，Taqman 荧光探针 BKV-FP( ΙΟμΜ) 0 · 8yL，纯化水 2 · 2yL。
[0083] 优选BKV引物探针混合液的组分为:上游引物BKV-F( 20μΜ) lyL，下游引物BKV-R( 20 μΜ) lyL，Taqman荧光探针BKV-FP(10μΜ)0 · 8yL，内标上游引物（20μΜ)0 · 5yL，内标下游引物 (20μΜ) 0 · 5yL，内标探针（1 ΟμΜ) 0 · 375yL，纯化水0 · 825yL。
[0084] 所述上游引物BKV-F包含如SEQIDN0:1所示的碱基序列；
[0085] 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列；
[0086] 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID如:3所示的碱基序列，所述了3911^11荧 光探针BKV-FP 5'端有荧光报告基团，3'端有荧光淬灭基团。
[0087] 所述的Taqman荧光探针BKV-FP的荧光报告基团选自6-羧基荧光素（6_ carboxyf luorescein，6_FAM)、六氯-6-甲基焚光素、VIC焚光染料、四氯-6-羧基焚光素、羧 基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4 '，5-二氯-2 '，7 二甲氧基荧光 素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种;所述荧光淬灭基团选自6-羧基四 甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基）苯甲酸、黑洞淬灭剂l(Black Hole Quencher 1， BHQ1)、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种；
[0088]优选的，当荧光淬灭基团选自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时，焚光报告基 团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4'，5'_二氯-2'，7'_二甲氧基荧光素琥 珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种；
[0089]当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、 四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4'，5'_二氯-2'，7'_二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少一种；
[0090] 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4'，5'_二氯-2'，7'_二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光 素或花菁3中的至少一种；
[0091] 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花 菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种；
[0092] 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5.5中的一 种。
[0093]最优选的，所述荧光报告基团为6-FAM;所述荧光淬灭基团为BHQ1。
[0094] (2)PCR 反应液：
[0095] PCR 反应液组成为：10Xreaction buffer5yL，10mM dNTP Mix 4yL，Taq DNA Polymerasel.2yL，UDG 0.2yL，10mM dUTPlyL，纯化水 13.6yL。
[0096] 2)BKV DNA(待测样本)PCR反应
[0097] (1)按以下比例进行BKV PCR反应混合液配制与加样:PCR反应液25yL，BKV引物探 针混合液5yL加到PCR管中，振荡混匀，将提取好的待测样本20yL加到上述PCR管中，进行PCR 扩增。
[0098] (2)PCR反应的反应条件设置为：37°C，2min; 95 °C，3min;然后，94°C，10s，60°C， 35s，10个循环;然后，94°C，10s，60°C，35s(荧光收集），35个循环；25°C，lmin。
[0099] 2、PCR反应结果判读(BK病毒的定性检测结果分析）
[0100]本实施例2采用最优方案，即BKV引物探针混合液含内标，所述Taqman荧光探针 BKV-FP的荧光报告基团为6-FAM;荧光淬灭基团为BHQ1。
[0101]本实施例2采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为对应荧光素，本实 施例设定为FAM、VIC荧光素，荧光信号收集设在60°C。
[0102] BKV引物探针混合液有无内标，不影响待检样品通道曲线的响应，即BK病毒检出为 阳性时，待检样品对应通道会出现S型曲线;BK病毒检出为阴性时，待检样品对应通道不出 现S型曲线。
[0103] 本实施2采用BKV引物探针混合液含内标，所述Taqman荧光探针BKV-FP的荧光报告 基团为6-FAM;荧光淬灭基团为BHQ1的方案，因此检测结果会包含内标通道曲线：
[0104] 如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测无 S型曲线，判定为BKV阴性;如果内 标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线，判定为BKV阳性。利用上述方法对13例BK 病毒尿液样本、2例JC病毒尿液样本、5例健康人尿液样本，2例丙肝病毒(HCV)血液样本、2例 人巨细胞病毒(HCMV)血液样本，共计24份临床样本进行检测，结果如图1所示：
[0105] 其中，13例检测均为阳性，内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线;健 康人尿液样本，丙肝病毒(HCV)，人巨细胞病毒(HCMV)，JC病毒(JCV)检测均为阴性，内标通 道出现S型曲线，同时FAM通道检测无 S型曲线。
[0106] 本实施例2采用内标质控体系，内标参与样本提取与扩增，用于监测反应体系可能 存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突 的另一检测通道。
[0107] 实施例3
[0108] 本实施例2提供一种BK病毒的定量检测方法：
[0109] 1、BKV DNA的PCR扩增反应
[0110] 1)BKV DNA的PCR扩增反应所用试剂及成分
[0111] (l)BKV引物探针混合液：
[0112] BKV引物探针混合液的组分为:上游引物BKV-F( 20μΜ) lyL，下游引物BKV-R( 20μΜ) 1 yL，Taqman荧光探针BKV-FP(1 ΟμΜ) 0 · 8yL，内标上游引物（20μΜ)0 · 5yL，内标下游引物（20μΜ) 0.5yL，内标探针（ΙΟμΜ) 0.375yL，纯化水0.825yL。
[0113] 所述所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；
[0114] 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列；
[0115] 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQIDN0:3所示的碱基序列，所述荧光报告 基团为6-FAM;所述荧光淬灭基团为BHQ1。
[0116] (2)PCR 反应液：
[0117] PCR 反应液组成为：10Xreaction buffer5yL，10mM dNTP Mix 4yL，Taq DNA Polymerasel.2yL，UDG 0.2yL，10mM dUTPlyL，纯化水 13.6yL。
[0118] (3)BKV定量标准品：
[0119] 定量标准品均为生理盐水稀释后尿液样本，浓度分别为:BKV定量标准品I (2.5 X 108copies/mL)、BKV定量标准品 Π (2.5X 107copies/mL)、BKV定量标准品 ΙΠ (2 · 5 X 106copies/mL)、BKV定量标准品IV(2 · 5 X 105copies/mL)。
[0120] (4)BKV阳性质控品：
[0121] BKV阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度为2.5X106copies/mL。
[0122] (5)BKV临界阳性质控品
[0123] BKV临界阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度为1 X 104copies/mL。
[0124] (6)BKV阴性质控品：
[0125] BKV阴性质控品为灭菌生理盐水。
[0126] (7)BKV内标质控品：
[0127] BKV内标质控品为体外构建的重组质粒。
[0128] 2)BKV(待测样本)PCR反应
[0129] (1)按以下比例进行BKV PCR反应混合液配制与加样:PCR反应液25yLX (n+7:四个 定量标准品和一个BKV阴性质控品、一个BKV临界阳性质控品、一个BKV阳性质控品），每管加 BKV引物探针混合液5yL;振荡混匀，每份30yL分至PCR管中，将提取好的待测样本(该待测样 本为定性检测为阳性的样本)及质控品20yL加到上述PCR管中，进行PCR扩增。
[0130] (2)设置 PCR 扩增反应条件：37°(：，2111丨11;95°(：，3111丨11;然后，94°(：，1〇8,60°(：，358，10 个循环;然后，94°C，10s，60°C，35s (荧光收集），35个循环;25°C，lmin。
[0131] 2、PCR反应结果判读(BK病毒的定量检测结果分析）
[0132] 采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设 在 60。。。
[0133] 结果判断：
[0134] (1)如果内标通道没有出现S型曲线，检测结果无效，应重新检测。高浓度样本(Ct 值<1〇)，由于竞争抑制，内标通道无 S型曲线属于正常情况。
[0135] (2)如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测无 S型曲线，则检测报告为"低于 最低检出限（500copies/mL)"。
[0136] (3)如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线，则有如下解释：
[0137] (4)如果待测样本测定值显示<500C〇pieS/mL，则报告为"低于最低检出限 (500copies/mL)"。
[0138] (5)测定值在5 X 102copies/mL~1 X 103copies/mL之间的样本，直接报告数值，并 注明"供参考"。
[0139] (6)测定值在1 X 103copies/mL~1 X 109copies/mL之间的样本，直接报告所测定的 数值；
[0140] (7)测定值>1 X 109copies/mL的样本，则报告为"高于 1 ·0Χ 109copies/mL"。如果 需要精确定量结果，可将样本用BKV阴性质控品稀释至线性范围后重新测定，并根据下面公 式计算样本浓度，结果注明为可报告数值。
[0141] 可报告数值(最终样本浓度）=稀释后浓度X稀释倍数 [0142 ]稀释倍数=(样本量+稀释液量)/样本量。
[0143]利用BKV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度(copies/mL)。检 测反应时，将标准品按如下赋值，BKV定量标准品I(5X 107copies/mL)、BKV定量标准品Π (5 X 106copies/mL)、BKV定量标准品ΙΠ (5 X 105copies/mL)、BKV定量标准品IV(5 X 104copies/ mL)与样品同时检测，如图2为定量标准品扩增曲线，图3为标准品与待测样本扩增曲线。根 据定量标准品浓度与检测结果Ct值，系统自动生成一条标准曲线。根据待测样品的检测Ct 值，可计算出样品中靶基因的浓度。
[0144] 利用上述方法对6例BK病毒尿液样本进行定量检测，通过计算机生成的标准曲线。 计算图3中6个待测样本(如图3所示，除4个标准品曲线外的6个曲线为待测样本曲线)从左 至右浓度分别为:尿液样本分别3 · 9 X 108copies/mL、7 · 8 X 103copies/mL、5 · 7 X 103copies/ mL、7.8X 102copies/mL、6.4X 102copies/mL、3.3X 102copies/mL。
[0145] 结果验证:将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经BLAST比对后证实为 BK病毒基因序列。
[0146] 实施例4
[0147] 本实施例4提供一种检测BK病毒的试剂盒。
[0148] 检测BK病毒的试剂盒，包括:上游引物:BKV-F，下游引物:BKV-R，Taqman荧光探针 BKV-FP，
[0149] 所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID N0:1所示的碱基序列；
[0150] 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列；
[0151] 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID N0:3所示的碱基序列。
[0152] 优选的，该试剂盒还包括：内标上游引物、内标下游引物、内标探针。内标质控体系 参与提取与扩增。用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内 标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。
[0153] 优选的，该试剂盒，还包括:BKV阴性质控品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品 和BKV定量标准品I~IV，其中BKV阴性质控品无菌生理盐水，BKV定量标准品I~IV的待测模 板包括BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。所述BKV 临界阳性质控品为浓度1 .〇 X 104copies/mL的BKV阳性尿液样本。
[0154] 优选的，BKV定量标准品I~IV、BKV临界阳性质控品、BKV阳性质控品的构建方法包 括以下步骤：
[0155] (1)提取临床尿液样本，经定量后选取高浓度尿液样本；
[0156] (2)使用灭菌后生理盐水将所定量高浓度尿液样本进行稀释，稀释成4个梯度2.5 X 108~2.5 X 105copies/mL，分别作为试剂盒的BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定 量标准品III、BKV定量标准品IV，另分别稀释至2.5X10 6copies/mL和lX104copies/mL作为 试剂盒的BKV阳性质控品和BKV临界阳性质控品。
[0157] 优选的，该试剂盒，包括:裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉剂、 BKV引物探针混合液、PCR反应液、BKV定量标准品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、BKV 阴性质控品、BKV内标质控品。
[0158] 优选的，各组分组成及制造方法为：
[0159] (1)裂解液：100mL用量为例，盐酸胍40.47g、三(羟甲基)氨基甲烷0.5132g、氯化钠 0.0932g、吐温-20 6.78mL，加入16mL纯水，于恒温加热磁力搅拌器中约70°C加热搅拌至完 全溶解，泡沫消除后定容至100mL后，盐酸调节至pH7.0。分装量为4.8mL/瓶。
[0160] 此外，关于裂解液配制成分中盐酸胍可替换成异硫氰酸胍、三(羟甲基)氨基甲烷 可替换成三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、吐温-20可替换成曲拉通100。
[0161] (2)洗液l:100mL用量为例，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐0.5731g、乙二胺四乙酸二 钠0.1353g，加入纯水约80mL，溶解后纯水定容至终体积100mL后，NaOH溶液调节液体pH至 6.5。分装量为6.6mL/瓶。
[0162] 此外，关于洗液1配制成分可三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐可替换成三(羟甲基)氨 基甲烷，乙二胺四乙酸二钠可替换成乙二胺四乙酸。
[0163] (3)洗液2:纯水。分装量为3 · 6mL/瓶。
[0164] (4)洗脱液：100mL用量为例，三（羟甲基）氨基甲烷0.1211g，10.00mL10mMEDTA， 70mL纯水，溶解均匀，盐酸调节为pH8.5，定容。分装量为1200yL/管。
[0165] (5)磁珠:购买商品化磁珠直接分装。分装量为480μ!7管。
[0166] (6)蛋白酶Κ:将购买商品化蛋白酶Κ稀释至20mg/mL直接分装。分装量为240μ!7管。
[0167] (7)助沉剂:将购买商品化助沉剂直接分装。分装量为196μ!7管。
[0168] (8)BKV引物探针混合液:BKV引物探针混合液具体组成成分为:BKV-F( 20μΜ) lyL， BKV-R( 20μΜ) lyL，BKV-FP(1 ΟμΜ)0 · 8yL，内标上游引物（20μΜ)0 · 5yL，内标下游引物（20μΜ) 0.5yL，内标探针（10μΜ)0.375yL，纯化水0.825yL。分装量为120yL/管。
[0169] (9)PCR反应液：PCR反应液组成为：10 X reaction buff er5yL，10mM dNTP Mix 4μ L，Taq DNA Polymerasel.2yL，UDG 0.2yL，10mM dUTPlyL，纯化水 13.6yL。分装量为600yL/ 管。
[0170] 为了防止污染，本实施例提供的PCR反应液含有UDG酶防污染体系。特选取含UDG酶 及dUTP的体系，其作用原理为:在PCR反应中以dUTP替代dTTP掺入DNA中，就会形成含dUTP碱 基的PCR扩增产物，而UDG酶能选择性断裂单链和双链DNA中U基的糖苷键，从而降解该PCR扩 增产物。
[0171] (10)BKV定量标准品：定量标准品均为生理盐水稀释后尿液样本，浓度分别为:BKV 定量标准品1(2 · 5 X 108copies/mL)、BKV定量标准品 Π (2.5 X 107copies/mL)、BKV定量标准 品 ΙΠ (2 · 5 X 106copies/mL)、BKV定量标准品IV(2 · 5 X 105copies/mL)。分装量为600yL/管。
[0172] (11 )BKV阳性质控品：BKV阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度为2.5 X 106(3<^丨68/111匕分装量为60(^1^/管。
[0173] (12) BKV临界阳性质控品：BKV临界阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度 为1 X 104copies/mL。分装量为 600yL/管。
[0174] (13)BKV阴性质控品:BKV阴性质控品为灭菌生理盐水。分装量为600yL/管。
[0175] (14)BKV内标质控品:BKV内标质控品为体外构建的重组质粒。分装量为130μ!7管。
[0176]优选的，该试剂盒组成为，裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉剂、 BKV引物探针混合液、PCR反应液、BKV定量标准品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、BKV 阴性质控品、BKV内标质控品，各组分含量为： 蛋白酶Κ 240 μ|χ1 :
[0177] 助混剂 196μΙ><1 ; 裂解液 4.8m.|xl ; 磁珠 480μ|χ1 ; 洗液丨 6.6 ηι1χ 1 ; 洗液 2 3.6 mix 1 ; 洗脱液 1200μ|χ1 ; 引物探针混合液 120μ1><1 ; PCR 反应液 6()0μ|χ1; BKV阳性质控品 600 μLχ?
[0178] BKV临界阳性质控品 600 μ|χ 1 BKV阴性质控品 600 μ丨X1 ; BKV定量标准品I 600 μ|χ丨； B1CV定量标准品II 600 μ|χ 1; BKV定量标准品ΠΙ 600 μLχ?: BKV定量标准品IV 600 μ!xl ; BKy内标质控品 130 μLχ? ο
[0179] 上述检测ΒΚ病毒的试剂盒，应用于ΒΚ病毒的检测。该检测可以为定性检测和/或定 量检测。
[0180]与现有技术相比，本发明所述的ΒΚ病毒的检测方法、试剂盒，达到了如下效果：
[0181] 1.本发明中磁珠法实现了人类尿液样本中BKV提取操作，磁珠法有效快速的提取 了样本DNA。
[0182] 2.本发明中所涉及的试剂盒中设置BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、定量标 准品均为尿液样本，参与核酸提取及扩增，全面真实反映核酸提取和扩增，对待测样本进行 准确定标。
[0183] 3.本发明使用尿苷酶(UDG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止 先前PCR扩增产物的污染。
[0184] 4.本发明采用内标质控体系，内标参与样本提取与扩增，用于监测反应体系可能 存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突 的另一检测通道。
[0185] 5.本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到500copies/mL;同时，本发明的检 测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如JC病毒(JCV)，丙肝病毒(HCV)， 人巨细胞病毒(HCMV)和乙型肝炎病毒(HBV);
[0186] 6.本发明的检测方法反应快速，一般1.5到2小时即可得到检测结果，并且成本低， 适合于大规模临床开展。从而实现对BK病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及 时的病理诊治及治疗效果监测。
[0187] 由于方法部分已经对本申请实施例进行了详细描述，这里对实施例中涉及的系统 与方法对应部分的展开描述省略，不再赘述。对于系统中具体内容的描述可参考方法实施 例的内容，这里不再具体限定。
[0188] 上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申 请所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1 .BK病毒的检测方法，包括如下步骤： 待测样本获取： 采用磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA，获得待测样本； PCR扩增反应： 将提取的BKV DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增； 所述PCR反应混合液，包括:PCR反应液、BKV引物探针混合液， 所述BKV引物探针混合液，包括，上游引物BKV-F，下游引物BKV-R，Taqman荧光探针BKV-FP，纯化水； 所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID N0:1所示的碱基序列； 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列； 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID NO: 3所示的碱基序列，所述Taqman荧光探 针BKV-FP5 '端有荧光报告基团，3 '端有荧光淬灭基团； 结果检测： 采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针BKV-FP5' 端荧光基团对应的荧光素，在60°C收集荧光信号。2. 根据权利要求1所述的BK病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为： 37°(：，211^11;95°(：，311^11 ;然后，94°(：，108,60°(：，358，10个循环；然后，94°(：，108,60°(：，358,35 个循环；25°C，lmin。3. 根据权利要求1所述的BK病毒的检测方法，其特征在于，所述BKV引物探针混合液，还 包括：内标上游引物，内标下游引物，内标探针。4. 根据权利要求1所述的BK病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应，还包括： 平行设置BKV阴性质控品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品和BKV定量标准品I~IV反 应组，所述BKV阴性质控品为无菌生理盐水，所述BKV临界阳性质控品为浓度1.0 X 104copies/mL的BKV阳性尿液样本;BKV阳性质控品为浓度1.0 X 106copies/mL的BKV阳性尿 液样本；BKV定量标准品I~IV，包括BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品 III、BKV定量标准品IV。5. 根据权利要求1所述BK病毒的检测方法，其特征在于，所述的Taqman荧光探针BKV-FP 的荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光 素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4 '，5-二氯-2 '，7 二甲氧 基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种;所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞 淬灭剂3中的至少一种。6. 根据权利要求1所述的BK病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR反应液，包括UDG酶 防污染体系，所述UDG酶防污染体系，包括:UDG酶及dUTP。7. 检测BK病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的上游引物BKV-F，下游引物 BKV-R，Taqman 荧光探针 BKV-FP， 所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID NO: 1所示的碱基序列； 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列； 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列。8. 根据权利要求7所述的检测BK病毒的试剂盒，其特征在于，还包括：内标上游引物、内 标下游引物、内标探针、BKV阴性质控品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品和BKV定量标 准品I~IV，其中BKV阴性质控品无菌生理盐水，BKV定量标准品I~IV的待测模板分别为BKV 定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。9. 根据权利要求7或8任一项所述的检测BK病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包 括:裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉剂、BKV引物探针混合液、PCR反应液、 BKV定量标准品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、BKV阴性质控品、BKV内标质控品，各 组分含量为： 蛋白酶Κ 240μ1χ1; 助沉剂 196μ1χ1 裂解液 4.8mhl ; 磁珠 480μ1Χ? ; 洗液丨 6.6 mlχ 1 :; 洗液 2 3.6 mlxl ; 洗脱液 1200μ1χ1 引物探针混合液 120 μLχ 1 ; PCR 反应液 6〇〇 μ1χ1; BKV阳性质控品 600 μLχ 1 BKV临界阳性质控品 600 μLχ 1 BKV阴性质控品 600 μ丨y ; BKV定量标准品I 600 μ丨X1 ; BKV定量标准品II 600 μLχ? ; BKV定量标准品ΓΠ 600 μLχ?; 定量标准品?ν 600 μ1χ1 ; BKV内标质控品 ΠΟμΙχΙ。10. 权利要求7-9任一项所述的检测BK病毒的试剂盒，用于BK病毒的检测。
【文档编号】C12Q1/68GK106065420SQ201610615999
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】叶锋, 刘明坤, 余荣
【申请人】北京思尔成生物技术有限公司
【专利摘要】本申请公开了BK病毒的检测方法,包括如下步骤：采用磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA，获得待测样本；PCR扩增反应；采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针BKV?FP5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号。本申请还公开了检测BK病毒的试剂盒。本发明的检测方法、试剂盒敏感性高，最低检出可达到500copies/mL；同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如JC病毒(JCV)，丙肝病毒(HCV)，人巨细胞病毒(HCMV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
【专利说明】
BK病毒的检测方法、试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种病毒的检测方法、试剂盒及其应用，具体讲，涉及BK病毒的检测方 法、试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] BK病毒(BKV)是一种无囊膜的环状双链DNA病毒，与JC病毒(JC virus，JCV)、SV40 病毒同属于多瘤病毒家族，是多瘤病毒属的一个亚群，以人为自然宿主。
[0003] BK病毒原发感染发生在在儿童时期，一般存在于人体泌尿道及外周血白细胞中， 约0.5%~20%感染者会出现BKV激活，导致病毒复制，一般不会引起肾功能损害。但在接受 免疫抑制剂治疗的人群中，特别是肾移植术后患者，BKV再激活率会明显增高，并可能导致 BKV相关性肾病（BKV associated nephropathy，BKVAN)〇
[0004] 肾脏是健康人BKV潜伏感染的主要部位，10%~60%肾移植术后患者可在尿液中 检测到BKV，其中多数患者表现为无症状病毒血症或暂时的移植肾功能异常，偶可在切除的 移植肾样本中发现病毒引起的组织损伤。BKVAN相关研究发现，约5%的肾移植受者可发生 BKVAN，其中约45 %会出现移植肾失功。
[0005] 近年研究发现，初次感染BKV后，BKV常潜伏于肾小管上皮细胞及尿路移行上皮细 胞内，当宿主免疫力下降时，BKV可再次激活并开始迅速大量复制。肾移植术后患者中BKV再 激活的发生率约为10%~68%，约1 %~7%的肾移植患者术后会出现BKVAN。肾移植术后的 免疫抑制剂治疗可使BKV发生较高水平的复制，造成受感染细胞出现松解和破坏，并发生组 织炎性细胞浸润，导致肾脏组织结构破坏，最终影响其功能。
[0006] BKV-DNA常规检测方法主要有细胞学检查-尿中诱饵细胞检测、病理穿刺活检以及 荧光定量PCR检测。穿刺活检是诊断BKVAN的金标准、优点在于可以明确的诊断，对治疗有一 定帮助，但是穿刺活检是创伤性检查，患者比较痛苦，且费用较高。
[0007] 荧光定量PCR技术是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量 检测技术。荧光定量PCR使用特异性探针，能够对靶序列进行特异性识别，具有引物探针双 重控制，在扩增指数期进行定量，具有很高的特异性、准确性、灵敏性及假阳性率低等特点。
[0008] 本产品采用荧光定量PCR技术，用于定量检测人类晨尿样本中的BKV DNA。以BK病 毒保守基因序列为检测目的片段，该检测结果不得作为患者病情单独的评价指标，必须结 合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行评价，还可通过对患者BKV DNA水平和 变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。本试剂不用作BK病毒的血 源筛查。
[0009] 目前，国内外临床应用BK病毒荧光定量PCR主要如下：
[001 0] 1.核酸提取方法:磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法。
[0011] 2.定量标准品：大多标准品不参与核酸提取，不能全面真实反映核酸提取和扩增， 不能对待测样本进行准确定标。
[0012 ] 3. BK V阳性质控品和BKV临界阳性质控品：大多数定量检测试剂盒未设置BK V阳性 质控品和BKV临界阳性质控品，不能很好监控核酸提取与扩增。
[0013] 使用本发明中的ΒΚ病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法），使用磁珠提取方法， 可以有效进行核酸提取，在本发明中，我们使用的定量标准品、BKV阳性质控品及BKV临界阳 性质控品均来源于灭活阳性尿液样本，可以与待测样本同时进行提取与扩增，从而可以全 程监控样本提取与扩增，从而对待测样本进行准确定标。
【发明内容】
[0014] 本申请解决的主要问题是提供ΒΚ病毒的检测方法及试剂盒，以解决无法实现的技 术问题。
[0015]为了解决上述技术问题，本发明公开了 ΒΚ病毒的检测方法，包括如下步骤：
[0016] 待测样本获取：
[0017] 采用磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA，获得待测样本；
[0018] PCR扩增反应：
[0019] 将提取的BKV DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增；
[0020] 所述PCR反应混合液，包括:PCR反应液、BKV引物探针混合液，
[0021] 所述BKV引物探针混合液，包括，上游引物BKV-F，下游引物BKV-R，Taqman荧光探针 BKV-FP，纯化水；
[0022] 所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID N0:1所示的碱基序列；
[0023] 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列；
[0024] 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID N0: 3所示的碱基序列，所述Taqman荧 光探针BKV-FP5 '端有荧光报告基团，3 '端有荧光淬灭基团；
[0025]结果检测：
[0026]采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针BKV-FP5'端荧光基团对应的荧光素，在60°C收集荧光信号，
[0027] 进一步地，所述PCR扩增反应的条件为：37°C，2min; 95°C，3min;然后，94°C，10s，60 °C，35s，10个循环;然后，94°C，10s，60 °C，35s，35个循环;25 °C，lmin。
[0028] 进一步地，所述BKV引物探针混合液，还包括：内标上游引物，内标下游引物，内标 探针。
[0029] 进一步地，所述PCR扩增反应，还包括:平行设置BKV阴性质控品、BKV阳性质控品、 BKV临界阳性质控品和BKV定量标准品I~IV反应组，所述BKV阴性质控品为无菌生理盐水， 所述BKV临界阳性质控品为浓度1.0乂10 4〇叩1^/1^的他￥阳性尿液样本;81^阳性质控品为 浓度1.0 X 106copies/mL的BKV阳性尿液样本;BKV定量标准品I~IV，包括BKV定量标准品I、 BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。
[0030] 进一步地，所述的Taqman荧光探针BKV-FP的荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六 氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹 明、磺酰罗丹明、6-羧基-4'，5_二氯-2'，7'_二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或 花菁5.5中的至少一种;所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯 偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。
[0031] 进一步地，所述PCR反应液，包括UDG酶防污染体系，所述UDG酶防污染体系，包括： UDG 酶及 dUTP。
[0032]本申请还提供检测BK病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的上游引物 BKV-F，下游引物 BKV-R，Taqman 荧光探针 BKV-FP，
[0033] 所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID N0:1所示的碱基序列；
[0034] 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列；
[0035] 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID N0:3所示的碱基序列。
[0036] 进一步地，该试剂盒还包括：内标上游引物、内标下游引物、内标探针、BKV阴性质 控品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品和BKV定量标准品I~IV，其中BKV阴性质控品无 菌生理盐水，BKV定量标准品I~IV的待测模板分别为BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、 BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。
[0037] 进一步地，所述试剂盒包括:裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉 剂、BKV引物探针混合液、PCR反应液、BKV定量标准品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、 BKV阴性质控品、BKV内标质控品，各组分含量为： 蛋白酶丨（ 240 μLχ?; 助沉剂 196μ|χΙ ; 裂解液 4.8m|xl ; 磁珠 480 μ1χ1 洗液 1 6 6 ml.xl 洗液 2 3.6 mix 1 ? 洗脱液 1200 μLχ? ; 引物探针混合液 120μ1><1
[0038] PCR 反应液 600 μ Μ; BKV阳性质控品 600 μLχ? BKV临界阳性质控品 600 μ丨X1 BKV阴性质控品 600 μΜ ; BKV定量标准品I 600 μ丨X丨； BKV定量标准品II 600 μLχ? ; BKV定量标准品III 600 μ1χ[; BKV定量标准品IV 600 μΜ ; BKV内标质控品 ]30μ|χ1。
[0039] 本申请提供的检测BK病毒的试剂盒，用于BK病毒的检测。
[0040] 与现有技术相比，本发明所述的BK病毒的检测方法、试剂盒，达到了如下效果：
[0041] 1.本发明中磁珠法实现了人类尿液样本中BKV提取操作，磁珠法有效快速的提取 了样本DNA。
[0042] 2.本发明中所涉及的试剂盒中设置BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、定量标 准品均为尿液样本，参与核酸提取及扩增，全面真实反映核酸提取和扩增，对待测样本进行 准确定标。
[0043] 3.本发明使用尿苷酶(UDG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止 先前PCR扩增产物的污染。
[0044] 4.本发明采用内标质控体系，内标参与样本提取与扩增，用于监测反应体系可能 存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突 的另一检测通道。
[0045] 5.本发明的检测方法、试剂盒敏感性高，最低检出可达到500copies/mL;同时，本 发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如JC病毒(JCV)，丙肝病 毒(HCV)，人巨细胞病毒(HCMV)和乙型肝炎病毒(HBV);
[0046] 6.本发明的检测方法反应快速，一般1.5到2小时即可得到检测结果，并且成本低， 适合于大规模临床开展。从而实现对BK病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及 时的病理诊治及治疗效果监测。
【附图说明】
[0047]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： [0048]图1是本发明实施例2所述BK病毒定性检测结果图。
[0049]图2是本发明实施例3所述BK病毒定量检测标准品检测结果图。
[0050]图3是本发明实施例3所述BK病毒定量检测标准品和待测样品检测结果图。
【具体实施方式】
[0051]如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应 可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名 称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通 篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为一开放式用语，故应解释成"包含但不限定 于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述 技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述 描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围 当视所附权利要求所界定者为准。
[0052]以下结合附图对本申请作进一步详细说明，但不作为对本申请的限定。下文为了 叙述方便，下文中所称的"左""右""上""下"等与附图本身左、右、上、下等方向一致。
[0053] 实施例1
[0054]本实施例提供待测样本获取的方法：
[0055] 采用磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA，获得待测样本。磁珠法提取核酸使用独 特的裂解液和蛋白酶K迅速裂解细胞并灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA选择性吸附于磁 珠，再通过一系列快速的漂洗-分离的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等 杂质去除，最后用双蒸水即可将纯净基因组DNA从磁珠上洗脱。
[0056] 1、磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA所用试剂及成分
[0057] (1)裂解液：1 OOmL用量为例，盐酸胍40.47g、三(羟甲基)氨基甲烷0.5132g、氯化钠 0.0932g、吐温-20 6.78mL，加入16mL纯水，于恒温加热磁力搅拌器中约70°C加热搅拌至完 全溶解，泡沫消除后定容至100mL后，盐酸调节至pH7.0。
[0058]此外，关于裂解液配制成分中盐酸胍可替换成异硫氰酸胍、三(羟甲基）氨基甲烷 可替换成三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、吐温-20可替换成曲拉通100。
[0059] (2)洗液l:100mL用量为例，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐0.5731g、乙二胺四乙酸二 钠0.1353g，加入纯水约80mL，溶解后纯水定容至终体积100mL后，NaOH溶液调节液体pH至 6.5〇
[0060]此外，关于洗液1配制成分可三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐可替换成三(羟甲基)氨 基甲烷，乙二胺四乙酸二钠可替换成乙二胺四乙酸。
[0061 ] (3)洗液2:纯水。
[0062] (4)洗脱液：100mL用量为例，三（羟甲基）氨基甲烷0.1211g，10.00mL10mMEDTA， 70mL纯水，溶解均匀，盐酸调节为pH8.5，定容。
[0063] (5)磁珠:购买商品化磁珠。
[0064] (6)蛋白酶K:将购买商品化蛋白酶K稀释至20mg/mL。
[0065] (7)助沉剂:将购买商品化助沉剂。
[0066] 2、采用磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA具体方法如下：
[0067]①使用前向裂解液中加入2.4mL异丙醇，向洗液1中加入5.4mL乙醇，洗液2中加入 8.4mL乙醇，摇匀后若裂解液中有不溶物，请于70°C下温育至溶解，冷却后即可使用。
[0068]②将尿液送检管振荡15s，彻底混匀后立即取lmL至1.5mL离心管中（若样本不足 lmL，请用生理盐水稀释一定倍数后移取lmL)，13000rpm离心10min后小心弃去上清(可残余 10yL左右液体以免遗弃目的物），注意避免触碰离心管底。
[0069] 注:BKV阴性质控品、BKV临界阳性质控品、BKV阳性质控品及定量标准品I-Ι V:融化 并振荡混勾后取200yL各加到1.5mL离心管中，补加生理盐水至lmL，13000rpm离心10min后 小心弃去上清。
[0070] ③向离心管内加入10yL蛋白酶K、4yL助沉剂、300yL裂解液，20yL磁珠(每次吸取前 需颠倒或使用移液器吹吸混匀磁珠），5yL内标质控品，漩涡振荡混匀各离心管10s，于室温 轻柔颠倒混匀l〇min，使磁珠和核酸充分结合。
[0071] ④将离心管放在磁分离架上，反复颠倒磁分离架将离心管盖上的磁珠冲洗下来， 静置lmin后弃去上清液。
[0072]⑤加入500yL洗液1，漩涡振荡3~5s使磁珠重新悬浮，然后置于磁分离架上，反复 颠倒磁分离架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置lmin后弃去上清液。
[0073]⑥加入500yL洗液2,漩涡振荡3~5s使磁珠重新悬浮，然后置于磁分离架上，反复 颠倒磁分离架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置lmin后弃去上清液，并尽量吸弃管底残 余液体，瞭干5min。
[0074] ⑦加入50yL洗脱液，用移液枪缓慢吹打管壁上的磁珠使之浸于洗脱液中，55°C温 育5min，期间轻轻晃动溶液两次。
[0075] ⑧将离心管置于磁分离架上静置lmin，磁分离后及时将上清液转移至新的无核酸 酶离心管中，此上清即为提取到BKV DNA，即待测样本。
[0076] 实施例2
[0077] BK病毒的定性检测
[0078]本实施例2提供一种BK病毒的定性检测方法：
[0079] 1、BKV DNA的PCR扩增反应
[0080] 1)BKV DNA的PCR扩增反应所用试剂及成分
[0081] (l)BKV引物探针混合液：
[0082] BKV引物探针混合液具体组成成分为:上游引物BKV-F( 20μΜ) lyL，下游引物BKV-R (20μΜ) lyL，Taqman 荧光探针 BKV-FP( ΙΟμΜ) 0 · 8yL，纯化水 2 · 2yL。
[0083] 优选BKV引物探针混合液的组分为:上游引物BKV-F( 20μΜ) lyL，下游引物BKV-R( 20 μΜ) lyL，Taqman荧光探针BKV-FP(10μΜ)0 · 8yL，内标上游引物（20μΜ)0 · 5yL，内标下游引物 (20μΜ) 0 · 5yL，内标探针（1 ΟμΜ) 0 · 375yL，纯化水0 · 825yL。
[0084] 所述上游引物BKV-F包含如SEQIDN0:1所示的碱基序列；
[0085] 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列；
[0086] 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID如:3所示的碱基序列，所述了3911^11荧 光探针BKV-FP 5'端有荧光报告基团，3'端有荧光淬灭基团。
[0087] 所述的Taqman荧光探针BKV-FP的荧光报告基团选自6-羧基荧光素（6_ carboxyf luorescein，6_FAM)、六氯-6-甲基焚光素、VIC焚光染料、四氯-6-羧基焚光素、羧 基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4 '，5-二氯-2 '，7 二甲氧基荧光 素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种;所述荧光淬灭基团选自6-羧基四 甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基）苯甲酸、黑洞淬灭剂l(Black Hole Quencher 1， BHQ1)、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种；
[0088]优选的，当荧光淬灭基团选自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时，焚光报告基 团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4'，5'_二氯-2'，7'_二甲氧基荧光素琥 珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种；
[0089]当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、 四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4'，5'_二氯-2'，7'_二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少一种；
[0090] 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4'，5'_二氯-2'，7'_二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光 素或花菁3中的至少一种；
[0091] 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花 菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种；
[0092] 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5.5中的一 种。
[0093]最优选的，所述荧光报告基团为6-FAM;所述荧光淬灭基团为BHQ1。
[0094] (2)PCR 反应液：
[0095] PCR 反应液组成为：10Xreaction buffer5yL，10mM dNTP Mix 4yL，Taq DNA Polymerasel.2yL，UDG 0.2yL，10mM dUTPlyL，纯化水 13.6yL。
[0096] 2)BKV DNA(待测样本)PCR反应
[0097] (1)按以下比例进行BKV PCR反应混合液配制与加样:PCR反应液25yL，BKV引物探 针混合液5yL加到PCR管中，振荡混匀，将提取好的待测样本20yL加到上述PCR管中，进行PCR 扩增。
[0098] (2)PCR反应的反应条件设置为：37°C，2min; 95 °C，3min;然后，94°C，10s，60°C， 35s，10个循环;然后，94°C，10s，60°C，35s(荧光收集），35个循环；25°C，lmin。
[0099] 2、PCR反应结果判读(BK病毒的定性检测结果分析）
[0100]本实施例2采用最优方案，即BKV引物探针混合液含内标，所述Taqman荧光探针 BKV-FP的荧光报告基团为6-FAM;荧光淬灭基团为BHQ1。
[0101]本实施例2采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为对应荧光素，本实 施例设定为FAM、VIC荧光素，荧光信号收集设在60°C。
[0102] BKV引物探针混合液有无内标，不影响待检样品通道曲线的响应，即BK病毒检出为 阳性时，待检样品对应通道会出现S型曲线;BK病毒检出为阴性时，待检样品对应通道不出 现S型曲线。
[0103] 本实施2采用BKV引物探针混合液含内标，所述Taqman荧光探针BKV-FP的荧光报告 基团为6-FAM;荧光淬灭基团为BHQ1的方案，因此检测结果会包含内标通道曲线：
[0104] 如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测无 S型曲线，判定为BKV阴性;如果内 标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线，判定为BKV阳性。利用上述方法对13例BK 病毒尿液样本、2例JC病毒尿液样本、5例健康人尿液样本，2例丙肝病毒(HCV)血液样本、2例 人巨细胞病毒(HCMV)血液样本，共计24份临床样本进行检测，结果如图1所示：
[0105] 其中，13例检测均为阳性，内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线;健 康人尿液样本，丙肝病毒(HCV)，人巨细胞病毒(HCMV)，JC病毒(JCV)检测均为阴性，内标通 道出现S型曲线，同时FAM通道检测无 S型曲线。
[0106] 本实施例2采用内标质控体系，内标参与样本提取与扩增，用于监测反应体系可能 存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突 的另一检测通道。
[0107] 实施例3
[0108] 本实施例2提供一种BK病毒的定量检测方法：
[0109] 1、BKV DNA的PCR扩增反应
[0110] 1)BKV DNA的PCR扩增反应所用试剂及成分
[0111] (l)BKV引物探针混合液：
[0112] BKV引物探针混合液的组分为:上游引物BKV-F( 20μΜ) lyL，下游引物BKV-R( 20μΜ) 1 yL，Taqman荧光探针BKV-FP(1 ΟμΜ) 0 · 8yL，内标上游引物（20μΜ)0 · 5yL，内标下游引物（20μΜ) 0.5yL，内标探针（ΙΟμΜ) 0.375yL，纯化水0.825yL。
[0113] 所述所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；
[0114] 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列；
[0115] 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQIDN0:3所示的碱基序列，所述荧光报告 基团为6-FAM;所述荧光淬灭基团为BHQ1。
[0116] (2)PCR 反应液：
[0117] PCR 反应液组成为：10Xreaction buffer5yL，10mM dNTP Mix 4yL，Taq DNA Polymerasel.2yL，UDG 0.2yL，10mM dUTPlyL，纯化水 13.6yL。
[0118] (3)BKV定量标准品：
[0119] 定量标准品均为生理盐水稀释后尿液样本，浓度分别为:BKV定量标准品I (2.5 X 108copies/mL)、BKV定量标准品 Π (2.5X 107copies/mL)、BKV定量标准品 ΙΠ (2 · 5 X 106copies/mL)、BKV定量标准品IV(2 · 5 X 105copies/mL)。
[0120] (4)BKV阳性质控品：
[0121] BKV阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度为2.5X106copies/mL。
[0122] (5)BKV临界阳性质控品
[0123] BKV临界阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度为1 X 104copies/mL。
[0124] (6)BKV阴性质控品：
[0125] BKV阴性质控品为灭菌生理盐水。
[0126] (7)BKV内标质控品：
[0127] BKV内标质控品为体外构建的重组质粒。
[0128] 2)BKV(待测样本)PCR反应
[0129] (1)按以下比例进行BKV PCR反应混合液配制与加样:PCR反应液25yLX (n+7:四个 定量标准品和一个BKV阴性质控品、一个BKV临界阳性质控品、一个BKV阳性质控品），每管加 BKV引物探针混合液5yL;振荡混匀，每份30yL分至PCR管中，将提取好的待测样本(该待测样 本为定性检测为阳性的样本)及质控品20yL加到上述PCR管中，进行PCR扩增。
[0130] (2)设置 PCR 扩增反应条件：37°(：，2111丨11;95°(：，3111丨11;然后，94°(：，1〇8,60°(：，358，10 个循环;然后，94°C，10s，60°C，35s (荧光收集），35个循环;25°C，lmin。
[0131] 2、PCR反应结果判读(BK病毒的定量检测结果分析）
[0132] 采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设 在 60。。。
[0133] 结果判断：
[0134] (1)如果内标通道没有出现S型曲线，检测结果无效，应重新检测。高浓度样本(Ct 值<1〇)，由于竞争抑制，内标通道无 S型曲线属于正常情况。
[0135] (2)如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测无 S型曲线，则检测报告为"低于 最低检出限（500copies/mL)"。
[0136] (3)如果内标通道出现S型曲线，同时FAM通道检测有S型曲线，则有如下解释：
[0137] (4)如果待测样本测定值显示<500C〇pieS/mL，则报告为"低于最低检出限 (500copies/mL)"。
[0138] (5)测定值在5 X 102copies/mL~1 X 103copies/mL之间的样本，直接报告数值，并 注明"供参考"。
[0139] (6)测定值在1 X 103copies/mL~1 X 109copies/mL之间的样本，直接报告所测定的 数值；
[0140] (7)测定值>1 X 109copies/mL的样本，则报告为"高于 1 ·0Χ 109copies/mL"。如果 需要精确定量结果，可将样本用BKV阴性质控品稀释至线性范围后重新测定，并根据下面公 式计算样本浓度，结果注明为可报告数值。
[0141] 可报告数值(最终样本浓度）=稀释后浓度X稀释倍数 [0142 ]稀释倍数=(样本量+稀释液量)/样本量。
[0143]利用BKV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度(copies/mL)。检 测反应时，将标准品按如下赋值，BKV定量标准品I(5X 107copies/mL)、BKV定量标准品Π (5 X 106copies/mL)、BKV定量标准品ΙΠ (5 X 105copies/mL)、BKV定量标准品IV(5 X 104copies/ mL)与样品同时检测，如图2为定量标准品扩增曲线，图3为标准品与待测样本扩增曲线。根 据定量标准品浓度与检测结果Ct值，系统自动生成一条标准曲线。根据待测样品的检测Ct 值，可计算出样品中靶基因的浓度。
[0144] 利用上述方法对6例BK病毒尿液样本进行定量检测，通过计算机生成的标准曲线。 计算图3中6个待测样本(如图3所示，除4个标准品曲线外的6个曲线为待测样本曲线)从左 至右浓度分别为:尿液样本分别3 · 9 X 108copies/mL、7 · 8 X 103copies/mL、5 · 7 X 103copies/ mL、7.8X 102copies/mL、6.4X 102copies/mL、3.3X 102copies/mL。
[0145] 结果验证:将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经BLAST比对后证实为 BK病毒基因序列。
[0146] 实施例4
[0147] 本实施例4提供一种检测BK病毒的试剂盒。
[0148] 检测BK病毒的试剂盒，包括:上游引物:BKV-F，下游引物:BKV-R，Taqman荧光探针 BKV-FP，
[0149] 所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID N0:1所示的碱基序列；
[0150] 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列；
[0151] 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID N0:3所示的碱基序列。
[0152] 优选的，该试剂盒还包括：内标上游引物、内标下游引物、内标探针。内标质控体系 参与提取与扩增。用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内 标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。
[0153] 优选的，该试剂盒，还包括:BKV阴性质控品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品 和BKV定量标准品I~IV，其中BKV阴性质控品无菌生理盐水，BKV定量标准品I~IV的待测模 板包括BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。所述BKV 临界阳性质控品为浓度1 .〇 X 104copies/mL的BKV阳性尿液样本。
[0154] 优选的，BKV定量标准品I~IV、BKV临界阳性质控品、BKV阳性质控品的构建方法包 括以下步骤：
[0155] (1)提取临床尿液样本，经定量后选取高浓度尿液样本；
[0156] (2)使用灭菌后生理盐水将所定量高浓度尿液样本进行稀释，稀释成4个梯度2.5 X 108~2.5 X 105copies/mL，分别作为试剂盒的BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定 量标准品III、BKV定量标准品IV，另分别稀释至2.5X10 6copies/mL和lX104copies/mL作为 试剂盒的BKV阳性质控品和BKV临界阳性质控品。
[0157] 优选的，该试剂盒，包括:裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉剂、 BKV引物探针混合液、PCR反应液、BKV定量标准品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、BKV 阴性质控品、BKV内标质控品。
[0158] 优选的，各组分组成及制造方法为：
[0159] (1)裂解液：100mL用量为例，盐酸胍40.47g、三(羟甲基)氨基甲烷0.5132g、氯化钠 0.0932g、吐温-20 6.78mL，加入16mL纯水，于恒温加热磁力搅拌器中约70°C加热搅拌至完 全溶解，泡沫消除后定容至100mL后，盐酸调节至pH7.0。分装量为4.8mL/瓶。
[0160] 此外，关于裂解液配制成分中盐酸胍可替换成异硫氰酸胍、三(羟甲基)氨基甲烷 可替换成三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、吐温-20可替换成曲拉通100。
[0161] (2)洗液l:100mL用量为例，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐0.5731g、乙二胺四乙酸二 钠0.1353g，加入纯水约80mL，溶解后纯水定容至终体积100mL后，NaOH溶液调节液体pH至 6.5。分装量为6.6mL/瓶。
[0162] 此外，关于洗液1配制成分可三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐可替换成三(羟甲基)氨 基甲烷，乙二胺四乙酸二钠可替换成乙二胺四乙酸。
[0163] (3)洗液2:纯水。分装量为3 · 6mL/瓶。
[0164] (4)洗脱液：100mL用量为例，三（羟甲基）氨基甲烷0.1211g，10.00mL10mMEDTA， 70mL纯水，溶解均匀，盐酸调节为pH8.5，定容。分装量为1200yL/管。
[0165] (5)磁珠:购买商品化磁珠直接分装。分装量为480μ!7管。
[0166] (6)蛋白酶Κ:将购买商品化蛋白酶Κ稀释至20mg/mL直接分装。分装量为240μ!7管。
[0167] (7)助沉剂:将购买商品化助沉剂直接分装。分装量为196μ!7管。
[0168] (8)BKV引物探针混合液:BKV引物探针混合液具体组成成分为:BKV-F( 20μΜ) lyL， BKV-R( 20μΜ) lyL，BKV-FP(1 ΟμΜ)0 · 8yL，内标上游引物（20μΜ)0 · 5yL，内标下游引物（20μΜ) 0.5yL，内标探针（10μΜ)0.375yL，纯化水0.825yL。分装量为120yL/管。
[0169] (9)PCR反应液：PCR反应液组成为：10 X reaction buff er5yL，10mM dNTP Mix 4μ L，Taq DNA Polymerasel.2yL，UDG 0.2yL，10mM dUTPlyL，纯化水 13.6yL。分装量为600yL/ 管。
[0170] 为了防止污染，本实施例提供的PCR反应液含有UDG酶防污染体系。特选取含UDG酶 及dUTP的体系，其作用原理为:在PCR反应中以dUTP替代dTTP掺入DNA中，就会形成含dUTP碱 基的PCR扩增产物，而UDG酶能选择性断裂单链和双链DNA中U基的糖苷键，从而降解该PCR扩 增产物。
[0171] (10)BKV定量标准品：定量标准品均为生理盐水稀释后尿液样本，浓度分别为:BKV 定量标准品1(2 · 5 X 108copies/mL)、BKV定量标准品 Π (2.5 X 107copies/mL)、BKV定量标准 品 ΙΠ (2 · 5 X 106copies/mL)、BKV定量标准品IV(2 · 5 X 105copies/mL)。分装量为600yL/管。
[0172] (11 )BKV阳性质控品：BKV阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度为2.5 X 106(3<^丨68/111匕分装量为60(^1^/管。
[0173] (12) BKV临界阳性质控品：BKV临界阳性质控品为生理盐水稀释后尿液样本，浓度 为1 X 104copies/mL。分装量为 600yL/管。
[0174] (13)BKV阴性质控品:BKV阴性质控品为灭菌生理盐水。分装量为600yL/管。
[0175] (14)BKV内标质控品:BKV内标质控品为体外构建的重组质粒。分装量为130μ!7管。
[0176]优选的，该试剂盒组成为，裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉剂、 BKV引物探针混合液、PCR反应液、BKV定量标准品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、BKV 阴性质控品、BKV内标质控品，各组分含量为： 蛋白酶Κ 240 μ|χ1 :
[0177] 助混剂 196μΙ><1 ; 裂解液 4.8m.|xl ; 磁珠 480μ|χ1 ; 洗液丨 6.6 ηι1χ 1 ; 洗液 2 3.6 mix 1 ; 洗脱液 1200μ|χ1 ; 引物探针混合液 120μ1><1 ; PCR 反应液 6()0μ|χ1; BKV阳性质控品 600 μLχ?
[0178] BKV临界阳性质控品 600 μ|χ 1 BKV阴性质控品 600 μ丨X1 ; BKV定量标准品I 600 μ|χ丨； B1CV定量标准品II 600 μ|χ 1; BKV定量标准品ΠΙ 600 μLχ?: BKV定量标准品IV 600 μ!xl ; BKy内标质控品 130 μLχ? ο
[0179] 上述检测ΒΚ病毒的试剂盒，应用于ΒΚ病毒的检测。该检测可以为定性检测和/或定 量检测。
[0180]与现有技术相比，本发明所述的ΒΚ病毒的检测方法、试剂盒，达到了如下效果：
[0181] 1.本发明中磁珠法实现了人类尿液样本中BKV提取操作，磁珠法有效快速的提取 了样本DNA。
[0182] 2.本发明中所涉及的试剂盒中设置BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、定量标 准品均为尿液样本，参与核酸提取及扩增，全面真实反映核酸提取和扩增，对待测样本进行 准确定标。
[0183] 3.本发明使用尿苷酶(UDG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止 先前PCR扩增产物的污染。
[0184] 4.本发明采用内标质控体系，内标参与样本提取与扩增，用于监测反应体系可能 存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突 的另一检测通道。
[0185] 5.本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到500copies/mL;同时，本发明的检 测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如JC病毒(JCV)，丙肝病毒(HCV)， 人巨细胞病毒(HCMV)和乙型肝炎病毒(HBV);
[0186] 6.本发明的检测方法反应快速，一般1.5到2小时即可得到检测结果，并且成本低， 适合于大规模临床开展。从而实现对BK病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及 时的病理诊治及治疗效果监测。
[0187] 由于方法部分已经对本申请实施例进行了详细描述，这里对实施例中涉及的系统 与方法对应部分的展开描述省略，不再赘述。对于系统中具体内容的描述可参考方法实施 例的内容，这里不再具体限定。
[0188] 上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申 请所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1 .BK病毒的检测方法，包括如下步骤： 待测样本获取： 采用磁珠法从人类尿液样本提取BKV DNA，获得待测样本； PCR扩增反应： 将提取的BKV DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增； 所述PCR反应混合液，包括:PCR反应液、BKV引物探针混合液， 所述BKV引物探针混合液，包括，上游引物BKV-F，下游引物BKV-R，Taqman荧光探针BKV-FP，纯化水； 所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID N0:1所示的碱基序列； 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列； 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID NO: 3所示的碱基序列，所述Taqman荧光探 针BKV-FP5 '端有荧光报告基团，3 '端有荧光淬灭基团； 结果检测： 采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针BKV-FP5' 端荧光基团对应的荧光素，在60°C收集荧光信号。2. 根据权利要求1所述的BK病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为： 37°(：，211^11;95°(：，311^11 ;然后，94°(：，108,60°(：，358，10个循环；然后，94°(：，108,60°(：，358,35 个循环；25°C，lmin。3. 根据权利要求1所述的BK病毒的检测方法，其特征在于，所述BKV引物探针混合液，还 包括：内标上游引物，内标下游引物，内标探针。4. 根据权利要求1所述的BK病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应，还包括： 平行设置BKV阴性质控品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品和BKV定量标准品I~IV反 应组，所述BKV阴性质控品为无菌生理盐水，所述BKV临界阳性质控品为浓度1.0 X 104copies/mL的BKV阳性尿液样本;BKV阳性质控品为浓度1.0 X 106copies/mL的BKV阳性尿 液样本；BKV定量标准品I~IV，包括BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品 III、BKV定量标准品IV。5. 根据权利要求1所述BK病毒的检测方法，其特征在于，所述的Taqman荧光探针BKV-FP 的荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光 素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4 '，5-二氯-2 '，7 二甲氧 基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种;所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞 淬灭剂3中的至少一种。6. 根据权利要求1所述的BK病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR反应液，包括UDG酶 防污染体系，所述UDG酶防污染体系，包括:UDG酶及dUTP。7. 检测BK病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的上游引物BKV-F，下游引物 BKV-R，Taqman 荧光探针 BKV-FP， 所述上游引物BKV-F包含如SEQ ID NO: 1所示的碱基序列； 所述下游引物BKV-R包含如SEQIDN0:2所示的碱基序列； 所述Taqman荧光探针BKV-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列。8. 根据权利要求7所述的检测BK病毒的试剂盒，其特征在于，还包括：内标上游引物、内 标下游引物、内标探针、BKV阴性质控品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品和BKV定量标 准品I~IV，其中BKV阴性质控品无菌生理盐水，BKV定量标准品I~IV的待测模板分别为BKV 定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。9. 根据权利要求7或8任一项所述的检测BK病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包 括:裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K、助沉剂、BKV引物探针混合液、PCR反应液、 BKV定量标准品、BKV阳性质控品、BKV临界阳性质控品、BKV阴性质控品、BKV内标质控品，各 组分含量为： 蛋白酶Κ 240μ1χ1; 助沉剂 196μ1χ1 裂解液 4.8mhl ; 磁珠 480μ1Χ? ; 洗液丨 6.6 mlχ 1 :; 洗液 2 3.6 mlxl ; 洗脱液 1200μ1χ1 引物探针混合液 120 μLχ 1 ; PCR 反应液 6〇〇 μ1χ1; BKV阳性质控品 600 μLχ 1 BKV临界阳性质控品 600 μLχ 1 BKV阴性质控品 600 μ丨y ; BKV定量标准品I 600 μ丨X1 ; BKV定量标准品II 600 μLχ? ; BKV定量标准品ΓΠ 600 μLχ?; 定量标准品?ν 600 μ1χ1 ; BKV内标质控品 ΠΟμΙχΙ。10. 权利要求7-9任一项所述的检测BK病毒的试剂盒，用于BK病毒的检测。
【文档编号】C12Q1/68GK106065420SQ201610615999
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】叶锋, 刘明坤, 余荣
【申请人】北京思尔成生物技术有限公司
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0访客 来自[中国] 2023年08月18日 22:03bkv1.83*10^11是多少啊
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