一种油*梅下毛瘿螨pcr检测引物及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种油?梅下毛瘿螨PCR检测引物及其检测方法，属于果树虫害检测、鉴定及防治技术领域，设计了一种油?梅下毛瘿螨的PCR检测引物，序列如Seq ID NO.1?2所示，PCR反应后，经琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到目的电泳条带。本发明的PCR检测引物及其检测方法可用于油?花芽中梅下毛瘿螨的检测，同时可用于田间油?梅下毛瘿螨的早期诊断、监测与鉴定，为梅下毛瘿螨引起的油?虫害的防治提供可靠的技术和理论依据。该方法与传统鉴定方法相比，具简便快速，省时省力，对非分类专业人士来说易于掌握，是一种快速鉴定梅下毛瘿螨的分子生物学方法。
【专利说明】
一种油捺梅下毛癭螨PCR检测引物及其检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种油捺梅下毛癭螨PCR检测引物及其检测方法，专用于油捺梅下毛癭螨高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间油捺梅下毛癭螨的早期诊断、监测与鉴定，属于果树虫害检测、鉴定及防治技术领域。
【背景技术】
[0002]油棒(JpTtwussalicina Lindli var cordata J.Y.Zhang et al)，又称棒李，属蔷薇科(Wosaceae)李亚科(Prunoideae)李属(JpTtmusL)植物，是福建特产佳果，也是我国李产业中最具特色的分支产业，除了福建，广东、广西、湖南、江西等省区都有引种，是南方水果产区的重要栽培树种，对促进农村经济发展和帮助果农增收致富具有重要意义。近年来，随着油捺种植面积的扩大和农业生态环境的改变，新害虫梅下毛癭螨发生蔓延快速，日趋严重，严重影响果品产量和品质，已成为阻碍油捺发展的一个因素。
[0003]梅下毛癭螨phloeocoptes Nalepa)属于蜱螨亚纲(Acari)，前气门亚目(Prostigmata)，癭螨总科(Er1phyoidea)，癭螨亚科(Er1phyinae)，下毛癭螨属Ucalitus)，是世界广布种，在全世界各地都有分布，主要发生在欧洲中部和南部、地中海地区、美国北部和南部以及东亚地区，主要危害蔷科李属植物的油捺、杏、樱桃李、扁桃、梅和洋李等。该螨主要为害寄主的芽苞(包括叶芽和花芽)，受到危害的芽不能正常萌发，影响开花和枝条的形成，造成减产，经调查，危害严重的油捺果园，株受害率甚至高达100%，严重者整株枯死，当年减产可达70%，导致树势衰弱，给生产造成严重影响，在我省古田、建阳、屏南和蒲城等油柰产区均有发现其为害，已成为果园急待解决的问题。
[0004]由于梅下毛癭螨个体微小，危害初期肉眼难以发现直到症状明显时才被注意，并且该螨大部分时间营非自由生活，都在芽鳞片之间群集为害，芽的外侧有多层鳞片包裹，喷药不易接触虫体，给防治带来困难，这就要求我们抓住梅下毛癭螨的转芽活动期进行防治，因此，建立一种快速、灵敏、准确的分子生物学检测方法是十分必要和紧迫的，对其进行生物学特性研究和防治监测都有重要的意义。近年来，利用PCR扩增生物体基因某一特异分子片段进行有害生物的检测、鉴定及病虫害诊断的方法为国际上广泛使用。由于这种方法快速、准确和简便的特点，越来越受到各国植物保护学家的重视。但迄今为止，关于梅下毛癭螨的分子鉴定技术国内外尚未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有检测技术中油捺梅下毛癭螨镜检灵敏度低、检测人员专业素质要求高的问题，提供油捺梅下毛癭螨特异性PCR检测引物以及检测结果可靠、灵敏度高、特异性强且易于操作的油捺梅下毛癭螨PCR检测方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
1、油捺梅下毛癭螨的PCR检测引物设计
从GenBank中下载梅下毛癭螨的⑶I序列，采用primer5软件设-H种PCR检测引物，弓丨物序列分别为:
YM-F3:57- GAAGTATTCAAATTTCGATCTGT -37 ；
YM-B3:57- TTTTTTCCCTGCACATAGG -37 ；
对油捺梅下毛癭螨特异性扩增出214bp的PCR产物。
[0007]2、油捺梅下毛癭螨的PCR检测体系建立:
(I)从被油捺梅下毛癭螨危害的花芽组织中提取总DNA 按CTAB法提取总DNA，具体步骤如下:
①取0.5g被危害的花芽组织，置于研钵内，用液氮磨成细粉;②加900yL2%CTAB，ΙΟμ?β-巯基乙醇，90yL10%SDS，2yL蛋白酶K ；③65°C，水浴Ih，冷却至室温，12000rpm离心1min ；④取上清，加入等体积氛/氯仿/异戊醇(25:24:1)，轻轻颠倒，静置5min，12000rpm离心1min ；⑤取上清，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒，静置5min，12000rpm离心1min;⑥取上清，加入等体积异丙醇(或2.5倍体积无水乙醇)，置于-20 0C冰箱2h(或过夜);⑦12000rpm离心1min，弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀2次，再将沉淀风干；⑧将沉淀溶于30yL TE(含RnaseA 50yg/mL)，取IyL作为模板进行PCR扩增。
[0008](2)以步骤(I)提取的总DNA为模板，利用权利引物YM-F3/YM-B3进行PCR扩增，扩增条件如下:
PCR反应体系25 yL:包括 12.5yL PCR Mix，ΙΟμΜ YM-F3和ΙΟμΜ ΥΜ-Β3各lyL，50ng 总DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25 yL。扩增程序为94°C预变性4min，94°C变形30s，58°C退火30s，72°C延伸308，32个循环，最后72°(:延伸711^11。
[0009](3)取7yL扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后用凝胶成像仪观察扩增产物大小来判定结果。如果能特异性的扩增到214bp的产物，即可判定所取组织中存在油捺梅下毛癭螨;否则，所取组织中不存在油捺梅下毛癭螨。
[0010]有益效果:本发明方法适用于油捺花芽中梅下毛癭螨的可靠性和高灵敏度快速分子检测和鉴定，对梅下毛癭螨引起的虫害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下技术优势:
1、特异性强:本发明所采用的PCR引物是针对油捺梅下毛癭螨COI基因序列设计的特性扩增引物；已对福建宁德、南平、龙岩等地区的油捺梅下毛癭螨进行了测试验证，因此充分保证检测结果的可靠性；
2、灵敏度高:利用设计的PCR引物对油捺梅下毛癭螨的检测灵敏度在DNA水平上可达到。
[0011]4、实用性好:本发明所设计出的PCR引物，可用于梅下毛癭螨危害的油捺花芽进行的高灵敏度快速检测和鉴定，具有很强的实用性；
5、操作简单:应用本发明方法，可在数小时内完成对油捺梅下毛癭螨的检测，检测结果准确可靠。同时，PCR检测技术已经非常成熟，操作步骤简单。
【附图说明】
[0012]图1为本发明油捺梅下毛癭螨危害PCR特异性检测结果图。其中:MSl00bpDNAmarker，I为阴性对照，2为阳性对照，3和4为油棒梅下毛癭螨，5_10为其他近缘螨。
[0013]图2为本发明油捺梅下毛癭螨危害PCR灵敏度检测结果图。其中:MSl00bpDNAmarker, 1_7分别为50ng, 5ng, 500 pg, 50 pg, 5pg, 500 fg和50 fgD
[0014]图3为本发明油捺梅下毛癭螨危害PCR检测结果图。其中:M为10bp DNA marker ,1为阴性对照，2为阳性对照，3-5为被危害花芽，6-10为健康花芽。
【具体实施方式】
[0015]以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不止限于此。
[0016]实施例1:PCR引物对油捺梅下毛癭螨的特异性扩增 1、模板DNA的提取
为获得油捺梅下毛癭螨的特异性引物，以福建宁德、南平和龙岩等市的21个油捺梅下毛癭螨和多个近缘螨为供试材料，采用CTAB法提取花芽总DNA，具体步骤如下:取0.5g被危害的花芽组织，置于研钵内，用液氮磨成细粉;加900yL2%CTAB，ΙΟμ?β-巯基乙醇，90yL10%SDS，2yL蛋白酶K; 65 °C，水浴Ih，冷却至室温，12000rpm离心1min ；取上清，加入等体积氛/氯仿/异戊醇(25:24:1),轻轻颠倒，静置5min，12000rpm离心1min ；取上清，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒，静置5min，12000rpm离心1min ；取上清，加入等体积异丙醇(或2.5倍体积无水乙醇)，置于-20 0C冰箱2h(或过夜)；12000rpm离心1min，弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀2次，再将沉淀风干;将沉淀溶于30yL TE(含RnaseA 50yg/mL)，用超微量分光光度计(NanoDrop)测定DNA浓度并稀释至50ngAiL，取IyL稀释后的DNA作为模板进行PCR扩增。
[0017]2、特异性引物设计
从GenBank中下载梅下毛癭螨的COI序列，应用ClustalX软件进行序列比对，同时结合primer5软件设-H种PCR检测引物，引物序列分别为:
YM-F3:57- GAAGTATTCAAATTTCGATCTGT -37 ；
YM-B3:57- TTTTTTCCCTGCACATAGG -37 ；
对油捺梅下毛癭螨特异性扩增出214bp的PCR产物。
[0018]3、PCR 扩增
利用引物YM-F3/YM-B3对供试材料进行PCR扩增。PCR的具体反应条件如下:
PCR反应体系25 41^包括12.541^0? Mix,ΙΟμΜ YM-F3和ΙΟμΜ ΥΜ-Β3各lyL，50ng 总DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25yL。扩增程序为94°C预变性4min，94°C变形30s，58°C退火30s，72°C延伸308，32个循环，最后72°(:延伸711^11。
[0019]4、检测结果
PCR特异性检测结果见图1。除来自福建宁德、南平和龙岩等地的21个梅下毛癭螨危害组织总DNA扩增出214bp的产物外，其他供试近缘螨均没有出现扩增条带，说明此引物具有很强的特异性。
[0020]实施例2:PCR引物对油捺梅下毛癭螨的灵敏性检测
1、模板总DNA浓度稀释
利用超微量分光光度计(NanoDrop )测定DNA浓度，采用1倍浓度系列稀释法将提取的总DNA稀释成50ng, 5ng, 500 pg, 50 pg,5 pg, 500 fg和50 fg共7个不同浓度梯度。
[0021]2、灵敏度检测
取IyL总DNA为模板进行PCR检测WCR反应条件如下: PCR反应体系25 “1^包括12.541^0? Mix,ΙΟμΜ YM-F3和ΙΟμΜ ΥΜ-Β3各lyL，50ng 总DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25 yL。扩增程序为94°C预变性4min，94°C变形30s，58°C退火30s，72°C延伸308，32个循环，最后72°(:延伸711^11。
[0022]3、检测结果
PCR灵敏度检测结果见图2。在25yL反应体系中，当模板浓度为500 pg/yL时仍可扩增出一条214bp的条带，而随着浓度继续降低，却没有检测到特异性条带，表明其检测灵敏度为500 pg/yLo
[0023]实施例3:梅下毛癭螨危害油捺花芽的田间实测。
[0024]1、样品采集:样品采自福建宁德、南平和龙岩等油捺生产基地。
[0025]2、DNA提取及检测
被危害的油捺花芽采用CTAB法提取总DNA。
[0026]按下述方法进行PCR检测:
①PCR反应体系25 “1^包括12.541^0? Mix,ΙΟμΜ YM-F3和ΙΟμΜ ΥΜ-Β3各lyL，50ng 总DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25 yLo
[0027]?扩增程序为94°(:预变性41^11，94°(:变形308，58°(:退火308，72°(:延伸308，32个循环，最后72°C延伸7min。
[0028]3、检测结果
样品实测结果见图3。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后出现一条214bp的特异性条带，则判断供试花芽被梅下毛癭螨危害。图中第3、4、5的花芽组织中检测出梅下毛癭螨。
【主权项】
1.一种油捺梅下毛癭螨PCR检测引物，其特征在于:引物序列为: YM-F3:57- GAAGTATTCAAATTTCGATCTGT -37 ； YM-B3:57- TTTTTTCCCTGCACATAGG -37 ； 对油捺梅下毛癭螨特异性扩增出214bp的PCR产物。2.—种利用权利要求1引物的油捺梅下毛癭螨检测方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)从被油捺梅下毛癭螨危害的花芽组织中提取总DNA; (2 )以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用权利要求1的引物YM-F3/YM-B3进行PCR扩增； (3)取步骤(2)的PCR扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，用凝胶成像仪观察PCR结果，如果能特异扩增出214bp的PCR产物，即可诊断为所取得花芽组织存在油捺梅下毛癭螨。3.根据权利要求2所述的油捺梅下毛癭螨检测方法，其特征在于:所述的步骤(2)PCR扩增条件为:PCR反应体系为25μL:包括 12.5yL PCR MIX,10μM YM-F3和10μM ΥΜ-Β3各1μL，.50ng总DNA模板，用灭菌双蒸水补足至25 yL;扩增程序为94°C预变性4min，94°C变形30s，.58°C退火30s，72°C延伸308，32个循环，最后72°(:延伸711^11。4.如权利要求1所述的引物在检测油捺梅下毛癭中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK106065415SQ201610587046
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年7月25日
【发明人】胡菡青, 范国成, 林雄杰, 王贤达, 罗水鑫, 陈瑾
【申请人】福建省农业科学院果树研究所