专利名称：胶原的测定方法
技术领域：
本发明涉及胶原的测定方法，更具体地说，本发明涉及在少量的样品中高灵敏度地测定胶原的方法、以及用于测定胶原的试剂盒。
背景技术：
IV型胶原是由肾组织的肾小球和肾小管释放的肾细胞外基质的主要成分之一(T.Iijima等、J.Clini.Lab.Anal.，1998，12，378-382)。病变肾脏中IV型胶原生成亢进，结果，伴随着各种肾病的进展，IV型胶原向尿的排出增加。
以探讨糖尿病性肾病的优良指标为目的，最近的临床试验中发现尿中的IV型胶原量可正确地反映亢进的细胞外基质的代谢速度(H.Okonogi等、Clin.Nephrol.，2001，55，357-364；H.Makino等、Res.Commmun.Mol.Pathol.Pharmacol.，1995，88，215-223；以及M.P.Cohen等、Diabetes Care，2001，24，914-918)。另外，在糖尿病性肾病等肾脏疾病中，IV型胶原是比尿白蛋白更优异的指标(T.Iijima等、J.Clini.Lab.Anal.，1998，12，378-382；M.P.Cohen等、Diabetes Care，2001，24，914-918；N.Banu等、DiabetesRes.Clin.Pract.，1995，29，57-67；以及N.Kotajima等、J.DiabetesComplications，2000，14，13-17)。虽然用于测定人IV型胶原的各种ELISA和放射免疫测定(RIA)已在临床检查中应用(J.Risteli等、Anal.Biochem.，1981，113，372-378；以及K.Obata等、Clin.Clim.Acta.，1989，181，293-304)，但可以极少量的检体量测定尿中微量胶原的实用小鼠IV型胶原测定方法尚不存在。
IV型胶原是具有包括自我聚集性的独特结构特征的巨大的聚合物(R.Timpl等、Eur.J.Biochem.，1981，120，203-211；P.D.Yurchenco等、Biochem.，1984，23，1839-1850；P.D.Yurchenco等、J.Histochem.Cytochem.，1986，34，93-102；C.Johansson等、J.Biol.Chem.，1992，267，24533-24537；B.Siebold等、Eur.J.Biochem.，1987，168，569-575；P.D.Yurchenco等、J.Cell Biol.，1987，105，2559-2568；以及R.Dlz等、Eur.J.Biochem.，1988，178，357-366)。IV型胶原分子由分别可分为三个域(即N末端区的小的胶原性域7S、中间区的大的胶原性域、以及C末端区的非胶原性球状域NC1)的三条α链构成。α链三聚体在7S和大的胶原性域中形成三重螺旋结构，但在NC1域中，各链折叠成球状结构，通过链内的二硫键保持稳定。通过使用7S和NC1域作为交联域，四个IV型胶原分子在7S域结合，两个分子在NC1域结合，生成IV型胶原分子的巨大的多角形网络(R.Timpl等、Eur.J.Biochem.，1981，120，203-211)。我们所特别关注的重要的结构特征是二硫交联作为主要的键发挥作用，分子内交联的88％都使用该键，通过将各单元结合，形成了多角形的巨大网络(B.Sieboled等、Eur.J.Biochem.，1988，176，617-624)。
发明内容
本发明要解决的课题是在小鼠尿等只能提供少量样品的情况下，也可以测定少量样品中微量胶原的新型的胶原测定方法。
本发明人为了正确地反映实验模型小鼠中的早期肾障碍，尝试确立了高灵敏度时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)，以用于测定非常少量的检体量中仅微量存在的小鼠尿中的IV型胶原量。本发明人首先根据上述IV型胶原结构上的特征，将样品用二硫苏糖醇进行前处理，减少分子间的二硫交联数目。通过用二硫苏糖醇进行前处理，无需使用多量的尿，即可更正确地测定小鼠尿中的IV型胶原。采用本发明的方法和不使用DTT的通常的竞争ELISA法，对KK/Ta小鼠(II型糖尿病自然发病模型小鼠、H.Ikeda，Diabetes Res.Clin.Pract.，1994，24(Suppl.)，313-316)和未显示糖尿病、作为对照小鼠的BALB/c小鼠尿中IV型胶原量进行比较，结果验证了本发明方法的有效性。本发明基于这些认识完成。
即，本发明提供胶原的测定方法，其特征在于在通过使用抗胶原抗体进行免疫分析来测定胶原的方法中，将受试样品用还原剂处理。
优选地，免疫分析为使用抗胶原抗体的荧光免疫测定，进一步优选为夹心式时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)。
优选胶原为IV型胶原。
优选还原剂为二硫苏糖醇。
优选受试样品为尿，进一步优选为实验动物的尿。
优选受试样品中的还原剂浓度为0.1mM-10mM，更优选0.1mM-5mM，进一步优选0.5mM-5mM。
本发明的胶原测定方法优选包括下述步骤(1)将受试样品用还原剂处理的步骤；(2)使经上述(1)处理的受试样品与固定有固相化抗胶原抗体的固相载体接触的步骤；(3)使具有标记物的标记抗胶原抗体与上述固相载体接触的步骤；(4)利用上述标记物，检出或测定与固相化抗胶原抗体结合的胶原的步骤。
本发明的另一方面提供用于实施胶原测定方法的试剂盒，该试剂盒至少包含还原剂和抗胶原抗体。
附图简述
图1表示由TR-FIA(A)和竞争性ELISA(B)得到的小鼠IV型胶原标准曲线。各点表示4次试验的平均±SD。
图2表示含有IV型胶原的小鼠尿的浓度与TR-FIA的荧光强度的相关关系。添加DTT之前(用白色方形和圆表示)和之后(用黑色方形和圆表示)的浓度用KK/Ta和BALB/c的尿样进行测定。各点表示3次试验的平均±SD。
图3表示DTT浓度对尿和标准样品的影响。来自KK/Ta小鼠的尿样和标准溶液与0、2和5mM的等量DTT一起培养。
图4表示20周龄的KK/Ta(n＝6)和BALB/c(n＝6)小鼠的小鼠尿中IV胶原量的比较。测定使用TR-FIA(A)和市售的竞争性ELISA(B)进行。
*KK/Ta比BALB/c显著高(p＜0.01)图5表示由KK/Ta和BALB/c的全肾分离的IV型胶原(α1链)的mRNA表达。
实施发明的最佳方式以下，对本发明的实施方案进行说明。
本发明提供用于测定小鼠尿中IV型胶原等微量胶原的高灵敏度免疫测定法。本发明根据IV型胶原分子结构上的特征，使用二硫苏糖醇(DTT)对受试样品进行前处理。以往不进行DTT处理的竞争性ELISA法的检测下限是2.4ng/ml，而本发明的方法可以对5μl尿样中的27pg/ml IV型胶原进行测定。
根据本发明的方法，对来自两种小鼠体系(KK/Ta和BALB/c)的12个样品的尿中IV型胶原量进行测定，结果表明糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠中，尿中的IV型胶原量明显不同。与未进行DTT前处理的情况相比较，本发明的方法对于极少量的样品也可以进行测定，因此适合检体量有限、特别是小鼠尿中的IV型胶原的测定。
本发明的通过使用抗胶原抗体进行免疫分析、由此进行胶原测定方法的特征在于用还原剂对受试样品进行前处理。
本发明所使用的受试样品只要是测定胶原量所必需的即可，并没有特别限定，例如人或者大鼠或小鼠等哺乳动物的尿、血液、血清、血浆、组织液、唾液、汗液等任何体液。本发明的胶原测定方法对于微量样品中的少量胶原也可以进行高灵敏度地测定，因此可以使用通常只能采集少量、难以收集多量样品的小鼠等实验动物的尿等作为受试样品。
本发明所测定的胶原种类并没有特别限定。脊椎动物的胶原可分为I型-XXV型，本发明可以测定其中任何类型的胶原。其中可特别优选测定的是IV型胶原。
本发明中使用的还原剂只要是可还原胶原中二硫键的还原剂即可，并没有特别限定，例如可以使用二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇等。特别优选使用二硫苏糖醇(DTT)。
本发明的方法中，预先用上述还原剂处理受试样品。还原剂处理时，受试样品中的还原剂浓度优选0.1mM-10mM，更优选0.1mM-5mM，进一步优选0.5mM-5mM，例如可以为约2mM。还原剂的浓度小于0.1mM，则不能充分发挥还原剂对二硫键的还原作用；还原剂的浓度比10mM高，则可能对胶原分子的表位立体结构产生不良影响，因而不优选。
本发明的免疫分析是使用抗胶原抗体进行的免疫分析。
本发明所使用的抗胶原抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，这些抗体可通过通常的抗体制备方法获得。另外，抗体不只是使用IgG，也可以使用抗体片断(例如F(ab’)2片段、Fab’片段等)。
例如，多克隆抗胶原抗体可通过以胶原作为抗原免疫致敏哺乳动物，由该哺乳动物采集血液，由采集的血液分离·纯化抗体而获得。例如，可以免疫小鼠、仓鼠、豚鼠、鸡、大鼠、兔、狗、山羊、绵羊、牛等哺乳动物。施用抗原的方法是本领域技术人员所公知的，对于给予途径没有特别限定，可以适当选择皮下施用、皮内施用、腹膜腔内施用、静脉施用、肌内施用等。另外，可以根据需要使用佐剂。对免疫致敏的哺乳动物饲养适当时间后，由耳静脉等少量采集该哺乳动物的血清，测定抗体效价。如果抗体效价升高，则可以根据情况施用抗原进行追加免疫。距最后施用1-2个月后，按照常规方法由免疫动物采集血液，将该血液通过离心、硫酸铵或聚乙二醇沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等层析等常规的方法进行离心·纯化，可以以多克隆抗血清的形式获得多克隆抗胶原抗体。
单克隆抗体例如可通过抗体生成细胞与骨髓瘤细胞株的细胞融合，制备杂交瘤，由此获得。抗体生成细胞可以使用免疫动物的脾细胞、淋巴结细胞、B淋巴细胞等。例如可以由免疫动物获得脾细胞，以此作为抗体生成细胞，按照公知的方法(G.Kohkler等.，Nature，256 495(1975))，将其与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。细胞融合所使用的骨髓瘤细胞株例如有小鼠P3X63Ag8、P3U1细胞株、Sp2/0细胞株等。进行细胞融合时，可以使用聚乙二醇、仙台病毒等融合诱导剂，细胞融合后的杂交瘤筛选可以按照常规方法使用次黄嘌呤·氨基蝶呤·胸腺嘧啶核苷(HAT)培养基进行。由细胞融合得到的杂交瘤通过极限稀释法克隆。还可以通过使用胶原的酶联免疫吸附测定法进行筛选，由此获得生成单克隆抗体的细胞株，该单克隆抗体专一识别所希望的胶原。由杂交瘤制备目标单克隆抗体时，可通过通常的细胞培养法或腹水形成法培养该杂交瘤，从培养上清或腹水中纯化该单克隆抗体。从培养上清或腹水中纯化单克隆抗体的方法可以按照常规方法进行。例如可以适当组合使用硫酸铵分级分离、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等。
本发明的胶原测定方法的例子有荧光免疫测定法、酶免疫测定法、放射免疫测定、发光免疫测定法等。例如将抗胶原抗体与不溶性载体结合，制备抗体结合的不溶性载体，使用该载体可以进行夹心免疫测定法。例如进行夹心免疫分析时，本发明的方法可通过以下步骤进行(1)将受试样品用还原剂处理的步骤；(2)使经上述(1)处理的受试样品与固定有固相化抗胶原抗体的固相载体接触的步骤；(3)使具有标记物的抗胶原标记抗体与上述固相载体接触的步骤；(4)利用上述标记物，检出或测定与固相化抗胶原抗体结合的胶原的步骤。
作为标记抗体使用的抗胶原抗体被标记物、优选非放射性标记物标记。非放射性标记可以使用酶标记、荧光标记、发光标记等标记。酶标记例如可以使用碱性磷酸酶(ALP)、β-D-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶等。这些酶的检测可以使用各酶底物4-甲基伞形酮酰磷酸盐(4-MUP)、过氧化氢和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的组合、2-硝基苯基-β-D-半乳糖苷等。这些酶底物受到酶的作用产生变化(例如断裂)而显色由此可用于检测。
免疫分析的测定方法可根据仪器测定原理而进行如下分类，本发明可以使用任意的这些方法。
(A)化学发光免疫测定装置1.CLEIA(化学发光酶免疫测定)(使用酶产生化学发光)2.CLIA(化学发光免疫测定)(使用催化剂产生化学发光)3.ECLIA(电化学发光免疫测定)(由于电学变化而产生化学发光)(B)放射免疫测定的测定装置1.放射免疫测定(RIA) 竞争法2.免疫放射分析(IRMA)(C)酶免疫测定装置
1.酶免疫测定(EIA)2.ELISA法(酶联免疫吸附测定)(D)荧光、荧光偏振免疫测定装置1.荧光酶免疫测定(FEIA)2.荧光偏振免疫测定(FPIA)3.时间分辨荧光测定装置(TR-F)(E)胶乳凝聚免疫测定装置(F)比浊免疫测定装置(G)免疫传感器1.电化学免疫传感器2.光学免疫传感器3.热免疫传感器4.压电发声免疫传感器本发明的免疫分析优选荧光免疫测定，特别优选夹心式时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)。
已知三价稀土类离子中，钐(Sm)、铕(Eu)、铽(Tb)和镝(Dy)离子与特定的配位基生成络合物，会强烈发出金属离子特有的荧光。这些络合物的荧光具有以下特征(1)荧光寿命非常长，稀土类荧光络合物、特别是铕和铽的络合物具有数百微秒或以上的荧光寿命；(2)斯托克斯频移非常大。这些络合物几乎都是吸收紫外光，被激发后发出500nm或以上的可见光；(3)荧光发光峰的半峰宽约为10-20nm，非常窄。利用这样的荧光特性，开发出了利用稀土类荧光络合物作为标记物的时间分辨荧光免疫测定。时间分辨荧光免疫测定可以去除各种短寿命的背景荧光，可以进行高灵敏度测定。
本方还提供胶原测定用试剂盒。本发明的试剂盒至少含有还原剂和抗胶原抗体。抗胶原抗体可以包括固相化抗体和标记抗体两种。本发明的试剂盒还可以包含用于检测上述标记物的试剂。
通过以下的实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不受实施例的限定。
实施例(A)材料和方法(1)实验动物动物实验按照日本顺天堂大学的动物设施指南进行。为了进行本实验，由日本CLEA(东京、日本)购入2种4周龄的近交系小鼠(KK/Ta和BALB/c)。6周龄以后，小鼠在整个实验期间自由摄取食物(啮齿动物颗粒饲料(CE-2；342.2Kcal/100g、含有4.4％粗脂肪)和水，在塑料笼中分别饲养。本实验只采用雄性小鼠。小鼠全部在由12小时明亮期/12小时黑暗期的规则的光周期的通常条件下、在同一房间饲养，温度调节为24±1℃。通过在20周龄时进行的耐糖试验，显示KK/Ta全部患有糖尿病。由于需要大量的尿用于比较，需重复10天采集尿样。通过小鼠的腹腔内耐糖试验(IPGTT)评价耐糖能。通过对禁食一夜的小鼠腹腔内注入葡萄糖(20％的溶液、2g/kg)进行IPGTT。使用Glutest E(京都第一化学、京都(日本))，在向腹腔内注入葡萄糖0分钟(空腹时的血糖值)和120分钟时，测定由后眼窝采集的血液中的葡萄糖量。体重也在该周龄测定。
(2)抗体和抗原由NOVOTEC(St Martin Lagarenne、法国)购入兔多克隆抗小鼠IV型胶原抗体。由Abcam公司(英国剑桥)购入与小鼠IV胶原交叉反应的生物素化山羊多克隆抗人IV型胶原抗体。使用来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠移植肿瘤的IV型胶原(Sigma-Aldrich公司、St.Louis、MO、美国)作为标准抗原。
(3)BHHCT标记链霉抗生物素蛋白链霉抗生物素蛋白购自Chemicon International公司(Temecula、CA、美国)。链霉抗生物素蛋白-BSA结合物(SA-BSA)按照已有报道制备(J.Yuan，G.Wang等、Anal.Biochem.，1997，254，283-287)。如已报道的，将SA-BSA结合物用螯合化合物BHHCT标记(J.Yuan，G.Wang等、Anal.Biochem.，1997，254，283-287)。溶液通过添加含有1.0×10-7M EuCl3、0.2％BSA、0.1％NaN3和0.9％NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)(稀释缓冲液)稀释，在免疫测定前在56℃下反应2小时。
(4)使用时间分辨免疫测定(TR-FIA)测定小鼠尿IV型胶原将尿样与等量的2mM二硫苏糖醇(Invitrogen公司、CA、美国)一起在37℃培养30分钟。标准IV型胶原溶液(2000ng/ml)也同样与2mM DTT一起培养。将样品用稀释缓冲液稀释后，将50μl尿或标准溶液添加到预先铺有兔抗小鼠IV型胶原抗体(50μl/孔1∶200稀释抗体)的荧光测定用微量滴定板(Nalge Nunc International，N.Y.，美国)的孔中。在5℃培养过夜，然后将孔用含有0.05％吐温20的Tris-HCl缓冲液洗涤3次，加入50μl生物素化抗IV型胶原抗体(稀释为1∶300)。在5℃培养过夜，然后加入50μl BHHCT-Eu3+标记的SA-BSA结合物(SA-BSA-BHHCT-Eu3+)溶液，在37℃培养1小时。最后，将孔用含有0.05％吐温20的Tris-HCl缓冲液(pH 9.1)洗涤3次，将板进行固相荧光测定。用Arvo SX多标记检测仪(PerkinElmerLife Sciences，Boston，MA，美国)，用340nm激励、0.2ms的延迟时间以及0.4ms窗口时间进行时间分辨荧光测定。用615nm测定荧光强度。
(5)使用竞争性ELISA测定小鼠尿IV型胶原采用竞争性酶联免疫吸附测定法(ELISA)(胶原IV M试剂盒、Exocell公司、Philadelphia、PA、美国)测定尿IV型胶原。测定按照试剂盒指示进行，使用了240μl尿样。
(6)肌酸酐测定使用尿样用的市售试剂盒(Creatinine Companion，Exocell公司、Philadelphia、PA、美国)测定尿中的肌酸酐。
(7)IV型胶原mRNA的RNA印迹分析RNA印迹分析中使用的探针按已有报道制备(E.P.Peten等、Am.J.Physiol.，1992，263，951-957)。由20周龄KK/Ta和BALB/c小鼠的全肾进行的总RNA的分离采用Trizol(Invitrogen公司、Carlsbad，CA，美国)进行。将RNA(10μg)在1.5％琼脂糖上进行电泳，转印在尼龙膜上。将膜进行4小时的预杂交，接着用32P标记cDNA探针与小鼠IV型胶原的α1链和GAPDH杂交过夜。洗涤后，将膜曝光于显像板(富士写真胶片会社、东京、日本)。显像板上的条带强度通过BAStation 2500(富士写真胶片会社、东京、日本)的浓度仪扫描模式进行定量。最后，用GAPDH的条带强度进行α1链的条带强度校正。
(8)统计分析数据以平均±SD表示。两种不同的小鼠体系间的统计学显著差异通过曼-惠特尼U检验进行。ELISA和TR-FIA间的相关回归分析用Spearman检验进行。P值小于0.05则视为有显著差异。
(B)结果(1)竞争性ELISA和TR-FIA系统之间的检测下限比较由竞争性ELISA和TR-FIA得到的小鼠IV型胶原标准曲线如图1所示。根据已有报道，使用3×SD背景确定的TR-FIA的检测下限为27pg/ml(J.Yuan，G.Wang等、Anal.Biochem.，1997，254，283-287)。同时测定时的平均变动系数为4.2％(8种不同浓度下为0.4-7.4％)。TR-FIA的检测下限(27pg/ml)与竞争性ELISA的检测下限相比，约为1/100。为了获得标准抗原从尿样中的回收率，使用按照1∶5稀释的人尿作为稀释剂。测定稀释的人尿中5种不同浓度的标准小鼠IV型胶原(2.5、10、40、160和320ng/ml)。添加在人尿样中的小鼠IV型胶原的回收率在各浓度下都为95％以上。
(2)经稀释的小鼠尿样分析使用由20周龄糖尿病KK/Ta和非糖尿病BALB/c小鼠采集的尿样，研究尿中小鼠IV型胶原的浓度与荧光强度的相关关系(图2)。用稀释缓冲液稀释各系统(n＝3)的尿样。不对样品进行前处理即进行测定时，由稀释为1∶20至1∶2，荧光强度减少(用白色方形表示)。这种趋势在KK/Ta小鼠中比BALB/c小鼠更明显。KK/Ta小鼠尿中抗原的低回收率可能是IV型胶原通过很多二硫键而呈现为巨大分子所引起的。这显示巨大分子对孔的非专一性吸附妨碍了免疫反应。因此在分析前用DTT对小鼠尿样进行处理。
(3)测定尿中IV型胶原时DTT前处理的最佳测定条件研究为了确立最佳测定条件，对尿样前处理中DTT浓度的效果进行了研究(图3A)。改变DTT浓度(1、2和5mM)。结果如图3所示。对标准抗原也同样处理(图3B)。对两者进行分析，结果在2mM DTT浓度下几乎不受影响，2mM时可实现对尿样中IV胶原的最佳分析。通过在稀释前用2mM浓度的DTT进行前处理，在KK/Ta小鼠中可观察到尿中IV型胶原浓度和荧光强度之间的正相关关系(图3B中以黑方形表示)。
为了确认与小鼠I型和II型胶原等其他型胶原的交叉反应性，将这两种型的胶原也用2mM的DTT处理。未观察到与这些型胶原的交叉反应，DTT前处理不会使I型和II型等其它胶原分子产生交叉性，这表明了可保持对IV型胶原的专一性。
(4)KK/Ta和BALB/c小鼠的耐糖能和体重如表1所示，与20周龄正常对照BALB/c小鼠的情况比较，20周龄KK/Ta小鼠出现了空腹时血糖上升和耐糖能降低以及肥胖现象(p＜0.01)。
表1实验动物数据
*KK/Ta的值比BALB/c小鼠的值显著高(p＜0.05)。
(5)使用TR-FIA和通常的竞争性免疫测定测定两种小鼠体系的尿中IV型胶原的浓度为了研究TR-FIA的有效性，使用市售试剂盒，用竞争性ELISA与TR-FIA同时测定小鼠IV型胶原。如图4所示，通过TR-FIA和竞争性ELISA两者测定了20周龄糖尿病KK/Ta和非糖尿BALB/c小鼠的尿中IV型胶原浓度。在各免疫测定中，KK/Ta小鼠的尿中IV型胶原浓度比BALB/c小鼠的浓度高(p＜0.01)。但是，TR-FIA的浓度范围比竞争性ELISA的浓度范围大。并且，TR-FIA中，KK/Ta和BALB/c小鼠之间值的差异比用竞争性ELISA测定时大。在这些分析中可见正的相关关系(相关系数＝0.607、p值＝0.034)。
(6)RNA印迹分析如图5所示，与BALB/c小鼠比较，KK/Ta小鼠中的IV型胶原mRNA表达更明显增加。浓度测定扫描显示KK/Ta小鼠中，α1链的mRNA表达比BALB/c小鼠高11.1倍。
(C)讨论有报道指出病变肾脏中IV型胶原的生成出现亢进(M.s.Razzaque等、J.Pathol.，1994，174，131-138；和T.A.Jacot等、Lab.Invest.，1996，75，781-799)。除这些报道外，对于尿中IV型胶原值进行研究的各种临床研究结果显示尿中IV型胶原的增加是早期肾病的良好的指标，但可用于啮齿动物的尿样等极少量尿样的高灵敏度测定方法尚不存在。目前所使用的常规ELISA需要较多量(240μl)的样品，而小鼠的尿，每次排泄只能获得极少量，难以采集较多量的检体。但是，利用使用铕螯合化合物(BHHCT-Eu3+)作为标记的TR-FIA，可以测定极少量样品中的尿IV型胶原。
IV型胶原是多个结构上具有特征的巨大分子。根据凝胶色谱分析，尿样中，IV型胶原在340kDa具有最大峰(H.Makino等、Res.Commmun.Mol.Psthol.Pharmacol.，1995，88，215-223)。如上所述，该巨大分子由聚合物单元构成，该聚合物单元分别具有多个二硫键作为主要的键。通常，免疫测定是随着所测定分子的增大，其复杂度增加。在未经DTT前处理的测定中，虽然较多量的胶原被排泄到KK/Ta小鼠的尿中，但高浓度的尿样中荧光强度并不与IV型胶原的量成比例。这种正相关关系的丧失是由于抗原抗体反应受到阻碍，被自我凝聚性的巨大分子网络立体阻挡。
通常认为抗原抗体反应中，抗体只识别抗原表面上的肽(G.S.Page等、J.Virol.，1988，62，1781-1794)。有报道指出使用2mM的DTT和2mM的胍，可有效地从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肿瘤中提取IV型胶原(H.K.Kleinman等、Biochemistry，1982，21，6188-6193)。本发明尝试通过用DTT还原多个二硫交联，使尿中IV型胶原分子大小减小，抗体可充分识别胶原分子的表面表位。结果，通过用DTT对尿样进行前处理，使尿的IV型胶原浓度与TR-FIA信号强度之间的正相关关系得到恢复。可认为二硫键是与IV型胶原分子立体结构有关的一部分分子间和分子内的键。将2mM或以上的DTT加入标准溶液仍未得到良好的结果，这可能是由于过量的前处理对分子内二硫键有影响，结果导致了抗原表位立体结构的变化。
关于KK/Ta小鼠比BALB/c小鼠的尿中IV型胶原浓度高，这在实施了DTT前处理的TR-FIA和使用市售试剂盒的竞争性ELISA测定中都显示出同样倾向，但这些免疫测定可见以下明显的不同。
TR-FIA的浓度范围比竞争性ELISA高近100倍。这是由于测定方法、所使用的抗体、DTT的添加等的不同而引起的。TR-FIA中DTT的添加可能比竞争性ELISA进一步增加了KK/Ta小鼠和BALB/c的不同。与TR-FIA的结果同样，在RNA印迹分析中也显示KK/Ta小鼠的IV型胶原的mRNA比BALB/c小鼠的表达明显亢进。该表达量的不同支持了TR-FIA的分析结果。TR-FIA中仅需要5μl的尿样，而竞争性ELISA则需要240μl。TR-FIA中，由于进行了DTT前处理，只用少量样品即足够。
产业实用性根据本发明的方法，可以测定极少量样品中的微量胶原。根据本发明，不会与其他型胶原交叉反应，可以明确小鼠体系间胶原量的差异。与以往以白蛋白等蛋白质为指标的测定法相比，利用本发明有望对实验模型小鼠的更早期肾病进行更高灵敏度的评价。
权利要求
1.胶原测定方法，其特征在于在通过使用抗胶原抗体进行免疫分析、由此测定胶原的方法中，将受试样品用还原剂处理。
2.权利要求1的胶原测定方法，其中免疫分析是使用抗胶原抗体的荧光免疫测定。
3.权利要求1或2的胶原测定方法，其中免疫分析为夹心式时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)。
4.权利要求1-3中任一项的胶原测定方法，其中胶原为IV型胶原。
5.权利要求1-4中任一项的胶原测定方法，其中还原剂为二硫苏糖醇。
6.权利要求1-5中任一项的胶原测定方法，其中受试样品为尿。
7.权利要求1-6中任一项的胶原测定方法，其中受试样品为实验动物的尿。
8.权利要求1-7中任一项的胶原测定方法，其中受试样品中的还原剂浓度为0.1mM-10mM。
9.权利要求8的胶原测定方法，其中受试样品中的还原剂浓度为0.1mM-5mM。
10.权利要求8的胶原测定方法，其中受试样品中的还原剂浓度为0.5mM-5mM。
11.权利要求1-10中任一项的胶原测定方法，该方法包含以下步骤(1)将受试样品用还原剂处理的步骤；以及(2)使经上述(1)处理的受试样品与固定有固相化抗胶原抗体的固相载体接触的步骤；(3)使具有标记物的抗胶原标记抗体与上述固相载体接触的步骤；(4)利用上述标记物，检出或测定与固相化抗胶原抗体结合的胶原的步骤。
12.用于实施权利要求1-11中任一项的胶原测定方法的试剂盒，该试剂盒至少包含还原剂和抗胶原抗体。
全文摘要
本发明提供在小鼠尿等只能提供少量样品的情况下，也可以测定少量样品中微量胶原的新型的胶原测定方法。本发明还提供胶原的测定方法，其特征在于在通过使用抗胶原抗体进行免疫分析、由此测定胶原的方法中，将受试样品用还原剂处理。
文档编号G01N33/543GK1735804SQ0382522
公开日2006年2月15日 申请日期2003年9月18日 优先权日2002年9月18日
发明者松本和子 申请人:工藤宪雄