专利名称：具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用与分子生物学、生物化学中的电泳装置，具体说是一种用与蛋白等生物大分子的分离制备装置，即具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置。
背景技术：
自1808年电泳现象被发现到现在，电泳技术已被广泛的应用与生物化学与分子生物学领域。电泳分离的精度非常高，但目前电泳一般用与样品的分析，如垂直板电泳，毛细管电泳，圆盘电泳等。这种高精度的分离技术用与制备纯化蛋白等生物大分子无疑将节省大量的科研时间，目前人们已经开发出许多电泳制备技术和仪器，如自流电泳、膜分离电泳等。但这些方法十分复杂，并且仪器十分昂贵，干扰因素多，不能广泛的得到应用。凝胶介质电泳是目前大多数实验室广为应用的一种电泳方法，其分离效果好，操作简便，把其良好的分离效果结合到制备型的电泳中是人们一直所希望的。
发明内容
本发明的目的就是提供一种分辩率高、集合柱层析和凝胶介质电泳优点、实现样品的分离、制备和收集功能的具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置。
本发明在已有的盘状凝胶介质电泳技术的基础上设计了一整套电泳装置，并集合了柱层析和凝胶介质电泳的优点，在保持高分辨率的前提下，使凝胶电泳的区带依次电泳出凝胶，并由流动相带出到色谱检测器进行检测收集，从而实现样品的分离和制备和收集。
本发明的要点是我们采用柱状凝胶电泳，电泳下室为流动相，并通过特定装置使柱下口的缓冲液体积很小，这样便可通过流动相直接将电泳出来的区带带出到色谱检测器，并避免了样品的扩散。
本发明所述的具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置，由带有底座和顶座的具有上下两室的电泳池、安装于电泳池内的分离柱、电极丝和电泳仪、检测器组成，底座、顶座内有螺纹空腔。在下电泳池的底部还有一个收集装置，其与分离柱形成较小体积的空腔，收集装置由与电泳池底部螺纹空腔密闭组装的带螺纹的底座、安装在底座上的玻璃圆筒组成，玻璃圆筒环绕在分离柱的外侧，底座上有出口，样品区带被流动相由出口带出，由检测器进行检测。
图1本发明所述电泳装置总图；图2本发明装置原理简图；图3(1)电泳池结构；图3(2)水浴示意图；图4电泳池上室电极丝组装图；图5收集装置及下室电极丝示意图；图6电泳池与收集装置组装图；图7电泳池与分离柱和收集装置组装图；图8(1)电泳分离柱与电泳收集装置图及其剖面图；图8(2)底部加厚的不同尺寸的分离柱；图9(1)电泳池盖；图9(2)电泳池盖与电泳池、分离柱、收集装置组装图；图10电泳缓冲液供给装置；图11几种蛋白的紫外280nm收集峰图。
下面结合附图对本发明做进一步说明，如图1所示，在下电泳池25的底部还有一个收集装置4，其与分离柱3形成较小体积的空腔2，收集装置4由与电泳池底部螺纹空腔11密闭组装的带螺纹的底座16、安装在底座16上的玻璃圆筒20组成，玻璃圆筒20环绕在分离柱3的外侧，底座16上有出口18，样品区带被流动相由出口18带出，由检测器40进行检测。
做为本发明的进一步改进，电泳池壁有两层，其夹层与出口5、6相通，经由软管42、43连接水浴。39为电泳仪可进行恒定电压和恒定电流控制，40为检测器用于样品检测，41为蠕动泵，42、43为胶管接于冷水。
做为本发明装置的典型数据，电泳池24、25高15-20cm，直径7-10cm，玻璃圆筒20高1-3cm，直径2.5-4cm，分离柱3高8-13cm，分离柱3与玻璃圆筒20的距离为1.0-4mm，与收集装置底16的距离为2-4mm，收集装置出口18直径1-3mm。
如图2所示，在保证有较好的分离效果的前提下，我们设计了具有流动相的下室和收集装置，并且设计了不同直径分离柱(0.7mm-3cm)。样品组分1电泳出分离柱后，进入由分离柱3和收集装置4形成的较小空间2里，由于下室是流动的，所以会立即被流动相由下面出口带出到检测器进行检测收集，从而实现分离制备的目的。
如图3所示，图(1)为电泳池，电泳池壁有两层，其夹层与出口5、6相通(如右图所示)。在分离分子量较大的蛋白质时，可以加大电流。而电流高于30mA时会放出大量热量，此时5、6出口可连接水浴以降低温度。左图中7、9、12均由四氟乙烯制成，8、10、11均为有螺纹空腔，分别可以与收集装置、分离柱、电泳池盖通过螺纹组装。电泳池高15-20cm，直径7-10cm。
如图4所示，该图中13为电极丝(由铂镍合金制成，直径0.5-1mm)。该电极丝穿过附于电泳池内壁的小环15，附于电泳池内壁，并且连接于电插孔14。电插孔14可以与电泳仪相连，电泳时13充当负极。
如图5所示，该图中16为带螺纹的底座(可由聚四氟乙烯制成)可以与电泳池底部螺纹空腔组装。19为电极丝(材料尺寸同附图3中电极丝)，可穿过附于玻璃圆筒20外壁的小环21固定于圆筒外壁，并且与电插口17连接。玻璃圆筒20高1-3cm，直径2.5-4cm。电插口17可以与电泳仪相连，电泳时19充当阳极，18为收集装置出口。
如图6所示，该图为电泳池与收集装置组装后的图，图中开口22与23相通，22为流动相入口，缓冲液通过22、23流入电泳池下室25，经由收集装置4由出口18流出形成流动相。
如图7所示，分离柱3通过26安装在电泳池内由四氟乙烯制成带有螺纹空腔10的9内，将电泳池分成两个不连通的上室24和下室25。
如图8(1)所示，分离柱3与收集装置上圆筒20的距离为1.0-4mm，与收集装置底16的距离为2-4mm，收集装置出口18直径1-3mm，分离柱高8-13cm。分离柱与收集装置形成较小体积的空腔2，保证了电泳处分离柱3的样品区带可以被流动相在不扩散的情况下由出口18带出。26为由聚四氟乙烯制成的螺纹塞，它可以与电泳池组装。
图8(2)为不同直径的分离柱，为了保证分离柱与收集装置形成较小的体积，我们采用在分离柱底部加厚的方法，图中27为加厚部分。
如图9所示，电泳池盖(可以有四氟乙烯制成)上部两个开口28、29可以与缓冲液供给装置相连，保证电泳时电泳池上室缓冲液不断更新保持缓冲能力。30为可以与电泳池顶座12内螺纹空腔11组装的螺纹。
如图10所示，图中盛装液体部分可以由玻璃制成，盖可由四氟乙烯制成，33、38、37、35、36为胶管。44为电泳流动相缓冲液供给部分，它通过33连接于电泳池流动相入口(如图1)，32为电泳池上室缓冲液更新部分，开口35通过蠕动泵接于电泳池盖开口、36连于电泳池盖另一开口(如图1)。31为空气中二氧化碳吸收部分，内装浓碱。当33、35、36流动时产生的大气压力差会通过38、37传到31中，这时通过开口34吸入空气平衡压力，空气中的二氧化碳被浓碱吸收(二氧化碳会对电泳缓冲液的检测有影响)。
电泳分离柱中的凝胶越长、柱越细分离效果越好，但电泳时间也变长，所以根据不同的需要可以使用不同直径的分离柱、不同的凝胶介质和不同的制胶方法(如不连续凝胶、梯度凝胶等)。
凝胶介质制备型电泳装置自身的构造形成了一个自然合理的散热系统。分离柱完全浸没于电泳池中的缓冲液中，而且下室缓冲液为流动相，相当于冷却装置，这为除去电泳过程中产生的热量提供了良好的条件，外层的水浴装置可以良好的散去电泳产生的热量。
分离柱封底，可用封口膜封紧并用橡皮筋固定防止封口膜脱落，待凝胶凝固后小心取下封口膜。
凝胶介质制备型电泳装置根据不同分离柱的型号上样量为200-1000ul(浓度1-30mg/ml)，样品制备方法同活性电泳，上样前先按附图1连接好装置；将电泳池下室加满缓冲液；分离柱上加缓冲液3-4ml；用移液器取样直接加于凝胶之上；用缓冲液补满分离柱和电泳池上室；盖上电泳池盖并且连通盖上开口与缓冲液供给装置，当电泳指示剂前沿电泳出凝胶后开始检测收集。
电泳电流一般采用25-80mA，根据样品特点、外加电场大小，流动相流速可变范围为60-200ml/h。
在具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置上进行电泳，其过程为1.根据要分离的样品量选择适当规格的分离柱；2.按附图1连接装置；3.配置电泳缓冲液和上样液；4.制胶；5.将电泳池下室和电泳缓冲液供给装置注满电泳缓冲液；6.在分离柱凝胶上加3-4ml缓冲液；7.加入样品；8.电泳池上室加满缓冲液；9.盖上电泳池盖，并连通电泳池盖与电泳缓冲液供给装置；10.接通电源，开始电泳；
11.当指示剂前沿区带电泳出凝胶时，打开流动相开始进行检测，并同时收集。
综上所述，凝胶介质制备型电泳装置，综合了色谱层析的易于检测、收集和凝胶介质电泳的分离精度高的优点，设备简单、成本低廉、并且易于操作。本电泳装置不仅适用于实验室、也适用于规模化制备应用中，并且可以结合电脑软件技术实现自动化循环进行全自动作业。
具体实施例方式
在我们的实验中，我们混合了四种标准蛋白(肌红蛋白、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、辣根过氧化物酶)并进行电泳，得到了良好的电泳分离效果。
1.材料和方法1.1材料肌红蛋白(分子量17000Da)胰凝乳蛋白酶原A(分子量25000Da)胃蛋白酶(分子量35000Da)辣根过氧化物酶(分子量40000Da)1.2仪器LKB-2297 microdrive 5电泳仪自制电泳装置HD-2000核酸蛋白检测仪YOKOGAWA 3057记录仪1.3方法1.3.1样品制备取肌红蛋白、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、辣根过氧化物酶各3mg，加缓冲液(1)(Tris HCL0.25MOL/L，pH7.6)配制成12mg/ml的蛋白混合液，取300ul该混合液加300ul溶液载样液(15％甘油，0.1％溴酚蓝，0.05mol/mlTris-HCL)。
1.3.2电泳1.3.2.1制胶(1)封底用封口膜封住分离柱下口然后用橡皮筋勒紧防止封口膜松动我们采用了直径1.7cm的柱，堆积胶1.5cm，分离胶5cm。
(2)分离胶配制7.9ml水，6.7ml30％丙烯酰胺溶液，5mlTris-HCL(0.7mol/l、pH8.8)，200ul10％过硫酸铵，10ulTEMED。
(3)堆积胶配置2.1ml水，600ul 30％丙烯酰胺溶液，400ulTris-HCL(0.5mol/l pH 6.8)30ul过硫酸铵(10％)，30ulTEMED。
(4)待凝胶凝固后小心撤去封口膜。
1.3.2.2电泳将仪器连好(如附图1)将电泳池下室缓冲液加满，将分离柱中柱堆积胶上加4ml缓冲液(Tris-Gly 0.2mol/L pH 7.6)然后用500ul移液器上样，上样(400ul)后将缓冲液补满，盖上电泳池盖，接通盖上的缓冲液更新出口与缓冲液供给装置，采用电流25mA电泳，溴酚蓝电泳出凝胶时，开始打开下室流动相并进行检测收集。
2.结果几种蛋白的紫外280nm收集峰如附图11，经电泳得到了较好的四个吸收峰。附图11中x轴方向的四个峰分别为肌红蛋白、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、辣根过氧化物酶。由于胃蛋白酶，辣根过氧化物酶分子量较前两者大，在凝胶中的泳动速度较慢，所以峰形较宽，最后一个峰附近有不平滑锯齿可能由于辣根过氧化物酶不纯造成。
权利要求
1.一种具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置，由带有底座(7)和顶座(12)的具有上下两室的电泳池(24)、(25)、安装于电泳池内的分离柱(3)、电极丝(13)、(19)和电泳仪(39)、检测器(40)组成，底座(7)、顶座(12)内有螺纹空腔(8)、(11)，其特征在于在下电泳池(25)的底部还有一个收集装置(4)，其与分离柱(3)形成较小体积的空腔(2)，收集装置(4)由与电泳池底部螺纹空腔(11)密闭组装的带螺纹的底座(16)、安装在底座(16)上的玻璃圆筒(20)组成，玻璃圆筒(20)环绕在分离柱(3)的外侧，底座(16)上有出口(18)，样品区带被流动相由出口(18)带出，由检测器(40)进行检测。
2.如权利要求1所述的具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置，其特征在于电泳装置还具有一个缓冲液供给装置，其由电泳池流动相缓冲液供给部分(44)、内装浓碱空气中二氧化碳吸收部分(31)、电泳池上室缓冲液更新部分(32)组成，流动相缓冲液供给部分(44)通过软管(33)连接于电泳池流动相入口(22)，电泳池上室缓冲液更新部分(32)通过软管(35)经由蠕动泵(41)接于电泳池盖开口(29)、电泳池上室中的缓冲液由另一开口(28)通过软管(36)流回上室缓冲液更新部分(32)。
3.如权利要求1或2所述的具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置，其特征在于电泳池上室(24)内壁上有小环(15)，电极丝(13)穿过小环附于上室的内壁，并且连接于上室边缘上的电插口(14)，电泳池下室(25)中收集装置(4)的玻璃圆筒(20)外壁有小环(21)，电极丝(19)穿过小环附于其外壁，并且连于底部电插口(17)，电插口(14)、(17)与电泳仪(39)相连。
4.如权利要求1或2所述的具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置，其特征在于电泳池壁有两层，其夹层与出口(5)、(6)相通，经由软管(42)、(43)连接水浴。
5.如权利要求1或2所述的具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置，其特征在于电泳池(24)、(25)高15-20cm，直径7-10cm，玻璃圆筒(20)高1-3cm，直径2.5-4cm，分离柱(3)高8-13cm，分离柱(3)与玻璃圆筒(20)的距离为1.0-4mm，与收集装置底(16)的距离为2-4mm，收集装置出口(18)直径1-3mm。
6.如权利要求1或2所述的具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置，其特征在于根据制备量的需求可以选不同的直径的分离柱(3)，分离柱(3)底部通过加厚外壁保证与收集装置(4)形成较小的体积。
7.如权利要求1或2所述的具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置，其特征在于分离柱(3)内可装载不同的凝胶介质从而满足不同的分离需要。
全文摘要
本发明涉及一种用与蛋白等生物大分子的分离制备装置，即具有流动相的凝胶介质制备型电泳装置。由带有底座和顶座的具有上下两室的电泳池、安装于电泳池内的分离柱、电极丝和电泳仪、检测器组成，底座、顶座内有螺纹空腔。电泳池壁有两层，其夹层连接水浴，外层的水浴装置可以良好的散去电泳产生的热量。在下电泳池的底部还有一个收集装置，其与分离柱形成较小体积的空腔，收集装置由与电泳池底部螺纹空腔密闭组装的带螺纹的底座、安装在底座上的玻璃圆筒组成，玻璃圆筒环绕在分离柱的外侧，底座上有出口，样品区带被流动相由出口带出，从而保证了样品在不扩散的情况下被流动相带到连接于外部的色谱检测器，实现样品的分离和制备。
文档编号G01N30/06GK1556406SQ200310116010
公开日2004年12月22日 申请日期2003年12月30日 优先权日2003年12月30日
发明者李正强, 张华利, 程瑛琨, 刘彬, 王雪丽 申请人:吉林大学