专利名称：：用于检测相互作用的分子的fret探针和方法
技术领域：
：本发明涉及检测相互作用的蛋白质和其他密切关联的分子的领域。更加特别地，本发明涉及在单细胞水平上评价大分子间的密切相互作用。近来基因组序列数据的丰富使得有必要用系统性的蛋白质组解密限定细胞功能的被编码的蛋白质网络。包括细胞与细胞间相互作用、细胞激活、细胞周期、信号路径、细胞扩增、分化、凋亡、发育以及许多其他细胞功能。阐明未被表征的基因产物即新蛋白质的功能的最初步骤，通常包括研究其与其他蛋白质的相互作用。尽管对蛋白质网络的阐述提供了大量关于起作用者的信息，但对各个分子间的相互作用的洞察对于了解各个分子对分子网络的作用是关键的。通常采用共定位研究来监控一种感兴趣的蛋白质与另一种感兴趣的蛋白质之间的接近程度。共定位数据还被用作为评价从遗传数据中推导出的蛋白质信息的手段，例如支持或者反驳从例如酵母双杂交分析中推导出的假定的蛋白质相互作用。细胞蛋白质的共定位可以用差别标记的抗体来评价，该抗体特异地与感兴趣的内源性蛋白质反应，这可以通过免疫荧光检测，用荧光显微镜从视觉上检测。至此，被固定的细胞首先用一组特异于感兴趣的蛋白质的第一抗体处理，然后用一组与荧光染料缀合的第二抗体处理。也可以使用直接与荧光染料缀合的抗体。这些染料应当在激发波长和发射波长上相互区别，使得它们能够被独立地激发，并且在分开的荧光通道中观察。或者，编码感兴趣的蛋白质的基因被用作编码表达蛋白质的报道基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)，或者用一种表位标记该基因，例如Myc或HA。报道分子和表位标记被常规地融合到目标基因的N末端或C末端上。另外使用特异于膜或核酸的染料来显示细胞器官，例如可以通过用DAPI染色DNA来可视化细胞核。通常在共聚焦显微镜下采集图片，该显微镜确保被观察的蛋白质处于同一焦平面上，如果有任何处于同一焦平面的蛋白质，则存在共定位。通过颜色重叠来显示共定位。但是，应当强调的是，共聚焦显微镜的解决方法仅能够检测蛋白质的整体共定位，而未必要地证实紧密相互作用。重叠的颜色不是必然地意味着相互作用的蛋白质，即蛋白质在非常短的距离内分布，例如在3-100的范围内。因此，共定位研究通常需要辅助分析，以查看共定位的分子是否真实地代表相互作用的配偶体。评价假定的相互作用的分子的典型标准生物化学技术包括共免疫沉淀试验、亲合下降分析和亲合层析。还可以通过所谓“补缀/带帽”试验来确定细胞表面分子共定位，例如蛋白A和B。简而言之，通过往活细胞中加入蛋白A的多价配体，会在膜上聚集蛋白A分子的团块或斑点。如果细胞是活的并且代谢活跃，形成斑点并且在所谓“带帽”过程中进一步聚集成帽状物，优选在37℃下发生。可以通过直接荧光染色方法对斑点/帽状物进行染色。随后，在4℃下(以保持斑点/帽状物)，用抗蛋白B的染料缀合的抗体对细胞进行共染色，以评价蛋白B是否迁移到一起，即与“补缀/带帽”的蛋白A一起共定位，或者蛋白B是否仍然广泛地布在细胞表面上。1虽然，在实践中，这种方法用于评价表面膜蛋白的共定位，但是该方法是费时的，需要经验，仅能通过染色显微方法评价，不能通过流式细胞仪方法进行。而且，显微方法不适合作为相互作用的分子评价的高通量方法。一种用于检测密切相互作用的分子特别优良的方法包括荧光能量共振转移(FRET)。在FRET中，在用光源激发后，染料(称作“供体”)将其能量转移到另一种染料上(称为“受体”)。当供体染料的发射光谱显著地超过了受体的激发光谱，发生能量转移。十分紧密地并置两种染料，通常比100更近，优选比50更近，这对于供体/受体对之间的能量转移来说是关键的。是一种米制单位，1等于0.1纳米或者10-10米。FRET通常基于具有荧光性的供体和受体染料之间的相互作用。但是，也可以用非荧光受体染料，通过供体荧光猝灭来检测FRET。总的来说，非荧光的受体染料是有利的，因为它们去除了由直接的受体激发产生的背景荧光。在本发明中，有可能用荧光供体染料和非荧光受体染料来监控相互作用的分子上的并置探针。一套探针特异性地结合到非相互作用的分子上，将会产生一种基线荧光信号。由于分子的紧密相互作用，探针间的FRET将会猝灭供体荧光。使用非荧光受体包括测量供体荧光下降，而不是测量受体荧光升高。通常，检测下降的信号的灵敏性比检测增强的信号的低。因此，按照本发明的方法优选用荧光供体染料和荧光受体染料进行。FRET能量转移效率与供体和受体之间的距离的6次方成反比。FRET首先由Frster描述，由于FRET能够在几纳米的水平上测量分子间的距离，对现代细胞生物学来说是极其重要的。几纳米的水平远远超出了目前约为100nm的现代光学远场显微镜的分辨极限。FRET技术已经被用于检测各种个别的(生物)分子。例如US6,235,535中描述一种用于在生物样品中检测被分析物的基于荧光的免疫测定方法。该方法基于多价被分析物(抗原)诱导用荧光团标记的同一受体分子(抗体)聚集的能力，受体分子被固定到脂膜上，但是可自由地运动。抗体诱导受体分子的聚集导致FRET发生。在US2002/0081617中，还固定了定向于同一表位但是用受体染料的任何一种供体标记的抗体，在这种情况下被固定到珠上。添加感兴趣的被分析物(抗原)，该被分析物作为一种桥连，将一对抗体紧密的连接到一起，引起FRET。因此，US6,235,535和US2002/0081617都涉及用固定的、染料缀合的探针和基于FRET的方法来检测和测量被分析物。由于US6,235,535和US2002/0081617的探针套都定向于单一的分子或分子表位，其实质上不适合于检测特定的相互作用的分子。FRET方法对分子间的距离高度灵敏，是一种用于解决细胞内蛋白质排列和蛋白质动力学的非常有用的工具。由于仅在纳米水平的荧光团距离上观察到FRET，因此，存在FRET表明分子间相互作用。这特别地意味着，简单的两个分子如蛋白质的共定位不足以产生能量转移。FRET是一种能够对蛋白-蛋白相互作用问题提供清楚的、毫不含糊的答案的技术。FRET测量可以被用于确定细胞表面上的蛋白的相互作用。2由导入来自维多利亚水母(Aequoreavictoria)的绿色荧光蛋白(GFP)引起的“绿色革命”以及后来开发的具有不同光谱特性的GFP突变体，使得可能在同一细胞中同时表达不同蛋白、用荧光供体和受体结构域进行人工标记。3，4这使得可以通过FRET测量它们的相互作用。通常使用蓝色荧光蛋白(CFP)(供体)和黄色荧光蛋白(YFP)(受体)标记的蛋白质的组合。这种FRET对可以被用于在3-6nm内监控两种被连接的荧光标记的接近程度。共表达CFP-和YFP-标记的蛋白质已经被成功用于在活细胞中分析蛋白质-蛋白质相互作用中的瞬时变化，例如寡聚化、共定位、复合物形成、激酶激活和酶活性作图。FRET技术还被用于高特异性的荧光寿命成像显微方法(FLIM)，用于监控细胞内的表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化。用GFP标记的EGFR和Cy3缀合的抗磷酸酪氨酸抗体来监控EGFR磷酸化。5虽然荧光标记蛋白已经被证明是非常有用的，它们具有局限性，例如其尺寸大(＞200个氨基酸)。此外，被标记的蛋白质的完全折叠的和三级的结构可能不同于天然的、未被标记的蛋白质的结构。这可能会产生与其他分子的不同、错误的相互作用。仅当重组的、被标记的蛋白质与相应的内源性野生型蛋白质类似地起作用，根据被标记的蛋白质对之间的FRET数据对特定的蛋白质-蛋白质相互作用做出结论，以及与活细胞中的正常细胞功能进行比较才被证明是正确的。例如，被表达的荧光标记蛋白质应当显示与野生型蛋白相同的细胞内分布；被标记蛋白的表达本身应当不会诱导或抑制细胞功能，而且在细胞中表达的被标记蛋白不会产生显著的背景FRET信号，例如由于过度表达、pH改变等。使用重组的、被标记蛋白的另一个主要缺点在于，实际上其需要将感兴趣的嵌合结构(共)转染到细胞中，选择大量表达构建体的细胞以获得功能性蛋白。显然，这种系统不能够检测内源性蛋白质，因而不被用于评价内源性相互作用的分子。一个报导中描述了使用FRET技术借助受体特异的抗体来监控配体诱导的细胞表面受体二聚化，该抗体被直接缀合到供体染料FITC或受体染料Cy3上。6通过流式细胞仪分析FITC和Cy3之间的FRET，来评价配体诱导受体二聚化的能力。一对抗体缀合物被用于研究淋人巴细胞的细胞表面蛋白通过抗不同表位的抗体对来检测CD8α链；通过特异于整联蛋白β1(CD29)或整联蛋白α4(CD49d)的抗体缀合对之间的FRET来检测极迟抗原4(VLA4)，异二聚化的α4β1整联蛋白；当使用抗-TCR抗体和I型MHC/肽复合物时，通过FRET检测T细胞受体(TCR)与可溶性抗原配体之间的关系。在还有另一个报导中，抗体介导的FRET技术被用于测量c-kit受体与其配体SCF(干细胞因子)的相互作用。7因此，迄今抗体介导的FRET技术还未被应用于检测细胞内的蛋白质-蛋白质相互作用。根据所谓的间接结合原理，FRET技术还被应用于检测蛋白质-DNA相互作用。例如，该技术被用于监控转录因子的p65亚单位、NF-kappaB及其DNA结合位点之间的相互作用。由于NF-kappaB能够调节大量参与各种免疫反应和炎症反应的基因，NF-kappaB与制药领域极其相关。由于这种NF-kappaB已经暗示数种疾病状态，包括各种病毒性感染(HIV)、关节炎和癌症。用Cy3标记的抗GST抗体(约7-12个染料/分子)可以与亲合纯化的p65和GST的GST融合蛋白(p65GST)。含有NF-kappaB结合位点的双链DNA(dsDNA)序列逐一地在其编码序列的5′端用Cy5标记。然后用Cy3标记的抗体和p65GST温育。然后在存在或不存在标记的非特异性或特异性的竞争dsDNA时，进行反应。在缺乏任何一种竞争物时，p65-GST的结合会引起抗GST上的Cy3供体分子和dsDNA上的Cy5受体分子之间发生FRET。因此，具有一种其可以检测内源性细胞内蛋白质和/或其他分子例如核酸、脂质和/或糖类成分之间的相互作用的方法，这是有利的。特别具有挑战性的是在单细胞水平上检测分子间的相互作用。本发明提供一种观点，当染料缀合的探针例如抗体被充分地并置时，它们可以被用于检测相互作用的内源性分子。所提供的是一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能量转移能够发生；至少一种探针具有一种能够并置所述至少第一种和第二中探针的反应基团，其中所述反应基团使得可以调节所述探针的并置，以提高在所述染料之间发生能量转移的可能性。按照本发明，分子探针能够通过所谓的结合结构域特异性地结合感兴趣的相互作用的分子上。在至少第一种和第二种探针通过结合结构域结合到分子上之后，反应基团可以被用于调节探针的并置。反应基团不或最小地倾向于与结合结构域竞争结合到相互作用的分子上。因此，一套本发明的探针可以区别于已知的抗体探针的探针套，抗体探针通过仅结合到荧光抗原性分子或复合物上而成簇或被并置。在探针结合到相互作用的分子上之后，反应基团优选仍然可以用于调节并置探针的空间排列。此外，本发明提供一种用于检测细胞中的至少两种相互作用的分子的方法，使用一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针能够结合到不同分子上，每一探针还具有一种染料，其中所述染料一起使得能量转移能够发生，至少一种探针具有使得抗体调节所述至少第一种和所述第二种探针的并置的反应基团，使得所述染料之间发生能量转移的可能性被提高，该方法包括提供一探针套，提供包括细胞的样品，在允许将所述探针在所述相互作用的分子上并置的条件下将所述样品与所述探针接触，去除任何未结合和任何非特异性地结合的探针，通过FRET来检测所述探针的并置，以确定所述分子之间的相互作用。所提供的方法特别适合于评价细胞内蛋白质的紧密相互作用。但是，所描述的方法还可以被应用于检测其他种类的分子之间的相互作用，例如蛋白质-核酸相互作用，只要合适的探针被使用。一种合适的探针是能够特异性地结合到特定分子上的物质。特定分子可以是一种蛋白质、核酸、脂质、糖类。核酸可以是DNA或RNA。探针可以是传统的(多克隆或单克隆)抗体或合成的抗体或其功能性等价的结合片段，例如Fab′、Fab或单链Fv片段。按照本发明的探针，实际上包括任何类型的结合分子，其能够特异性地结合到或杂交到特定分子上，例如蛋白质、核酸、脂质分子、糖类成分或其他类型的生物分子。例如，本发明可以用能够杂交到特定核酸序列上的核酸探针来实施。各种核酸探针可以被用于本发明来鉴定遗传元件。这些探针包括传统探针，例如短链的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)以及肽核酸(PNA)。PNA与DNA相关，但是不同于DNA。PNA的化学结构不同于DNA，其中肽链样主链结构替代了磷酸主链，用于支持核酸碱基。按照本发明所使用的核酸探针可以根据将被研究的核酸区域的序列分析来选择。可以按照本领域已知的方法来合成和标记探针。探针成功地结合到样品中的核酸区域上，鉴定了基因片段。在本发明中提供了一套至少第一种和第二种探针的探针套，每一探针具有一种能够发生能量转移的染料，每一探针还具有可以并置所述第一种和第二种探针的反应基团。在本文中，术语染料是指一种取代分子(substituent)，与另一种染料合作，用于能量转移，例如FRET分析。优选的是，至少所述染料之一为一种荧光团。为了实现能量共振转移，一种供体染料分子必需吸收光，并通过激发电子共振将该光转移给受体第二种染料分子。为使能量转移发生，供体的荧光发射波长必须比受体的激发波长短；也就是说，该过程必须是能量“倾斜的”。尽管FRET通常是基于供体荧光染料和受体荧光染料间的相互作用，也可以使用非荧光的受体染料。有时，这是有利的，因为这样消除了由直接的(即非激活的)受体激发产生的背景荧光。合适的荧光团的来自为荧光素标记，例如5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(和6)-羧基胺己酸以及荧光素异硫氰酸酯、AlexaFluor染料、花菁染料例如Cy2、Cy3、Cy5、Cy7，可选择取代的香豆素、R-藻红蛋白、别藻红蛋白(allophycoerythrin)、德克萨斯红和PrincestonRed以及R-藻红蛋白与例如Cy5或德克萨斯红的缀合物。还可参见www.probes.com/handbook/tables/1570.html。其他感兴趣的染料为量子点(quantumdot)染料，其几乎达到对颜色的极限调色。合适的染料的例子是那些适合通过传统流式细胞仪方法分析的染料。可被用于通过最传统的流式细胞仪方法检测的FRET对在Szollosi等中被讨论。8用于实施本发明的优选的荧光染料组合包括那些被用于常规串联缀合物中的那些染料，也被称作为duochromes9。在本发明的优选实施方案中，将样品与两种抗体接触，一种抗体抗蛋白A而另一种抗体抗蛋白B，以监控蛋白A和蛋白B之间的相互作用。一种抗体用FRET供体染料标记，而另一种抗体用FRET受体染料标记。仅当蛋白A与蛋白B紧密相邻时，例如都为较大的蛋白质复合物的构成部分时，两种抗体变得相互足够接近(并置的)，使得供体/受体对诱导一种可检测的FRET荧光信号。但是，一个完整的抗体是一个大的Y形蛋白质分子，大小约为150kDa，由两条重链和两条轻链构成。由于抗体分子的长度(300-400)以及铰链区的弹性，抗体分子能够跨越相对大的距离。抗体的弹性可能降低一对染料之间发生FRET的可能性，这对染料被缀合到并置的抗体探针上。此外，探针或染料的大小可能会通过产生负面空间排列作用，干扰能量转移。而且，当制备染料缀合物如荧光探针时，一般不可能控制缀合位置。在进行抗体缀合的情形下，染料成分被连接到抗体分子的不同部分上。根据染料缀合的位置，染料在探针上的空间方向对于能量转移效率来说可能有利或不利，即结合到探针上的染料不必在相互之间的能量转移距离内。当通过分析相互作用的细胞表面蛋白，评价PE/APCFRET对在抗体介导的FRET中的使用时，尽管所观察到的能量转移效率总是低于10％，在所有情况下都对FRET进行检测。可能地，这是由与PE和APC的大小和结构相关的空间作用引起的。因此，尽管紧密并置FRET探针是供体/受体对间发生能量转移所需的，但是这并不总是足以实现被连接到所述并置探针上的染料之间的有效能量转移，例如相互作用的分子或作为复合物的部分的抗体上的荧光染料缀合的抗体之间的能量转移。现在，本发明提出一种观点，即可以通过提供至少一种具有反应基团的探针来稳定和/或加强探针的并置，为该问题提供一种解决方法。提供了一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移；至少一种探针包含一种使得能够并置所述至少第一种和第二种探针的反应基团，其中所述反应基团使得能够调节并置所述探针，以使它们之间的能量转移的可能性被提高。使用这样一种探针套，使得与使用无反应基团的探针相比，通过测量能量转移检测并置探针的灵敏性提高了。在本文中，术语“反应基团”是指一种可以调节探针上的FRET染料的空间方向的成分，使得发生能量转移的可能性提高了和/或能量转移效率提高了。空间排列是指染料间的距离以及它们的相对方向。调节空间排列包括调整和稳定染料的空间排列。发生能量转移的重要条件之一是供体和受体分子必需紧密相邻，通常为2-100。在一个优选实施方案中，反应基团使所述染料彼此的间距在100内，优选彼此的间距在50内，最优选彼此的间距在20内。因此，优选反应基团很小，例如小于10千道尔顿(kDa)，较好地小于5kDa，更好地小于2kDa，或最好小于1kDa。一种反应基团能够调节并置的探针(通过其结构域结合到相互作用的分子上的探针)，使得通过直接与另一个探针相互作用在染料之间发生能量转移的可能性提高。例如，第一个探针的反应基团结合到并置的第二种探针的一部分上，在空间方向上，在所述探针之间形成稳定的复合物，有利于FRET发生。如上提及的关于染料的缀合位置，通常不可能用一种反应基团在特定位置上选择性地修饰一种探针。主要通过特定残基的存在和可接近性来确定修饰位置，反应基团通过该残基缀合到探针上，例如通过伯胺或通过巯基。因此，抗体探针可能在免疫球蛋白的恒定区和/或可变区中含有反应基团。可以想象，由于空间位阻，不是每一个位置都同样地适合于与第二种探针相互作用。因此，优选一种探针具有多种反应基团，以在统计学上提高其与另一种探针相互作用的可能性。在此提供的是，一种用于检测细胞中的至少两种相互作用的分子的方法，使用一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针能够结合到不同分子上，每一探针还具有一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移，至少一种探针具有可以调节并置所述至少第一种和所述第二种探针的反应基团，使得所述探针之间的能量转移的可能性提高了，该方法包括提供一探针套，提供一种包含细胞的样品，在允许所述相互作用的分子上的所述探针并置的条件下，将所述样品与所述探针接触，去除任何未结合和任何非特异性地结合的探针，通过FRET来检测所述探针的并置，以确定所述分子间的相互作用。在第一种探针能够直接结合到至少第二种探针上的情况下，优选在连续步骤中将所述样品与各个探针接触，该连续步骤具有大量间断的洗涤步骤以避免探针之间的自身相互结合。例如一套探针A和B被用于检测样品中的分子A和B的相互作用。至此，所述样品与包含反应基团的探针A接触，以识别和结合到分子A上。接着，通过重复洗涤步骤，去除任何未被结合以及任何非特异性地结合的探针A。随后，在可以并置相互作用的分子A和B上的探针A和B的条件下，将所述样品与特异性地与分子B反应的探针B接触。同样，通过重复洗涤步骤，去除任何未被结合以及任何非特异性地结合的探针B。探针A的反应基团可能与并置的探针B相互作用，以调节存在于所述探针上的染料的空间方向，使得它们之间发生能量转移的可能性提高。虽然这种方法可以被用于直接检测密切相互作用的分子，应当清楚，这种包括多个分开的接触和洗涤步骤的方法是相当烦琐和费时的。而且，人工探针能够直接相互作用，可能产生显著的背景信号，因为总的来说，特异性探针结合到其目标分子上，而无论这些分子是否相互作用。在上面的例子中，结合到不与分子B相互作用的分子A上的探针A可能还复位(recruit)探针B，使得在缀合到探针A和B上的染料之间发生能量转移。此外，如果在将样品与探针A接触后，不是有效地去除未被结合的探针A，则在随后的将所述样品与探针B接触时，会发生不期望的探针A和B之间的相互作用。尽管实际上探针B未被并置到相互作用的分子上的探针A中，这两种事件都会产生可检测的能量转移信号。因此，在本发明的优选实施方案中，至少第一种探针的反应基团不会直接或立即与第二种探针反应，以避免所述探针的自身结合。这还有利于通过各种探针的结合结构域最佳识别相互作用的分子，有利于并置所述分子上的所述探针。此外，避免了在直接接触或多聚化探针之间发生不适时的能量转移，并且降低了特定的背景信号。重要的是确保能量转移信号真实地反映并置探针。本发明提供一种观点，探针包含不会直接地与另一种探针相互作用的反应基团，以避免所述探针的自身结合，该探针有利地被用于包括能够调节所述探针之间的相互作用的所谓“桥连”物质的系统中。这种系统使得可以调节所述探针的并置，使得所述探针上的染料之间的能量转移的可能性提高，而探针间发生非特异的和/或不适时的相互作用的可能性被最小化。使用这样一套探针，结合桥连物质，具有数种优于使用直接相互作用探针的优点。首先，提高特异性并降低背景染色。毕竟，对于一种反应基团通过桥连位置产生作用，在加入所述物质之前，探针必须相互紧密并置，即由邻近另一种探针的一种探针结合到紧密相互作用的分子上引起。其次，由于各个探针不需要分开的接触步骤和洗涤步骤，这种方法较为快速并且更容易操作。因此，可以在单一操作中，将样品与所有探针的混合物一起接触。同样地，可以同时去除任何未被结合的和任何被非特异地结合的探针。该物质可以是任何种类的化合物，其能够结合或者修饰探针、反应基团和/或染料，以调节并置探针上的染料的空间排列，以对FRET有利。所述物质使得所述染料处于彼此的间距在2-100内。优选在染料缀合探针结合到相互作用的分子上之后，将所述物质加入样品中，该物质含量足以调节在并置探针上的所述染料的空间排列。有利地，所述物质以高度特异性和亲合性结合到反应基团上。此外，优选这种物质相对较小，使得桥连物质仅最小地影响一对染料之间的距离和一对染料的相对方向。如本文说明书中所示例，最优选的是一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移；每一探针具有一种反应基团。一种物质优选能够结合或“桥连”至少两个反应基团。在优选实施方案中，一套探针中的各个探针具有相同的反应基团。此外，一套探针中的各个探针可能具有不同的反应基团，但是具有相同的反应活性。使得可以使用一种类型桥连物质，该桥连物质具有至少两个相同的反应基团的结合位点。在本发明一个实施方案中，一种探针具有多个反应基团，如2个或3个甚至10个反应基团，使得所述探针能够与一分子以上的桥连物质相互作用。如果一种探针具有一个以上的反应基团，则在理论上将会增加所述探针与桥连物质之间的相互作用的可能性。此外，为了便于实施本发明，合适的反应基团或其衍生物可以从商业上购买得到，并被容易和有效地连接到探针上。按照本发明，一种特别有意义的反应基团是生物素，而抗生物素蛋白或链霉抗生物素是特别合适的桥连物质。抗生物素蛋白是一种鸡蛋白来源的糖蛋白，具有约68000道尔顿的分子量，直径为8-10。其由四条相同的亚基链组成。一个抗生物素蛋白或链霉抗生物素能够结合四分子生物素。抗生物素蛋白对生物素具有格外高的亲合性(亲合常数＞1015M-1)。这种高亲合性使得可以在抗生物素蛋白和生物素标记的探针之间迅速形成稳定的复合物。蛋白质链霉抗生物素由细菌阿维丁链霉菌(Streptomycesavidinii)生成，具有非常类似于抗生物素蛋白的结构，也能够紧密地结合生物素。其通常较少出现非特异性的结合，因此通常被用于替代抗生物素蛋白。一旦形成生物素-抗生物素蛋白复合物，该键基本上是不能除去的。生物素-抗生物素蛋白系统被广泛地使用，并且已经证明采用生物素化的抗体、凝集素或核酸探针，该系统在抗原、糖基缀合物以及核酸的检测和定位中是非常有用的。如所述，具有这种小尺寸的反应基团对于在染料对之间产生近的间距是有利的。生物素是具有仅244道尔顿的分子量的维生素。此外，许多生物素分子可以被缀合到一个蛋白质上，确保生物素化蛋白结合一分子以上的抗生物素蛋白。抗生物素蛋白、链霉抗生物素和生物素可以从许多商业来源获得。各种用于制备生物素缀合物的标准方法对于本领域技术人员来说是已知的，这些方法中的大部分可以在一天之内完成。而且，商品生物素化试剂盒也是可以获得的，其含有蛋白质生物素化的所有必需成分。当一套探针被使用，其中每一探针具有不同的反应基团，一种合适的物质包括一种能够结合至少各种反应基团之一的分子。或者，这种结合物质包括一种至少两个能够共价地或非共价地相互连接的分子的复合物，其中每一分子能够结合一个反应基团。按照本发明的方法，可以在细胞中检测至少两个相互作用的分子，其中所述分子中至少一种是蛋白质类物质。在另一个实施方案中，所述分子中至少一种为核酸。在本发明的还有另一个实施方案中，所述分子中至少一种是脂质或糖类。例如，本发明提供一种方法来检测至少一种蛋白质与至少一种核酸的相互作用，例如DNA结合蛋白结合到特异性的DNA构象序列上。DNA结合分子的家族包括转录因子或阻抑蛋白以及其他结合到双链和/或单链DNA上的蛋白质。其还包括血清中的特定DNA结合蛋白，其可以被用作恶性疾病的标记。在本发明的一个实施方案中，所提供的方法被应用于检测RNA结合蛋白和RNA分子之间的相互作用。RNA结合蛋白是基因表达的转录调控所需的。其参与多种翻译后的加工，例如调控前mRNA的剪接、mRNA稳定性以及RNA在细胞核和细胞质之间的运输。例如，可以使用一种探针，该探针组合识别特定RNA序列的第二种探针结合到RNA结合蛋白质上，如针对特定剪接因子的抗体。仅当剪接因子与RNA之间发生相互作用时，才产生FRET信号。所提供的方法使得可以在单细胞水平上检测蛋白质-核酸的相互作用。为了避免干扰感兴趣的分子之间的相互作用，优选探针的结合结构域识别并结合到感兴趣的分子的一个区域上，该区域不同于所述分子间的相互作用部位。在另一个实施方案中，提供一种能够检测蛋白质如糖结合蛋白(CBP)与糖类之间的相互作用的探针。目前，蛋白质-糖相互作用被认为是细胞通讯的重要调节物。在过去的十年中，许多新的CBP已经被描述，多种已经被证明在细胞运输和细胞信号中起重要作用。CBP识别糖蛋白和糖脂上的糖配体。包括四个大的CBP家族，sigles、C-型凝集素、galectin和识别由CD1和MHC抗原呈递分子呈递的糖配体的T细胞抗原受体(TCR)亚型。在另一个方面，本发明涉及一种可以被用于检测蛋白质-脂质相互作用的探针套，至少一种探针可与感兴趣的蛋白质反应，而至少一种探针可与感兴趣的脂质反应。该蛋白质可以是与脂肪物质相互作用的酶，例如脂肪酶、脂肪激酶或脂肪磷酸化酶。蛋白质探针可以包括与所述蛋白质特异性的反应的抗体。按照本发明的脂质探针可以是具有脂质结合特性的蛋白质成分。特别有意义的是那些特异地识别和结合脂质分子的脂质探针，这些脂质分子参与信号转导路径，例如磷酸肌醇多磷酸盐或脂质二级信使甘油二酯(DAG)或磷脂酸(PA)。嵌合绿色荧光蛋白-普列克底物蛋白同源物(PH)结构域蛋白已经被用作在活细胞中显示磷酸肌醇磷酸盐(PtdInsP(n))的分子传感器。合适的脂质探针包括重组生产以及纯化的PH结构域。还包括蛋白激酶C(PKC)的DAG-结合结构域以及Raf-1激酶的PA-结合区。脂质探针包括针对特定脂质的抗体，例如特异地与PtdInsP(3)反应的单克隆抗体。10但是也可以考虑其他脂质探针。一套按照本发明的染料缀合探针可以被用于在单细胞水平上检测大范围的各种信号传导事件，稳定的或瞬时的事件。这些事件包括受体与一种或多种其他分子相互作用，如受体-配体相互作用、受体聚类或聚合、受体与细胞内信号分子的相互作用。用在此提供的方法检测的其他事件包括各种信号分子之间相互作用，例如将含有Src-同源物2(SH2)的蛋白质停靠(docking)到另一个蛋白质的特定磷酸酪氨酸残基上，或者含有Src-同源物3(SH3)的蛋白质结合到另一个蛋白质的富含脯氨酸的链上。使用特定探针，本发明的方法使得可以检测细胞骨架蛋白之间以及核蛋白(所谓信号体(signalosome))之间的相互作用。信号传导路径的激活通常包括由酪氨酸激酶和/或丝氨酸/苏氨酸激酶引起的蛋白质磷酸化。蛋白质磷酸化会改变酶的活性以及蛋白质的构象。最终结果是细胞活性改变以及相应细胞中的被表达的基因的程序改变。在另一个实施方案中，探针包括特异地识别处于被磷酸化状态的蛋白质的磷酸特异性抗体。被磷酸化的残基可以是酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸。针对各种信号蛋白质的磷酸特异性抗体可以从大量公司购买得到，例如UpstateBiotechnology，NewEnglandBiolabs、Sigma以及许多其他公司。例如，针对Erb受体酪氨酸激酶的Cy3标记的磷酸酪氨酸特异的抗体可以被用于特异性地检测激活形式的受体。合适探针的其他例子包括磷酸特异性抗体，其仅识别横纹肌肉瘤中的磷酸化形式的细胞核转录因子forkhead(FKHR)、蛋白激酶B(PKB)、有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)。数年以来，作为底物或者酶抑制剂的核苷酸类似物以及选择性结合到核苷酸结合蛋白的调控位点上的衍生物，被用作分离蛋白质的结构性和机械性的探针。这些类型的分子也作为实施本发明的方法的有意义的探针。在此提供的方法可以在单细胞水平上检测相互作用的分子。单细胞可以用例如流式细胞仪或者荧光显微镜分析。在优选实施方案中，所述检测用流式细胞仪进行。流式细胞仪的主要优点在于其直接得出定量数据，并且其是否快速(可以在数小时内获得结果)。通过流式细胞仪检测能量转移使得可以高通量地分析相互作用的分子。在单细胞水平上高通量流式细胞仪检测分子互作，使得可以时程和剂量反应研究一种或多种前面提及的相互作用，例如信号传导事件、转录因子相互作用。例如可以使用一套按照本发明的合适探针，在单细胞水平上研究Tcf-1转录因子与β-连环蛋白之间的相互作用，或者胞质蛋白酪氨酸激酶ZAP-70与T细胞受体(TCR)的ζ链的结合。在一个实施方案中，所提供的方法使得可以在被透化的和/被固定的细胞中，在单细胞水平上检测分子互作。而且，由于所提供的方法能够检测内源性分子，这对于在原代细胞中研究分子互作是特别有用的。例如，该方法可以被用于根据一种或多种上面提及的相互作用，区别正常细胞和异常细胞。因此，本发明优选用适合于通过流式细胞仪的FRET检测的供体/受体对来实施。通常用于FRET的供体/受体对包括荧光素异硫氰酸酯(FITC)和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)。但是，由于FITC和TRITC的摩尔消光系数相对低和量子产额低，灵敏性很差。此外，该对的激光源通常被存在于标准的流式细胞仪中。当采用R-藻红蛋白(R-PE)/别藻篮蛋白(APC)对时，不会遇到这些问题。这些染料是含有多条链的大蛋白质复合物，而发光团被共价连接。它们属于藻胆蛋白的组。天然地制备藻胆蛋白，并且与藻胆蛋白体相关，并且被不同藻青菌或藻类利用。PE/APC对是非常有前景的供体/受体对，因为尽管PE和APC大小，还能够达到FRET效率的90％。而且该FRET对很容易在商业上可获得的流式细胞仪上被检测，例如结构中装备了两台激光器(或二极管)的FACSCalibur、LSR和FACSVantage，该激光器发射488nm和632nm的光谱。采用流式细胞仪或荧光激活细胞分选(FACS)检测能量转移，使得能够快速、多参数地分析异质群体中的特定个别细胞。通过流式细胞仪检测细胞上的多个荧光标记，为单细胞分析提供一种有力的工具，可以亚群门控靶细胞群体。在靶细胞群体中进行选择性分析提高了检测方法的灵敏性。对于在原代细胞中检测分子互作，使用一种额外的标记来确定感兴趣的靶细胞群体是特别有利的。在感染性疾病、微小残留病变检测和监控诊断，以及基因治疗中的大量重要生物学应用，通常需要从大背景中分析和分离稀有细胞(例如造血干/祖细胞)。按照本发明的方法可以包括细胞内染色或表面标记染色来确定细胞混合物中的靶细胞群体，包括用能够选择性地鉴定所述细胞标记的荧光比较抗体来染色。目前，本发明使得能够通过免疫表型特征，门控存在于细胞混合物中的细胞亚群，即，可以在稀少的细胞群体中检测相互作用的分子。在优选实施方案中，提供一种方法，以用多参数流式细胞仪/细胞分选技术检测和/或分离稀少的单细胞，以在单细胞水平上表征分子互作。目前提供的方法使得可以在异常细胞和正常细胞的混合物中检测互作的分子，以根据分子间的异常相互作用来检测和量化异常细胞。这样一种方法特别适合应用于解决免疫系统发育、感染性疾病、癌症和基因治疗中的大量重要问题。典型地，在用探针套染色细胞样品之前，用至少一种相关染料缀合抗体按照标准方案标记细胞，以确定细胞混合物中的靶细胞群体。细胞混合物包括活细胞。还包括被透化的和/或固定细胞。提供一种方法，包括染色样品的至少一种细胞标记来确定靶细胞群体，包括将所述样品与能够选择性地结合到细胞标记上的化合物接触。在优选实施方案中，这种化合物直接用荧光染料标记。合适的化合物包含荧光标记的抗体或与之等价的结合片段。此外，可以使用能够选择性结合到细胞标记上的化合物，其可以用染料缀合的第二种试剂(例如荧光标记的第二抗体)检测。细胞标记包括任何类型的细胞内或膜结合标记，可以被用于区别细胞混合物中的细胞亚群。细胞标记可以分化簇(CD)抗原。CD标记是造血细胞的细胞表面分子，可以用单克隆抗体区分。造血细胞包括胸腺细胞、树突细胞、朗氏细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、生发中心B细胞、滤泡树突细胞、浆细胞和骨髓细胞。例如，适当的细胞标记包括CD1、CD3、CD4、CD8、CD10、CD19、CD20、CD33、CD34和CD117。直接针对大量人CD标记的单克隆抗体可以从各个供应商处获得，例如BDBiosciences或AncellImmunologyResearchProducts，Bayport，USA。通常，可以获得直接用所选择的荧光染料直接缀合的抗体，例如CD10-PE或CD19-FITC，其明显是实施按照本发明的方法的优选。除了用于检测至少两种分子的紧密相互作用的FRET染料外，染料的选择优选但不是排外地瞄准使用两种或三种染料来免疫分型。例如，可以将按照本发明的FRET探针套与一种或多种染料结合来通过免疫分型特性来调节白细胞亚群门控，例如用CD10、CD19和CD20来精确地定义骨髓中的B细胞前体亚群，或者用CD1、CD4和CD8来定义胸腺细胞亚群，或者用CD34和/或CD117来定义干/祖细胞群体。在一个实施方案中，本发明提供一种用于检测至少两种互作的细胞内分子的方法，使用按照本发明的一套探针，每一探针可以与不同分子反应，该方法包括提供包含细胞的样品，其中所述样品被固定和透化，将所述制备物与一套探针接触，在允许并置所述分子上的所述探针的条件下，各个探针能够结合到特定分子上，去除任何未被结合和任何被非特异结合的探针，通过FRET检测所述探针的并置。优选处理所述探针，以保持材料的形态并被透化处理，以确保感兴趣的分子与探针足够地接近。处理类型将取决于多种因素，例如取决于所用的固定剂，固定程度以及感兴趣的分子的类型和特性。可以用固定剂甲醛来进行固定。在一个优选方案中，实施该方法来检测细胞内的分子，细胞分子位于相互之间非常近的距离内，例如在100之内，优选在50之内，更加优选在20之内。本发明提供了一种方法，其中一种样品包括从生物样品中获得的原代细胞。生物样品可以是体液样品，包括血液、骨髓、尿液、脑脊髓液(CSF)、唾液。样品还可以是一种组织样品或者组织匀浆。样品包括培养的细胞，可以是培养的原代细胞，例如从皮肤活组织检查中获得的培养的真皮成纤维细胞。此外，样品可以包括来自已经建立的实验室细胞系的培养细胞，例如HeLa、COS、MCF-7或Jurkat细胞系，可以从大量来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC；参见www.atcc.org，查看在线目录)。本发明提供一种制备探针套的方法，包括将各种探针与合适的染料或其衍生物结合，形成所述探针与所述染料之间的缀合物，从过量的染料中纯化所述缀合物，还包括将至少一种探针与合适的反应基团或其衍生物接触，在所述探针和所述反应基团之间形成缀合物，以及从过量的反应基团中纯化所述缀合物。如上所讨论，一种探针可能包括一种传统的(单克隆或多克隆)抗体或者合成抗体或者其他结合分子，一种核酸结合探针，一种能够结合到特定核酸序列上的肽核酸探针，一种脂质结合分子，一种糖类结合分子。有利地，用对连接到探针上的染料之间的能量转移效率产生最小的负面空间作用的探针来实施本发明。例如，有利地，可使用比完整的IgG更小的抗体探针，例如Fab′、Fab，单链Fv片段或双抗体(scFv二聚体)。此外，可以使用低分子量的荧光FRET对。可能，用于标记生物分子的最便利的和广泛使用的功能性基团是伯胺基团。这可以通过赖氨酸残基的δ氨基基团来提供，或者由肽/蛋白质的游离N末端来提供。或者，有可能在自动合成例如寡核苷酸的过程中，导入含有不同修饰基团的伯胺。可以作为固体物种存储的氟标记种类的稳定活性酯，特别是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，在过去的许多年中已经被广泛地用于这种氨基基团的乙酰化。作为伯胺标记的替代，含有巯基的基团例如含有在半胱氨酸基团的那些基团或者，如具有伯胺基团，那些在(例如寡核苷酸)的自动合成过程中作为修饰物导入的基团可以用马来酰亚胺标记试剂(例如Cy3和Cy5)来特异性地靶向。考虑使用伯胺或巯基标记所有生物分子并不总是可行的。用于标记例如糖类的另一种常规途径是通过标记试剂靶向的乙醛基团。商品试剂盒可能适合被用于获得包含至少两种探针的探针套，每一探针具有一种染料，并且还额外地具有一种反应基团。典型地，用这种标记试剂盒来标记和纯化探针缀合物，容易在3小时内、花费极少人力准时地实现。例如，可以获得用于标记蛋白质类探针的试剂盒，例如一种抗体或者一种肽，具有荧光染料(www.probes.com/handbook/tables/1570.html)。期望的蛋白质类样品所需的染料含量可以用试剂盒方案中概述的指导方针来计算。通常，反应染料具有与蛋白质类物质的伯胺有效地反应以形成稳定的染料缀合物的琥珀酰酯成分。可以用旋转柱或大小排阻旋转柱容易地纯化缀合物。可以按照本领域技术人员知晓的标准方法确定最终的缀合比例。约为2.5∶1的染料与蛋白质的比例通常会产生保持探针特异性地识别一种分子的能力，以及足以用于FRET技术的荧光。同样地，可以获得各种商业试剂盒，可以被用于标记具有反应基团的探针，例如生物素。生物素-XX硫代琥珀酰酯(SSE)可溶于水，并且与伯胺酸反应形成稳定的生物素缀合物。生物素-XXSSE具有一个14个原子的空间，增强生物素衍生物结合到抗生物素蛋白的相对深的结合位点上。标记试剂盒通常含有即用型的用于从过量试剂中纯化生物素化的探针的旋转柱。本发明还提供一种用于确定生物样品中的相互作用的分子的诊断检测试剂盒，包括一套按照本发明的探针。在一个优选实施方案中，包括一个用于FRET介导检测互作分子的探针套的所提供的检测试剂盒，与一种或多种可以被用于确定细胞混合物中的靶细胞群体的染料缀合抗体组合。这通常是有利的，当样品包含生物样品。例如，可以鉴定和量化异常细胞与正常细胞混合物中的异常细胞，例如根据定义的异常信号复合物。采用按照本发明的方法，可以在诊断应用中检测许多不同类型的异常信号复合物。例如，可以对正发生重排的淋巴白血病中的RAG1和RAG2蛋白的相互作用进行评价。仅在那些RAG1和RAG2二聚体限制在目标DNA序列上的细胞中，正在发生重排。另一个例子包括检测脱磷酸化的β-连环蛋白与转录因子TCF家族成员的相互作用。仅在那些其中在细胞激活后检测到信号的细胞中，TCF因子被转录性地活化。因此，在此提供一种方法提供了一种用于可选择地在单细胞水平上监控、正常和病理性Wnt信号的手段，例如中结肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等中。此外，本发明的方法或探针套有利地被用于药物发现领域，例如用于从化合物文库中选择(候选)药物化合物。在药物打靶鉴定后，生物制药公司需要一种用于从化合物文库中筛选目标的快速系统，以鉴定那些将会对目标产生作用以及显示成为有效药物的潜力的化合物。在一个实施方案中，本发明的基于FRET的方法被用一用筛选影响细胞中的两种或多种分子间的相互作用的化合物，例如能够刺激或抑制信号复合物例如信号体(signalosome)形成的化合物。为此，使用一种探针套，其包括与信号复合物的第一种蛋白质反应的第一种探针和与复合物的第二种蛋白质反应的第二种探针。当复合物是完整的，第一种和第二种蛋白质相互作用，使得染料缀合的探针被并置，可以检测FRET信号。在加入一种结合到复合物的一个成分上的化合物(例如药物候选分子)时，复合物中的蛋白质间的相互作用被破坏。结果，结合蛋白质的探针不再被并置，不再发生FRET。当然，可以采用类似方法来筛选刺激或增强分子间的相互作用的化合物。在那种情况下，缺乏化合物时未检测到FRET信号，而加入化合物，会使两种或多种分子相互紧密相邻，以致发生FRET。在另一个实施方案中，在此提供的方法被用于检测化合物(药物)与其目标间的相互作用，即相互作用的分子为化合物及其目标。这需要一套探针，其中一种探针与化合物反应，而另一种探针可与目标(蛋白质)反应，例如，可以使用化合物特异的抗体探针以及目标特异性抗体探针。可以相象，在例如高通量筛选的情形下，开发用于数百种将被筛选的不同化合物的特异性抗体并不非常具有吸引力。但是，可以提供具有相同(表位)标记的不同化合物，使得仅一个针对标记的(抗体)探针与目标特异性探针被用于检测化合物与其目标间的相互作用。图1.荧光能量共振转移(FRET)原理的示意图，以荧光染料X作为供体染料而Y作为受体染料。A.如果X和Y之间的距离太大，则受体染料Y不被供体染料X的发射光激发。B.如果受体和供体染料之间的距离十分小(＜80但是优选＜50)，X的发射光将会激发受体染料Y。图2.抗A抗体和抗B抗体所识别的密切互作的蛋白质A和B的示意图。A.探针用供体染料X缀合，而探针B用受体染料Y缀合。此外，两种染料都用生物素缀合。B.如果探针真正地识别和结合密切相互作用的蛋白质A和B，则在用探针A和B孵育后，通过用抗生物素蛋白孵育将抗体结合在一起。该两种抗体探针的并置(通过生物素-抗生物素蛋白系统稳定)可以通过FRET原理(参见图1)检测。详细描述本发明提供一种用于检测蛋白质和其他分子的相互作用的方法，使用一套至少第一种和第二种探针的探针套，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移；至少一种探针具有一个反应基团，其中所述反应基团使得能够调节所述探针的并置，由此提高它们之间的能量转移的可能性。优选地，但是不是排外地，按照本发明的探针套包括至少一套两种染料缀合的抗体，各种抗体额外具有反应基团。为示例本发明，本发明人还描述了这样一套探针的制备。实施例探针套的制备制备抗体的方法是本领域技术人员知晓的，例如采用杂交瘤技术或者噬菌体展示。为了获得单克隆抗体，用免疫原例如重组蛋白质合成的肽来免疫试验动物。通过采集检测血液并确定反应滴度，来监控动物的免疫反应。当获得适当的高滴度时，从动物中采集血液，并制备抗血清。如果需要，进一步分离抗血清的级份，以富集与蛋白质反应的抗体，参见例如Harlow等.Antibodies.ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications，NewYork(1988)。可以通过本领域技术人员熟悉的各种技术来获得单克隆抗体。可以通过传统的免疫诊断技术，例如用表达重组融合蛋白的细胞溶解产物的Western印迹或ELISA，表征获得的抗体。抗体的生物素标记通常通过伯胺(即赖氨酸)将生物素缀合到蛋白质上。一般地，3-6个生物素分子被缀合到各个抗体上。在柱中，在100mM碳酸盐，pH8.4中透析或交换抗体。在缓冲液平衡后，测量抗体浓度。(对于IgG来说，1mg/ml具有1.4的A值(280))。如果抗体浓度小于1mg/ml，缀合可能是次优的。如果需要，将抗体稀释到4mg/ml的浓度。使用前，立即将10mg生物素(N-羟基琥珀酰生物素，Pierce)稀释在1ml无水DMSO(无水二甲基亚砜，Aldrich)中。反应活性生物素分子是不稳定的。一旦生物素被溶解，其应当立即被使用。添加生物素，得到80μg/mg抗体的比例；立即混合。用箔包裹试管；在室温下孵育和旋转2小时。去除未反应的生物素，将抗体交换到10mMTrispH8.2，150mMNaCl，pHix(溶于95％乙醇中的5mg/ml五氯苯酚(以10,000x或者3-4滴/升使用)Sigma)。探针的荧光染料缀合如上文讨论，大量各种染料或荧光染料可以被用于标记按照本发明的探针。作为一个例子，给出抗体探针的Cy5缀合，但是，当然可以选择许多其他荧光染料。通常可以在约半天时间内进行完整缀合。反应活性的Cy5分子是不稳定的。打开一小瓶，称取所需含量(典型地，1mg或2mg是足够的)。重新封好小瓶，4℃下干燥存储。立即将Cy5以10mg/ml的浓度溶解在DMSO。I.抗体的制备在柱中，在500mM碳酸盐，pH9.5中透析或交换抗体。在缓冲液平衡后，测量抗体浓度(对于IgG来说，1mg/ml具有1.4的A值(280))。如果抗体浓度小于1mg/ml，缀合可能是次优的。如果需要，将抗体稀释到4mg/ml的浓度。II.共价缀合Cy5被共价地缀合到免疫球蛋白的伯胺(赖氨酸)上。使用前立即以10mg/ml的浓度，将Cy5(Cy5-二-OSU，N，N′-二羧基戊基-5，5′-二磺酰-吲哚草酸花菁，AmershamLifeScience)溶解在无水DMSO(二甲基亚砜，Aldrich)中。在称取Cy5和将其溶解在DMSO中之间不应拖延；同样地，不应拖延将溶解的物质加入到抗体中。对于5∶1的最佳比例，每毫克抗体中加入40μgCy5；立即混合。将试管包裹在箔中；在室温下孵育和选择1小时。去除未反应的Cy5，将抗体交换到10mMTrispH8.2，150mMNaCl，pHix(Sigma；溶于95％乙醇中的5mg/ml五氯苯酚(以10,000x或者3-4滴/升使用))中，通过凝胶过滤或透析。参考文献1.MasonDY，Comans-BitterWM，CordellJL，等，AntibodyL26recognizesanintracellularepitopeontheB-cell-associatedCD20antigen.AmJPathol1990；1361215-22.2.MatyusL，Fluorescenceresonanceenergytransfermeasurementsoncellsurfaces.Aspectroscopictoolfordeterminingproteininteractions.JPhotochemPhotobiolB1992；12323-37.3.ChanFK，SiegelRM，ZachariasD，等，Fluorescenceresonanceenergytransferanalysisofcellsurfacereceptorinteractionsandsignallingusingspectralvariantsofthegreenfluorescentprotein.Cytometry2001；44361-8.4.SiegelRM，ChanFK，ZachariasDA，等，Measurementofmolecularinteractionsinlivingcellsbyfluorescenceresonanceenergytransferbetweenvariantsofthegreenfluorescentprotein.SciSTKE2000；2000L1.5.WoutersFS，BastiaensPI.Fluorescencelifetimeimagingofreceptortyrosinekinaseactivityincells.CurrBioll999；911276.GuoC，DowerSK，HolowkaD，BairdB.Fluorescenceresonanceenergytransferrevealsinterleukin(IL)-1-dependentaggregationofIL-1typeIreceptorsthatcorrelateswithreceptoractivation.JBiolChem1995；270275627.BroudyVC，LinNL，BuhringHJ，等，Analysisofc-kitreceptordimerizationbyfluorescenceresonanceenergytransfer.Blood1998；91898-906.8.SzollosiJ，DamjanovichS，MatyusL，ApplicationoffluorescenceresonanceenergytransferintheclinicallaboratoryRoutineandresearch.Cytometry1998；341599.Tanke，HJ.Fluorochromenvoortwee-endrievoudigelabelingen.Immunofenotyperingindediagnostiekindicatiestellingen，uitvoeringeninterpretatie.Eds.VanDongen，Groeneveld，Adriaansen，Hooijkaas(ISBN90-73436-16-8).1994；55-61.10.ChenR，KangVH，ChenJ，等，AmonoclonalantibodytovisualizePtdIns(3，4，5)P(3)incells.JHistochemCytochem.2002；50(5)69权利要求1.一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能量发生转移；至少一种探针具有反应基团，所述反应基团使得所述至少第一种和第二种探针并置。2.权利要求1的探针套，其中所述反应基团使得所述染料并置，彼此的间距在100内，优选彼此的间距在50内，更加优选彼此的间距在20内。3.权利要求1或2的探针套，其中所述第一种探针的反应基团不与所述第二种探针直接反应。4.权利要求1-3中任一项的探针套，其中至少一种探针具有多个所述反应基团。5.权利要求1-4中任一项的探针套，其中所述探针是一种抗体或者与其功能相当的结合片段。6.权利要求1-5中任一项的探针套，其中至少一种探针是核酸。7.权利要求1-6中任一项的探针套，其中所述染料中的至少一种是荧光染料。8.权利要求7的探针套，其中所述荧光染料选自荧光素异硫氰酸酯(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、德克萨斯红(TR)、R-藻红蛋白(R-PE)、别藻篮蛋白(allophycocyanin)(APC)、藻胆蛋白类(Phycobiliproteins)成员、Cy3、Cy5、Cy5、Cy5.5、Cy7、花菁染料、AlexaFluor染料、上述荧光染料的串联缀合物、以及量子点(quantumdot)染料。9.权利要求1-8中任一项的探针套，其中所述反应基团是生物素。10.用于检测细胞中的至少两种相互作用的分子的方法，采用一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针特异性地与一种不同的分子反应，每一探针还具有染料，其中所述染料一起使得能量发生转移，至少一种探针具有反应基团以调节并置所述至少第一种和第二种探针，由此提高所述染料之间的能量转移的可能性，所述方法包括-提供一探针套，-提供包含细胞的样品，-将所述样品与所述探针套接触，-在允许所述探针在所述相互作用的分子上并置的条件下，并-通过FRET检测所述探针的并置，以检测所述相互作用的分子。11.用于检测细胞中的至少两种相互作用的分子的方法，采用一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针特异性地与一种不同的分子反应，每一探针还具有染料，其中所述染料一起使得能量发生转移，至少一种探针具有反应基团以调节并置所述至少第一种和第二种探针，由此提高所述染料之间的能量转移的可能性，其中所述第一种探针的反应基团不与所述第二种探针直接反应，所述方法包括-提供一探针套，-提供包含细胞的样品，-将所述样品与所述探针套接触，-在允许所述探针在所述相互作用的分子上并置的条件下，-将所述探针与能够将至少所述第一种探针的反应基团连接到所述第二种探针上的物质接触，并-通过FRET检测所述探针的并置，以检测所述相互作用的分子。12.权利要求11的方法，其中所述物质使得所述染料并置，彼此的间距在2-100范围内。13.权利要求11或12的方法，其中所述反应基团包括生物素，而其中所述物质包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素。14.权利要求10-13中任一项的方法，包括对所述样品的至少一种细胞标记进行染色以确定靶细胞群体，所述方法包括将所述样品与能够选择性地结合所述细胞标记的化合物接触，其中所述细胞标记优选是一种分化簇(CD)抗原。15.权利要求10-14中任一项的方法，其中所述分子中的至少一种是蛋白质类物质、核酸、脂质分子或糖类。16.权利要求10-15中任一项的方法，其可以在单细胞水平上进行检测，优选采用流式细胞仪。17.用于提供至少第一种和第二种具有染料的分子探针并提供至少一种具有能够并置所述第一种和第二种探针的反应基团的探针的方法，其中所述染料一起使得能量发生转移，该方法包括-将每一探针与合适的染料接触，以在所述探针与所述染料之间形成缀合物，-还包括将至少一种探针与一种反应基团或其衍生物接触以在所述探针与所述反应基团之间形成缀合物。18.权利要求17的方法，其中所述反应基团包括生物素。19.包括权利要求1-9中任一项的探针套的诊断试剂盒。20.权利要求1-9中任一项的探针套或者权利要求10-16中任一项的方法在疾病治疗之前、期间和之后用于评价所述治疗的有效性或者用于诊断和/或分类疾病中的用途。21.权利要求1-9中任一项的探针套或者权利要求10-16中任一项的方法在从化合物文库中选择一种药物化合物中的用途。全文摘要本发明涉及检测相互作用的分子的领域。本发明提供一套至少第一种和第二种探针的探针套，每一探针具有使得能量发生转移的染料，至少一种探针具有使所述第一种探针和第二种探针并置的反应基团。本发明提供了一种方法，用于使用按照本发明的一套探针在单细胞水平上检测至少两种相互作用的分子。文档编号G01N33/542GK1735808SQ200380108365公开日2006年2月15日申请日期2003年11月6日优先权日2002年11月7日发明者雅各布斯·约翰内斯·马里亚·范东恩,弗兰克·雅各布·特奥多尔·施塔尔申请人:鹿特丹伊拉兹马斯大学