专利名称：精液白细胞群染色定量检测试剂、试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种体外诊断用试剂、试剂盒及其检测方法，具体涉及精液白细胞群染色定量检测试剂、试剂盒及其检测方法。
背景技术：
男性生殖道感染为男性不育的重要病因，占男性不育的4％～10％。近年来，随着性传播疾病的蔓延，同时由于亚临床和隐性感染的增多，对男性生殖道感染的实验室诊断就显得特别重要。白细胞精子症是指精液中白细胞密度超过1×106/ml。
通过染色法检测精液内白细胞主要有白细胞过氧化物酶法和酶免组化染色这两种方法。白细胞过氧化物酶法是WHO推荐的用于白细胞精子症标准检测方法之一，操作相对简便，只能检测精液内多形核中性粒细胞，对淋巴细胞、单核/巨噬细胞不能检出。酶免组化染色也是WHO推荐方法，此方法是利用白细胞表面共同抗原CD45检测精液内白细胞，由于CD45抗原是白细胞所特有的，因此此方法是检测白细胞精子症最准确的方法，现有的酶免组化染色试剂中显色底物极不稳定，需即用即配，十分不便。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供性能稳定，显色特异的精液白细胞群染色定量检测试剂及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的一种技术方案是，一种精液白细胞群染色定量检测试剂，包括1)第一抗体A种动物抗人CD45的IgG型单克隆抗体；2)第二抗体B种动物抗A种动物IgG的IgG类抗体；3)酶结合物A种动物的IgG型抗体与辣根过氧化物酶(HRP)复合物；
4)底物A3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)。
上述检测试剂的具体保存形式可以是1)第一抗体冻干粉含A种动物抗人CD45单克隆抗体的冻干粉；；2)第二抗体冻干粉含B种动物抗A种动物的IgG抗体的冻干粉；；3)酶结合物溶液含A种动物的IgG与辣根过氧化物酶复合物的缓冲液；4)底物A溶液含3-氨基-9-乙基卡巴唑、二甲基甲酰胺的醋酸盐缓冲液。
所述底物A溶液中各成分的含量优选3-氨基-9-乙基卡巴唑4～6％、二甲基甲酰胺2～3％。
上述检测试剂中的A种动物优选鼠，B种动物优选兔。
本发明采用的再一种技术方案是，一种精液白细胞群染色定量检测试剂盒，包括上述各种试剂。
所述试剂盒还可进一步包括5)特制玻片涂有耐酸、疏水性涂料印有染色窗的玻片。
本发明并提供利用上述试剂、试剂盒进行精液白细胞定量检测的方法。一种方法包括以下步骤，1)制作精液样本涂片，待其干燥后对细胞进行固定；2)在样本上覆以反应量的第一抗体，适温孵育使样本中白细胞上的CD45抗原与第一抗体充分反应，洗去未反应物质；3)再覆以反应量的第二抗体，适温孵育使已与CD45抗原结合的第一抗体与第二抗体充分反应，洗去未反应物质；4)再加入反应量的酶结合物，适温孵育使已与第一抗体结合的第二抗体与酶结合物充分反应，洗去未反应物质；5)再加入反应量的显色底物，所述显色底物含底物A与氧化剂，适温孵育使显色底物充分反应、沉淀，洗去未反应物质；6)观察记录检测结果。
另一种方法包括以下步骤，1)制作精液样本涂片，待其干燥后对细胞进行固定；2)以含单糖0.9～1.1％、氯化钠25～35mM、酪蛋白0.15～0.25％的去离子水溶液复溶第一、第二抗体冻干粉；3)在样本上覆以反应量的复溶后的第一抗体冻干粉，适温孵育使样本中白细胞上的CD45抗原与第一抗体充分反应，洗去未反应物质；4)再覆以反应量的复溶后的第二抗体冻干粉，适温孵育使已与CD45抗原结合的第一抗体与第二抗体充分反应，洗去未反应物质；5)再加入含有反应量的酶结合物的酶结合物溶液，适温孵育使已与第一抗体结合的第二抗体与酶结合物充分反应，洗去未反应物质；6)再加入反应量的显色底物溶液，所述显色底物溶液含底物A溶液与氧化剂，适温孵育使显色底物充分反应、沉淀，洗去未反应物质；7)观察记录检测结果。
上述检测方法中所述精液样本涂片可以用特制玻片制作，所述特制玻片为涂有耐酸、疏水性涂料印有染色窗的玻片。
上述检测方法中在所述观察记录检测结果步骤之前，还可以用苏木精染液对样本中的精子细胞进行染色。
采用本发明提供的技术方案，有如下优点1)使用3-氨基-9-乙基卡巴唑进行显色，底物性能稳定。与现有试剂相比，原底物快速红溶液极不稳定，2～8℃放置只能稳定1周的时间，而本方法中的3-氨基-9-乙基卡巴唑溶液2～8℃放置至少能稳定1年，利于储存，大大方便了使用；2)使用特制涂有染色窗的玻片，节省试剂、便于操作，适于批量检测；3)在白细胞染色后结果观察前对精子细胞染异色，使得白细胞与精子细胞颜色对比更加鲜明，结果读取更加容易。
说明书附图
图1是用本发明试剂的一种优选方案进行精液白细胞检测的结果照片。
具体实施方式下面对本发明作进一步的详细说明。
实施例一、一种精液白细胞群染色定量检测试剂，包括1、第一抗体鼠抗人CD45的IgG型单克隆抗体；2、第二抗体兔抗鼠IgG的IgG抗体；3、酶结合物鼠IgG抗原与辣根过氧化物酶(HRP)的复合物4、底物A3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)。
上述试剂中第一抗体用于与白细胞表面的CD45抗原结合，IgG-HRP复合物通过第二抗体与第一抗体结合，AEC用于与HRP反应完成最终的显色步骤。因此只要第一抗体中的提供抗体的动物与第二抗体中的被抗动物和酶结合物中的提供抗原的动物保持一致就可以了，可以是牛、羊、马等等。
实施例二、一种精液白细胞群染色定量检测试剂，包括1、第一抗体冻干粉含鼠抗人CD45的IgG型单克隆抗体的冻干粉；2、第二抗体冻干粉含兔抗鼠IgG的IgG抗体的冻干粉；3、酶结合物溶液含鼠IgG抗原与辣根过氧化物酶的复合物的Tris-HCl缓冲液；4、底物A溶液含3-氨基-9-乙基卡巴唑4～6％、二甲基甲酰胺2～3％的醋酸盐缓冲液；5、特制玻片(4孔/块)涂有耐酸、疏水性涂料印有直径为0.8mm的染色窗的玻片。
本实施例与实施例一相比，两种抗体采用冻干粉的形式，并将IgG-HRP复合物和AEC分别保存在相应的缓冲液中，更有利于试剂的长期储存。各缓冲液用于维持试剂的PH值，也可以使用其他的常用生物缓冲液来代替。底物A溶液中的少量二甲基甲酰胺是为了助溶，因为3-氨基-9-乙基卡巴唑较难溶于水，可以先在水中溶解二甲基甲酰胺后再加入3-氨基-9-乙基卡巴唑，有利于后者的溶解，此助溶剂不加也是可以的。此外，本试剂盒中还配备了特制玻片，这样，在进行检测染色时就可以在染色窗的固定区域(本例优选0.8mm，也可以是其他适宜值)中进行，既节省试剂又方便操作和观察结果。并且一块玻片上可设多个窗口(本例优选4个，也可以适当增加或减少)，适于批量检测。
实施例三、另一种精液白细胞群染色定量检测试剂，包括1、第一抗体冻干粉含鼠抗人CD45的IgG型单克隆抗体的冻干粉；2、第二抗体冻干粉含兔抗鼠IgG的IgG抗体的冻干粉；3、酶结合物含鼠IgG抗原与辣根过氧化物酶的复合物的Tris-HCl缓冲液；4、底物A含3-氨基-9-乙基卡巴唑4～6％、二甲基甲酰胺2～3％的醋酸盐缓冲液；5、特制玻片(4孔/块)涂有耐酸、疏水性涂料印有直径为0.8mm的染色窗的玻片。
还包括6、固定液含丙酮40～60％、甲醇40～60％、40％甲醛3～8％的混合液；7、缓冲液含二水氯化钙含量为0.015％、氯化钾含量为0.02％、六水氯化镁含量为0.015％、氯化钠含量为0.8％的磷酸盐缓冲液；8、浓缩组织洗涤液(20×)含氯化钠含量为0.6％、氯化钾含量为0.4％、硫柳汞含量为0.125％、吐温含量为1.5％的磷酸盐缓冲液；9、冻干粉溶解液含葡萄糖含量为1％、氯化钠含量为30mM、酪蛋白含量为0.2％的去离子水溶液；10、底物B含30％过氧化氢含量为10％的水溶液；11、苏木精染液含苏木素含量为0.5％、硫酸铝钾含量为10％、氧化汞含量为0.25％、乙醇含量为5％的水溶液。
本实施例与实施例二相比，增加了6～11共六种试剂单元，这些试剂单元是在进行精液白细胞检测中可能会使用到的各种常规试剂单元，为了本发明试剂在使用和检测时更加方便，因此可以在试剂中一并包含。由于这些是常规试剂单元，它们的组分选取和含量都是本领域技术人员能够根据实际情况进行适当调整和配置的，因此不改变其作用而进行的各种替换和调整均属于本发明的保护范围(各试剂单元的作用将在实施例五中进行详细说明)。
此外(1)本发明试剂的最佳保存温度为2～8℃，在室温下则试剂有效期缩短。
(2)基于应用需要，本发明试剂可以制成试剂盒的形式，各部分的具体备量可以是缓冲液4～6ml、固定液0.5～1.5ml、浓缩组织洗涤液(20×)1～1.5ml、第一抗体(冻干前)6～14ul、第二抗体(冻干前)6～14ul、冻干粉溶解液12～24ul、酶结合物6～14ul、底物A 12～18ul、底物B 0.12～0.18ul、苏木精染液50～150ul。
实施例四、一种制作实施例三中精液白细胞群染色定量检测试剂的方法，包括以下步骤，1、第一抗体冻干粉的制备1)抗体冻干基础液的制备准确称取葡萄糖0.2克，氨基己酸0.15克，叠氮钠0.125克置烧杯，搅拌溶于pH7.40.05M适量磷酸盐缓冲液内，用磷酸盐缓冲液定容至100毫升。用滤菌器滤过除菌，置4℃保存；该抗体冻干基础液用于稀释抗体，并使抗体在真空冷冻干燥过程中的效价不降低。
2)用抗体冻干基础液将抗人CD45单克隆抗体及抗IgG抗体稀释为各种浓度，与IgG-HRP复合物和AEC作交叉试验，根据最后显色及背景色的深浅确定出最佳稀释度，用抗体冻干基础液将抗人CD45单克隆抗体稀释为最佳稀释度，分装冻干后保存。
2、第二抗体冻干粉的制备根据上述交叉试验确定的最佳稀释度，用抗体冻干基础液将抗IgG抗体稀释至最佳稀释度，分装冻干后保存；3、酶结合物的制备1)制备HRP结合物稀释液①配制pH7.520mmol/L Tris-HCl。
②称取0.5克酪蛋白，加至1000毫升Tris-HCl缓冲液中，在磁力搅拌器上加热搅拌溶解。待其完全溶解后，加蒸馏水定容至1000毫升。
③称取1克牛血清白蛋白(BSA)、0.015克苋菜红(AMARANTH)溶于上述溶液中，滤过除菌，4℃保存；2)可按现有工艺方法制备IgG-HRP关联物，包括如下步骤①取4.5mg HRP溶于1ml 0.3mol/L，pH8.0NaHCO3，加入1.5％DNFB无水乙醇溶0.1ml，室温下轻微搅拌1小时。
②加1ml 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30分钟。
③加1ml 0.15mol/L乙二醇，室温下搅拌1小时，以终止氧化反应。
④装入透析袋，对0.01mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液1000ml，4℃透析过液，换液三次。
⑤于3ml醛化HRP溶液中加入含4.5mg鼠IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温避光轻搅拌2～3小时。
⑥加入4.5mg NaHB4，放入4℃过夜。
⑦装入透析袋，对0.01mol/L pH7.2PBS，4℃透析24小时。
⑧3000r/min离心30min，除去沉淀物。上清液通过Sephadex G-200凝胶柱层析，PBS洗脱。
⑨用HRP结合物稀释液稀释结合物，4℃保存；4、底物A的制备1)配制0.05M醋酸盐缓冲液(pH5.0)200毫升。
2)称取AEC 5毫克，溶入二甲基甲酰胺2500ul。用醋酸盐缓冲液将上液定容至100毫升。待其完全溶解后过滤。4℃保存；5、特制玻片的制作玻片上用耐酸、疏水性涂料印上直径为0.8mm的染色窗。
6、固定液的制备用量筒量取丙酮95ml、甲醇95ml、400g/l甲醛10ml，将上述液体倒在大烧杯内混匀。置室温保存。
7、缓冲液的制备1)用分析天平准确称量二水氯化钙0.15克，氯化钾0.20克，磷酸二氢钾0.2克，六水氯化镁0.15克，氯化钠8克，十二水磷酸氢二钠1.25克，依次搅拌溶解于800毫升蒸馏水内。
2)调pH至7.4，用蒸馏水定容至1000毫升。置4℃保存。
8、浓缩组织洗涤液(20×)的制备1)用分析天平称量氯化钠6克，磷酸氢二钾4克，十二水磷酸氢二钠58克，氯化钾4克，硫柳汞1.25克，吐温2010毫升，依次搅拌溶解于800毫升蒸馏水内。
2)调pH至7.4，用蒸馏水定容至1000毫升。置4℃保存。
9、冻干粉溶解液的制备1)称取葡萄糖10克，氯化钠30mM，酪蛋白2克，溶于800毫升蒸馏水中。
2)移入1000毫升装容量瓶内，用蒸馏水定容至1000毫升。置4℃保存。
10、底物B的制备取30％过氧化氢10毫升，用蒸馏水定容至100毫升。4℃保存。
11、苏木精染液的制备1)称取苏木素1.000克，溶于10毫升无水乙醇内；另称取硫酸铝钾20.0克，溶于200毫升蒸馏水内。
2)将上述两种液体混合后，加热煮沸，徐徐加入0.500克红色氧化汞，不断搅拌，5分钟后将溶液置冷水迅速冷却，冷却后过滤。置室温保存。
实施例五、一种使用实施例三所述的精液白细胞群染色定量检测试剂进行精液白细胞定量检测的方法，包括以下步骤，1、试剂准备1)第一抗体冻干粉、第二抗体冻干粉分别以冻干粉溶解液溶解30min，恢复至冻干前体积，备用。溶解后抗体4℃保存可用1年。
2)浓缩组织洗涤液，以蒸馏水20倍稀释(如取浓缩液5ml，加蒸馏水95ml)。
2、样本准备新鲜液化精液或-20℃贮存精液标本。
3、检测1)制作精液细胞涂片①将待检标本进行精子计数。
②1份液化的精液(约0.4ml)与5体积的缓冲液混合，室温500g离心5min，去上清液。按此步骤重复2次。所述缓冲液用于洗净细胞表面的粘稠物质。
③用缓冲液将细胞团重新悬至精液样品的原体积，然后以缓冲液将精子密度调整至40×106/ml左右。
④取此细胞悬液5ul，于干净玻片上，空气自然干燥。
⑤空气干燥的细胞在固定液中浸泡固定5min，所述固定液用于沉淀蛋白、保持蛋白的空间构像，使得不容易被洗脱。以吸管吸取组织洗涤液，轻轻冲洗玻片5次，然后置洗涤液中浸泡3min，甩去玻片表面水份，以吸水纸擦干非细胞区域液体(注意勿触及细胞区域)。
2)每份固定细胞上覆以10ul第一抗体，37℃湿盒内孵育30min，使得样本中白细胞上的CD45抗原与第一抗体充分反应。同上洗涤(用于洗去未反应物质)、吸干水份。
3)用10ul第二抗体覆盖细胞，37℃湿盒内孵育30min，使得已与CD45抗原结合的第一抗体与第二抗体充分反应。同上洗涤、吸干水份。
4)向每个样本中加入10ul酶标物，37℃湿盒内孵育30min，使得已与第一抗体结合的第二抗体与酶结合物充分反应。同上洗涤、吸干水份。
5)临用前配制显色底物(按底物A∶底物B＝100∶1体积比配制，所述底物B用作氧化剂，除了可以是前述双氧水以外也可以是过氧化脲等其他氧化剂)，每样本加入显色底物15ul，37℃湿盒内孵育20min，使得底物A充分反应、沉淀，以吸管吸取组织洗涤液，轻轻冲洗玻片5次，置组织洗涤液中浸泡5～10min，甩去玻片表面水份。
6)用苏木精染液复染30秒钟，组织洗涤液冲洗7次(每次1秒钟)，将玻片竖起晾干或吹干。
7)每样本滴加甘油封固液1滴，用于保护，覆以盖玻片。于显微镜油镜下观察结果，如图1所示(所述显微镜型号为DMLS2(生产厂家Leica)，图片拍摄使用Leica DFC480专业数码相机)。由图1可以看出，白细胞与其他细胞(包括大小近似的其它类型圆细胞)能够十分清晰的分辨，甚至白细胞碎片也能精确分辨出，检测结果清晰并易于判读。
四、结果计算光镜下至少计数200个精子，记录在计数精子过程中观察到的白细胞数(白细胞呈棕红色，其它类型圆细胞及精子染蓝色)。计算每100个精子视野中白细胞数n，代入下列公式计算精液白细胞数精液白细胞数/ml＝n÷100×精子计数/ml五、正常参考值＜1×106/ml(WHO)六、临床适用性用于男性白细胞精子症的诊断。
权利要求
1.一种精液白细胞群染色定量检测试剂，包括1)第一抗体A种动物抗人CD45的IgG型单克隆抗体；2)第二抗体B种动物抗A种动物IgG的IgG类抗体；3)酶结合物A种动物的IgG型抗体与辣根过氧化物酶复合物；4)底物A3-氨基-9-乙基卡巴唑。
2.根据权利要求1所述的精液白细胞群染色定量检测试剂，包括1)第一抗体冻干粉含A种动物抗人CD45的IgG型单克隆抗体的冻干粉；2)第二抗体冻干粉含B种动物抗A种动物IgG的IgG抗体的冻干粉；3)酶结合物溶液含A种动物的IgG与辣根过氧化物酶复合物的缓冲液；4)底物A溶液含3-氨基-9-乙基卡巴唑的醋酸盐缓冲液。
3.根据权利要求2所述的精液白细胞群染色定量检测试剂，其特征在于所述底物A溶液中含3-氨基-9-乙基卡巴唑4～6％、二甲基甲酰胺2～3％。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种精液白细胞群染色定量检测试剂，其特征在于所述A种动物为鼠，B种动物为兔。
5.一种精液白细胞群染色定量检测试剂盒，包括1)第一抗体A种动物抗人CD45的IgG型单克隆抗体；2)第二抗体B种动物抗A种动物IgG的IgG类抗体；3)酶结合物A种动物的IgG型抗体与辣根过氧化物酶复合物；4)底物A3-氨基-9-乙基卡巴唑。
6.根据权利要求5所述的精液白细胞群染色定量检测试剂盒，其特征在于还包括5)特制玻片涂有耐酸、疏水性涂料印有染色窗的玻片。
7.一种使用权利要求1所述精液白细胞群染色定量检测试剂进行精液白细胞定量检测的方法，包括以下步骤1)制作精液样本涂片，待其干燥后对细胞进行固定；2)在样本上覆以反应量的第一抗体，适温孵育使样本中白细胞上的CD45抗原与第一抗体充分反应，洗去未反应物质；3)再覆以反应量的第二抗体，适温孵育使已与CD45抗原结合的第一抗体与第二抗体充分反应，洗去未反应物质；4)再加入反应量的酶结合物，适温孵育使已与第一抗体结合的第二抗体与酶结合物充分反应，洗去未反应物质；5)再加入反应量的显色底物，所述显色底物含底物A与氧化剂，适温孵育使显色底物充分反应、沉淀，洗去未反应物质；6)观察记录检测结果。
8.一种使用权利要求2所述精液白细胞群染色定量检测试剂进行精液白细胞定量检测的方法，包括以下步骤1)制作精液样本涂片，待其干燥后对细胞进行固定；2)以含单糖0.9～1.1％、氯化钠25～35mM、酪蛋白0.15～0.25％的去离子水溶液复溶第一、第二抗体冻干粉；3)在样本上覆以反应量的复溶后的第一抗体冻干粉，适温孵育使样本中白细胞上的CD45抗原与第一抗体充分反应，洗去未反应物质；4)再覆以反应量的复溶后的第二抗体冻干粉，适温孵育使已与CD45抗原结合的第一抗体与第二抗体充分反应，洗去未反应物质；5)再加入含有反应量的酶结合物的酶结合物溶液，适温孵育使已与第一抗体结合的第二抗体与酶结合物充分反应，洗去未反应物质；6)再加入反应量的显色底物溶液，所述显色底物溶液含底物A溶液与氧化剂，适温孵育使显色底物充分反应、沉淀，洗去未反应物质；7)观察记录检测结果。
9.根据权利要求7或8所述的精液白细胞定量检测方法，其特征在于所述精液样本涂片以特制玻片制作，所述特制玻片为涂有耐酸、疏水性涂料印有染色窗的玻片。
10.根据权利要求7或8或9所述的精液白细胞定量检测方法，其特征在于在所述观察记录检测结果步骤之前，还用苏木精染液对样本中的精子细胞进行染色。
全文摘要
本发明公开了一种精液白细胞群染色定量检测试剂、试剂盒及其检测方法。所述精液白细胞群染色定量检测试剂，包括第一抗体A种动物抗人CD45的IgG型单克隆抗体；第二抗体B种动物抗A种动物IgG的IgG类抗体；酶结合物A种动物的IgG型抗体与辣根过氧化物酶复合物；底物A3－氨基－9－乙基卡巴唑。上述试剂可制成试剂盒的形式并可进一步包括特制玻片涂有耐酸、疏水性涂料印有染色窗的玻片。本发明并提供使用上述精液白细胞群染色定量检测试剂、试剂盒进行精液白细胞定量检测的方法。本发明使用3－氨基－9－乙基卡巴唑进行显色，与现有试剂相比大大提高了底物的稳定性，利于储存，方便使用；使用特制涂有染色窗的玻片，节省试剂、便于操作，适于批量检测。
文档编号G01N33/535GK1755369SQ20041004081
公开日2006年4月5日 申请日期2004年10月1日 优先权日2004年10月1日
发明者傅剑华, 刘瑜, 胡家纯, 何林, 何小红 申请人:深圳华康生物医学工程有限公司