专利名称：检测条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞增殖作用的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞增殖作用的方法。
背景技术：
支持细胞能够分泌免疫保护因子、多种生长因子和营养因子而倍受学者们关注，已有实验研究报道，睾丸的支持细胞承担了免疫豁免功能，共同移植支持细胞可延长同种异体移植物的存活时间，使睾丸支持细胞的功能研究扩展到了器官移植领域、并在临床上展现出良好的应用前景，有人将支持细胞与其它种类的细胞如大鼠胎脑多巴胺能神经元、猪胰腺细胞进行联合培养，以利于此种细胞的生长分化及增殖，还有人将支持细胞与其它种类细胞如牛的嗜铅细胞、猪的胰岛细胞进行联合移植来提高移植细胞的存活率及降低免疫排斥反应，鉴于支持细胞分泌多种因子及蛋白的功能，可以大量地应用于联合细胞培养或联合移植等实验当中去。除此之外，支持细胞与生精细胞共同构成睾丸的精曲小管，支持细胞不仅在结构上为生精细胞的分化成熟提供支架，供给生精过程所需的能量及营养物质，同时可分泌如转运蛋白类、调节蛋白类、生长因子类、类固醇类等数十种物质参与生精细胞的分化成熟，具有精细的协调作用，保证精子发生的正常有序进行，因此有人称其为生精细胞的“保姆细胞”(nursing cell)。支持细胞能合成一些精子的结构蛋白，该蛋白使精子表面密布较多的负电荷，可能有助于精子在女性生殖管道内受精。有研究发现，支持细胞功能的减退或数量的减少均可导致精子生成减少，相对于其它种属，人类不论是青壮年还是老年，其每一个支持细胞支持的生精细胞数是减少的，说明人类支持细胞的功能是减退的。
目前还没有紫菜多糖对大鼠睾丸支持细胞的作用的相关报导，我们研究发现，条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞的增殖作用，该作用可能对于支持细胞与其他功能细胞的联合移植以及提高精子质量及男性不育症的治疗有着重大的指导意义，可能开辟新的途径。
发明内容
本发明的目的是要提供一种检测条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞增殖作用的方法，由此，增加了条斑紫菜粗多糖的应用范围，并也拓展了其应用前景。
为了实现上述的目的本发明是这样实现的本发明的检测条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞增殖作用的方法包括对大鼠睾丸支持细胞的原代培养和用MTT法测定大鼠睾丸支持细胞的存活率，其实现步骤如下首先进行对大鼠睾丸支持细胞的原代培养，用动物专用砸刀通过断头法处死一只雄性SD大鼠，摘取带被膜的睾丸组织，然后，在细胞室内实施如下无菌操作，用剪刀在睾丸包皮上剪开长约1cm的切口，用镊子轻轻将皮内部的睾丸挤出并去除血管，这样可以得到去除大部分血管的睾丸组织，接着将睾丸组织放在消毒过的玻璃平板上，用滴管吸去少量的预冷(在4℃保存)的生理盐水(无Ca2+，Mg2+)，反复冲洗睾丸组织2-3次，接着用剪刀将睾丸组织剪成约2mm小块，用预冷的生理盐水反复冲洗(约5ml)，将组织悬液移入小三角烧瓶内，吸去生理盐水，接着往三角烧瓶中加入5ml 0.1mg/ml胶原酶消化液，将三角烧瓶放入恒温水浴振荡器中，维持32℃，转速135rpm，水浴振荡55min，接着用吸管小心吸出三角烧瓶中明显的团块即去除间质细胞团，用生理盐水清洗三次烧瓶中分散的小颗粒物质，获得纯化的管状组织后，加入0.01％胰蛋白酶5ml，作用组织15-20min，接着用吸管小心去除三角烧瓶中较明显的团块即肌样细胞的团块，获得较纯的管状片段后，将三角烧瓶中的管状片段用滴管移至放在玻璃平板上的200目筛网，过滤，接着用生理盐水反复隔筛冲洗管状片段，收集滤液，将其移入15ml无菌离心管中，4℃离心，转速800rpm，离心10min，弃去上清液，沉淀为支持细胞，再往离心管中加入适量生理盐水，轻轻吹打细胞使其重悬，离心(条件同前)收集支持细胞，接着往离心管中加入含有15mmolHepes的DMEM和Ham’s F12(1∶1)的混合培养液，轻轻重悬细胞，最后将细胞悬液移入细胞培养瓶或96孔细胞培养板中，培养细胞(条件37℃，0.5％CO2细胞孵箱)，上述所使用的器具都要进行高压灭菌消毒，最后用MTT法测定大鼠睾丸支持细胞的存活率，将原代培养的支持细胞直接传入96孔细胞培养板中，每孔细胞数为2.0×104个(2.0×105个/ml，100μl细胞液/孔)，培养过夜，接着加样设置，在96孔细胞培养板中的设置，0为空白对照组；1为FBS组(胎牛血清)；2为阳性对照组；A1～A4为不同浓度粗多糖组，其中分别设置为0.05mg/ml、0.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml；条斑紫菜粗多糖用生理盐水配成10mg/ml，微孔滤器过滤除菌，4℃保存，临用前以生理盐水稀释至所需浓度，按照每组六个复孔，每孔10μl的方式加入96孔板，防止边缘效应，在四周孔内加入生理盐水，多余孔内也加入生理盐水，将加好样的96孔板放入孵箱中培养细胞3天后，小心吸去培养基，每孔加入100μl的生理盐水和10μl的MTT(5mg/ml)，37℃培养4h，观察到96孔板的每个小孔底部有紫色结晶沉淀，小心吸去MTT后，每孔加入100μl的10％SDS，37℃过夜彻底溶解沉淀，次日，用酶标仪测定每孔的吸光度即OD值，波长为494nm，然后计算支持细胞存活率，并进行统计学分析，得到检测结果条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞有促进其生长的作用，并且随着条斑紫菜粗多糖浓度的增大，这种促进作用也越加明显，尤其是当多糖浓度为10mg/ml时，这种促进作用极为明显，与此同时，其结果还表明，条斑紫菜粗多糖的这种促进作用比FBS组和阳性对照组的作用要显著得多。
由于本发明提出了一种检测条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞增殖作用的方法，且主要通过MTT法检测粗多糖对原代培养的大鼠睾丸支持细胞的增殖率，检测的结果表明，随着粗多糖浓度的升高，其对支持细胞的增殖作用越明显，该活性增加了条斑紫菜粗多糖的应用范围，拓展了其应用前景。
图1为96孔细胞培养板中加样设置示意图。
图2为MTT法检测大鼠睾丸支持细胞活性图表。
图3为条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞有促进其生长作用的示意图。
具体实施例方式以下将结合附图对本发明的检测条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞增殖作用的方法作进一步的详细描述。
本发明的方法实施步骤如下(一)大鼠睾丸支持细胞的原代培养1、用动物专用砸刀由断头法处死一只雄性SD大鼠，摘取带被膜的睾丸组织；2、用剪刀在睾丸包皮上剪开长约1cm的切口，用镊子轻轻将皮内部的睾丸挤出并去除血管，这样可以得到去除大部分血管的睾丸组织；3、将睾丸组织放在消毒过的玻璃平板上，用滴管吸去少量的预冷(在4℃保存)的生理盐水(无Ca2+，Mg2+)，反复冲洗睾丸组织2～3次；4、用剪刀将睾丸组织剪成约2mm小块，用预冷的生理盐水反复冲洗(约5ml)，将组织悬液移入小三角烧瓶内，吸去生理盐水；5、往三角烧瓶中加入5ml 0.1mg/ml胶原酶消化液，将三角烧瓶放入恒温水浴振荡器中，32℃，转速135rpm，水浴振荡55min；
6、用吸管小心吸出三角烧瓶中明显的团块即去除间质细胞团，用生理盐水清洗三次烧瓶中分散的小颗粒物质，获得纯化的管状组织后，加入0.01％胰蛋白酶5ml，作用组织15-20min；7、用吸管小心去除三角烧瓶中较明显的团块即肌样细胞的团块，获得较纯的管状片段后，将三角烧瓶中的管状片段用滴管移至放在玻璃平板上的200目筛网，过滤；8、用生理盐水反复隔筛冲洗管状片段，收集滤液，将其移入15ml无菌离心管中，4℃离心，转速800rpm，离心10min，弃去上清液，沉淀为支持细胞。再往离心管中加入适量生理盐水，轻轻吹打细胞使其重悬，离心(条件同前)收集支持细胞；9、往离心管中加入含有15mmolHepes的DMEM和Ham’s F12(1∶1)的混合培养液，轻轻重悬细胞，最后将细胞悬液移入细胞培养瓶或96孔细胞培养板中，培养细胞(条件37℃，0.5％CO2细胞孵箱)；上述方法均在细胞室内无菌操作，所使用的器具都要进行高压灭菌消毒，(二)MTT法测定大鼠睾丸支持细胞的存活率1、将原代培养的支持细胞直接传入96孔细胞培养板中，每孔细胞数为2.0×104个(2.0×105个/ml，100μl细胞液/孔)，培养过夜；2、加样设置，从图1所示，96孔板中，0为空白对照组；1为FBS组(胎牛血清)；2为阳性对照组；A1～A4为不同浓度粗多糖组，分别设置为0.05mg/ml、0.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml；
3、条斑紫菜粗多糖用生理盐水配成10mg/ml，微孔滤器过滤除菌，4℃保存，临用前以生理盐水稀释至所需浓度；4、按照每组六个复孔，每孔10μl的方式加入96孔板，防止边缘效应，在四周孔内加入生理盐水，多余孔内也加入生理盐水；5、将加好样的96孔板放入孵箱中培养细胞3天后，小心吸去培养基，每孔加入100μl的生理盐水和10μl的MTT(5mg/ml)，37℃培养4h；6、观察到96孔板的每个小孔底部有紫色结晶沉淀，小心吸去MTT后，每孔加入100μl的10％SDS，37℃过夜彻底溶解沉淀；7、次日，用酶标仪测定每孔的吸光度即OD值(波长494nm)；8、计算细胞存活率支持细胞存活率＝(加样组平均OD值/生理盐水空白对照组平均OD值)×100％，生理盐水空白对照组平均OD值设定为100％；按照不同浓度的百分比作图；9、进行统计学分析；结果从图3中可知条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞有促进其生长的作用，并且随着条斑紫菜粗多糖浓度的增大，这种促进作用也越加明显(P＜0.05)，尤其是当多糖浓度为10mg/ml时，这种促进作用极为明显(P＜0.01)，与此同时，实验结果还表明，条斑紫菜粗多糖的这种促进作用比FBS组和阳性对照组的作用要显著得多，另外，从图2的MTT法检测大鼠睾丸支持细胞活性的图表中所示也足以显现。
权利要求
一种检测条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞增殖作用的方法，其特征在于(一)大鼠睾丸支持细胞的原代培养1、用动物专用砸刀通过断头法处死一只雄性SD大鼠，摘取带被膜的睾丸组织；2、在细胞室内无菌操作，用剪刀在睾丸包皮上剪开长约1cm的切口，用镊子轻轻将皮内部的睾丸挤出并去除血管，这样可以得到去除大部分血管的睾丸组织；3、在细胞室内无菌操作，将丸组织放在消毒过的玻璃平板上，用滴管吸去少量的在4℃保存过的预冷生理盐水(无Ca2+，Mg2+)，反复冲洗睾丸组织2～3次；4、在细胞室内无菌操作，用剪刀将睾丸组织剪成约2mm小块，用在4℃保存过的预冷的约5ml生理盐水反复冲洗，将组织悬液移入小三角烧瓶内，吸去生理盐水；5、在细胞室内无菌操作，往三角烧瓶中加入5ml的0.1mg/ml胶原酶消化液，将三角烧瓶放入恒温水浴振荡器中，温度为32℃，转速为135rpm，水浴振荡55min；6、在细胞室内无菌操作，用吸管小心吸出三角烧瓶中明显的团块即去除间质细胞团，用生理盐水清洗三次烧瓶中分散的小颗粒物质，获得纯化的管状组织后，加入0.01％胰蛋白酶5ml，作用组织15-20min；7、在细胞室内无菌操作，用吸管小心去除三角烧瓶中较明显的团块即肌样细胞的团块，获得较纯的管状片段后，将三角烧瓶中的管状片段用滴管移至放在玻璃平板上的200目筛网，过滤；8、在细胞室内无菌操作，用生理盐水反复隔筛冲洗管状片段，收集滤液，将其移入15ml无菌离心管中，温度控制在4℃时进行离心，转速为800rpm，离心时间为10min，弃去上清液，沉淀为支持细胞，再往离心管中加入适量生理盐水，轻轻吹打细胞使其重悬，再离心，离心温度控制在4℃，转速为800rpm，离心时间为10min，收集支持细胞；9、在细胞室内无菌操作，往离心管中加入含有15mm olHepes的DMEM和Ham’s F12(1∶1)的混合培养液，轻轻重悬细胞，最后将细胞悬液移入细胞培养瓶或96孔细胞培养板中，然后，放入温度为37℃的含有0.5％CO2的细胞孵箱中，培养细胞；上述所使用的器具都要进行高压灭菌消毒；(二)MTT法测定大鼠睾丸支持细胞的存活率1、将原代培养的支持细胞直接传入96孔细胞培养板中，每孔细胞数为2.0×104个(2.0×105个/ml，100μl细胞液/孔)，培养过夜；2、加样设置如下在96孔板中0为空白对照组、1为FBS组(胎牛血清)、2为阳性对照组、A1～A4为不同浓度粗多糖组，分别设置为0.05mg/ml、0.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml；3、条斑紫菜粗多糖用生理盐水配成10mg/ml，微孔滤器过滤除菌，以温度为4℃保存，临用前以生理盐水稀释至所需浓度；4、按照每组六个复孔，每孔10μl的方式加入96孔板，为防止边缘效应，在四周孔内加入生理盐水，多余孔内也加入生理盐水；5、将加好样的96孔板放入孵箱中培养细胞3天后，小心吸去培养基，每孔加入100μl的生理盐水和10μl的MTT(5mg/ml)，在环境温度为37℃中培养4h；6、观察到96孔板的每个小孔底部有紫色结晶沉淀，小心吸去MTT后，每孔加入100μl的10％SDS，保持37℃的温度，过夜彻底溶解沉淀；7、次日，用酶标仪测定每孔的吸光度即OD值，波长为494nm；8、计算细胞存活率支持细胞存活率＝(加样组平均OD值/生理盐水空白对照组平均OD值)×100％，生理盐水空白对照组平均OD值设定为100％；按照不同浓度的百分比作图；9、进行统计学分析结果条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞有促进其生长的作用，并且随着条斑紫菜粗多糖浓度的增大，这种促进作用也越加明显(P＜0.05)，尤其是当多糖浓度为10mg/ml时，这种促进作用极为明显(P＜0.01)，与此同时，实验结果还表明，条斑紫菜粗多糖的这种促进作用比FBS组和阳性对照组的作用要显著得多。
全文摘要
一种检测条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞增殖作用的方法。目前还没有紫菜多糖对大鼠睾丸支持细胞的作用的相关报导，我们研究发现，条斑紫菜粗多糖对大鼠睾丸支持细胞的增殖作用。本发明主要通过MTT法检测粗多糖对原代培养的大鼠睾丸支持细胞的增殖率，检测的结果表明，随着粗多糖浓度的升高，其对支持细胞的增殖作用越明显，该活性增加了条斑紫菜粗多糖的应用范围，拓展了其应用前景。该作用可能对于支持细胞与其他功能细胞的联合移植以及提高精子质量及男性不育症的治疗有着重大的指导意义，可能开辟新的途径。
文档编号G01N33/48GK1920051SQ200510029058
公开日2007年2月28日 申请日期2005年8月24日 优先权日2005年8月24日
发明者郭婷婷, 何培民 申请人:上海水产大学