一种抗过敏紫菜多糖的制备方法
【专利摘要】一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，涉及一种紫菜多糖。提供工艺简单、操作性强的一种抗过敏紫菜多糖的制备方法。1）将紫菜烘干，再粉碎成粉末；2）将步骤1）得到的紫菜粉末溶于水中，在80～100℃水浴提取，组织捣碎，离心，获取上清；3）将步骤2）得到的水提液浓缩，加入乙醇沉淀，将沉淀物洗涤后复溶于水中，上样于阴离子交换层析柱，测定洗脱液的含糖量，收集A630>0.5的洗脱液；4）将步骤3）收集的洗脱液经蒸馏水透析，真空冷冻干燥，得抗过敏紫菜多糖。
【专利说明】一种抗过敏紫菜多糖的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种紫菜多糖，尤其是涉及一种抗过敏紫菜多糖的制备方法。
【背景技术】
[0002]食物过敏是过敏人群对某些食物蛋白产生的不良免疫反应，通常会导致一系列症状，比如哮喘、荨麻疹、腹泻等，严重影响过敏人群的生活质量，甚至危及生命安全。美国流行病学调查显示，在西方国家有8%的儿童以及3%_4%的成年人患有食物过敏性疾病，并且患病率仍然呈上升趋势(Scott HS, et al.Food allergy [J].The Journal ofAllergy and Clinical Immunology.2010，125 (2): 116-125)。我国流行病学调查显不，婴幼儿食物过敏检出率约为7.0%~9.2%(陈静.婴幼儿食物过敏流行病学调查[D].重庆医科大学.2010, 2-3)。过敏时，过敏患者的辅助性T细胞的免疫功能会向Th2型转化，从而分泌更多的Th2型细胞因子白细胞介素4(Interleukin4，IL-4)，并且导致血清免疫球蛋白 E(Immune globulin E, IgE)的上升(Morita R, et al.Human blood CXCR5+CD4+Tcells are counterparts of T follicular cells and contain specific subsets thatdifferentially support antibody secretion[J].Immunity.2011，34:108 - 121)。
[0003]食物过敏已经成为重要的公共健康问题，日益受到重视和关注，尤其是现代化社会的进步伴随着饮食的改变，被认为与近年来逐渐增加的食物过敏性疾病关系密切。传统的药物治疗不能从根本上消除食物过敏症状，并且会产生耐药性和副作用。国内外研究结果显示，大量的炸油或不当脂肪酸的饮食摄取，可能是影响免疫调节倾向过敏反应的重要因素，而海藻类和蔬果类食品的摄取有助于改善过敏反应。传统中医药典籍及科学文献也记载海藻具有改善免疫及消化的功效。因此，从海藻类食物中提取天然抗过敏活性成分，研究其对免疫系统的调节作用，并开发出新型抗过敏保健食品或药源制品，将成为食物过敏性疾病预防和治疗的必然趋势。
[0004] 紫菜在我国南北方海域均有大量分布，为我国重要的人工养殖经济海藻，目前除了作为普通海洋食品外，还是生产琼胶等化工、医药的原料。多糖是紫菜的主要组成成分，具有多种生物活性和药用价值，逐渐成为海洋生物医药界的研究热点。目前国外文献报道海苔片中提取的紫菜多糖具有抑制接触性超敏反应的功效(Ishihara K, etal.1nhibitory effect of porphyran, prepared from dried “Nori，，，on contacthypersensitivity in mice [J].Bioscience, biotechnology, and biochemistry.2005,69(10):1824-1830);褐藻酸具有抗过敏和抑制炎症细胞因子的作用(Jeong HJj etal.Alginic acid has ant1-anaphylactic effects and inhibits inflammatorycytokine expression via suppression of nuclear factor-κB activation[J].Clinical and Experimental Allergy.2006，36 (6): 785-794);褐藻中的岩藻聚糖能够抑制卵清蛋白引起的过敏反应(Yanase Y，et al.Peritoneal injection of fucoidansuppresses the increase of plasma IgE induced by OVA-sensitization [J].Biochemical and biophysical research communications.2009，387 (3): 435-439)。国内文献报道，紫菜多糖具有抗氧化(钱晓婕，等.坛紫菜中藻胆蛋白的提取及其抗氧化活性研究.中国海洋药物杂志.2008，27 (2):42-45)、抗疲劳(赵婷婷，等.不同分子量坛紫菜多糖的制备及抗衰老活性研究.北京:中国科学院海洋研究所.2007:51-54)和免疫调节(李胜军.紫菜多糖对免疫低功小鼠的免疫调节作用.北京:中国医科大学.2005:14-30)等功效，所以紫菜多糖具有多种显著的生物活性，而关于紫菜多糖抗过敏活性方面的功效鲜有报道，开发抗过敏紫菜多糖对于充分利用海洋资源、开发功能性食品等具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供工艺简单、操作性强的一种抗过敏紫菜多糖的制备方法。
[0006]本发明的具体步骤如下:
[0007]I)将紫菜烘干，再粉碎成粉末；
[0008]2)将步骤I)得到的紫菜粉末溶于水中，在80~100°C水浴提取，组织捣碎，离心，获取上清；
[0009]3)将步骤2)得到的水提液浓缩，加入乙醇沉淀，将沉淀物洗涤后复溶于水中，上样于阴离子交换层析柱，测定洗脱液的含糖量，收集A630>0.5的洗脱液；
[0010]4)将步骤3)收集的洗脱液经蒸馏水透析，真空冷冻干燥，得抗过敏紫菜多糖。
[0011]在步骤I)中，所述紫菜可采用食用红藻紫菜；所述烘干的温度可为40~50°C。
[0012]在步骤2)中，所述紫菜粉末与水的配比可为1: (30~50)，其中紫菜粉末以质量计算，水以体积计算；所述水浴提取的时间可为3~5h，组织捣碎的时间可为3~5min ;所述水可采用蒸馏水。
[0013]在步骤3)中，所述浓缩可采用旋转蒸发仪将水提液浓缩为原体积的25%~50%，所述加入乙醇沉淀的条件是加入2~4倍体积的95%乙醇，所述洗涤可采用无水乙醇洗涤沉淀2~4次；所述水可采用蒸馏水。
[0014]在步骤4)中，所述透析的时间可为48~72h。
[0015]本发明以食用紫菜为原材料，通过水提、组织捣碎提取、低压浓缩、醇沉、离子柱流洗除杂、透析等方法，制备得到具有抗过敏活性的高纯度紫菜多糖。
[0016]与现有的紫菜多糖制备方法相比，本发明具有以下突出优点:
[0017]本发明的全部制备过程中，所有操作都可以在常温下进行，制备获得的紫菜多糖纯度可达到75%~80%，经实验证实具有抗食物过敏活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本发明实施例1中紫菜多糖DEAE-CellulOSe52柱层析纯化图谱。
[0019]图2为本发明实施例2中紫菜多糖DEAE-CellulOSe52柱层析纯化图谱。
[0020]图3为本发明实施例1中分别纯化的紫菜多糖。
[0021]图4为本发明实施例2中分别纯化的紫菜多糖。
[0022]图5为小鼠过敏模型致敏阶段的特异性IgE水平。
[0023]图6为小鼠血清抗体IgGl/IgG2a比率。
[0024]图7为小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IFN- Y的蛋白水平检测结果。
[0025]图8为小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IL-4的蛋白水平检测结果。[0026]图9为小鼠脾脏淋巴细胞中IFN- Y基因的相对表达量检测结果。[0027]图10为小鼠脾脏淋巴细胞中IL-4基因的相对表达量检测结果。【具体实施方式】[0028]实施例1.坛紫菜饼中多糖的制备方法，包括以下步骤:[0029](I)紫菜饼的前处理:选用市售的坛紫菜饼为原料；[0030](2)烘干和粉碎:将坛紫菜饼放置于40°C烘箱中烘干，用粉碎机粉碎成粉末状；[0031](3)热水提取:称重坛紫菜粉并溶于蒸馏水中，固液比(W: V)为1: 40，100°C水浴提取4h；[0032](4)组织捣碎3min，离心后过滤获取上清；[0033](5)低压浓缩:采用旋转蒸发仪(60°C，真空度0.09MPa)浓缩上清液为原体积1/3；[0034](6)乙醇沉淀:加入4倍体积95%乙醇沉淀，静置过夜，无水乙醇洗涤沉淀3次，经絹布过滤获得沉淀，真空冷冻干燥；[0035](7)将沉淀复溶于蒸馏水至溶度为20mg/mL，上样于DEAE-cellulOSe52层析柱，先用蒸懼水流洗以除去蛋白、色素等杂质，接着采用2M NaCl洗脱,流速控制在0.5mL/min。蒽酮硫酸法测定洗脱液含糖量，获得洗脱曲线(图1)，收集A630>0.5的洗脱液，蒸馏水透析48h，将透析液进行冷冻干燥从而获得高纯度紫菜多糖(图3)。[0036]实施例2.新鲜坛紫菜多糖的制备方法，与实施例1有所不同，具体步骤如下:[0037](I)新鲜坛紫菜的前处理:选用新鲜坛紫菜为原料，要求无污染、无异味。用清水洗净紫菜外表所附的泥沙和污物；[0038](2)烘干和粉碎:将清洗干净的坛紫菜放于50°C烘箱中干燥，用粉碎机粉碎成粉末状；
[0039](3)热水提取:称重坛紫菜粉并溶于蒸馏水中，固液比(W: V)为1: 30，90°C水浴提取5h ；
[0040](4)组织捣碎5min，离心后过滤获取上清；
[0041](5)低压浓缩:采用旋转蒸发仪(60°C，真空度0.09MPa)浓缩上清液为原体积1/2 ；
[0042](6)加入3倍体积95%乙醇沉淀，静置过夜，无水乙醇洗涤沉淀4次，经絹布过滤获得沉淀，真空冷冻干燥；
[0043](7)沉淀复溶于蒸馏水至溶度为20mg/mL，上样于DEAE-CellulOSe52层析柱，先用蒸懼水流洗以除去蛋白、色素等杂质，接着采用2M NaCl洗脱,流速控制在0.5mL/min,蒽酮硫酸法测定洗脱液含糖量，获得洗脱曲线(图2)，收集A630X).5的洗脱液，蒸馏水透析72h，将透析液进行冷冻干燥从而获得高纯度紫菜多糖(图4)。
[0044]实施例3.紫菜多糖抗过敏性质分析
[0045](I)动物实验方法。采用无特定病原体(Specific pathogen free, SPF)级BALB/c小鼠，以甲壳类动物主要过敏原原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)敏化小鼠，建立过敏动物模型。实验分为磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)控制组、TM致敏组、紫菜多糖组，每组6只小鼠。在7、21天用TM致敏小鼠(PBS控制组注射PBS);从O天起对紫菜多糖组小鼠每周注射3次紫菜多糖(PBS控制组、TM致敏组注射PBS)，第22天取血并利用间接性ELISA的方法检测小鼠血清抗体IgE、IgGl和IgG2a水平。结果显示，紫菜多糖能够明显降低致敏小鼠血清中IgE含量(图5)和降低IgGl/IgG2a比率(图6)。 [0046](2)细胞实验方法。取TM致敏组BALB/c小鼠脾脏，分离淋巴细胞。利用PBS、TM、TM+紫菜多糖刺激培养72h，离心获得细胞上清液，检测各组过敏相关细胞因子IL-4和Y干扰素(Interferon gama, IFN- Y )蛋白表达量。结果显示，紫菜多糖能够显著促进Thl细胞因子IFN-Y的蛋白表达水平(图7)，显著抑制Th2细胞因子IL-4(图8)的蛋白表达水平；取TM致敏组BALB/c小鼠脾脏，分离淋巴细胞。利用PBS、TM、TM+紫菜多糖刺激培养72h，离心获得细胞沉淀，分离提取RNA并经反转录得到cDNA，利用荧光定量PCR技术检测以上两种细胞因子的基因表达量。结果显示，紫菜多糖能够增加Thl细胞因子IFN-Y的基因表达量(图9)，降低Th2细胞因子IL-4的基因表达量(图10)。
【权利要求】
1.一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，其特征在于其具体步骤如下: 1)将紫菜烘干，再粉碎成粉末； 2)将步骤I)得到的紫菜粉末溶于水中，在80~100°C水浴提取，组织捣碎，离心，获取上清； 3)将步骤2)得到的水提液浓缩，加入乙醇沉淀，将沉淀物洗涤后复溶于水中，上样于阴离子交换层析柱，测定洗脱液的含糖量，收集A630>0.5的洗脱液； 4)将步骤3)收集的洗脱液经蒸馏水透析，真空冷冻干燥，得抗过敏紫菜多糖。
2.如权利要求1所述一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述紫菜采用食用红藻紫菜。
3.如权利要求1所述一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述烘干的温度为40~50°C。
4.如权利要求1所述一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述紫菜粉末与水的配比为1: (30~50)，其中紫菜粉末以质量计算，水以体积计算。
5.如权利要求1所述一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述水浴提取的时间为3~5h,组织捣碎的时间为3~5min。
6.如权利要求1所述一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述浓缩是采用旋转蒸发仪将水提液浓缩为原体积的25%~50%。
7.如权利要求1所述一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述加入乙醇沉淀的条件是加入2~4倍体积的95%乙醇。
8.如权利要求1所述一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述洗涤可采用无水乙醇洗涤沉淀2~4次。
9.如权利要求1所述一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，其特征在于在步骤2)和步骤3)中，所述水采用蒸馏水。
10.如权利要求1所述一种抗过敏紫菜多糖的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述透析的时间为48~72h。
【文档编号】C08B37/00GK103467616SQ201310424569
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】刘光明, 时超岚, 曹敏杰 申请人:集美大学