专利名称：用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法
技术领域：
本发明涉及一种用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法，确切地说，涉及一种用PVP/CdS量子点修饰电极作为蛋白质高效液相色谱(HPLC)-电化学检测器(ECD)体系中的ECD的电极，实现蛋白质分离检测的方法，属于纳米修饰电极和生物检测的技术领域。
背景技术：
蛋白质是一种信息大分子，在生命过程中起关键作用。人类基因组序列提前完成后，蛋白质组学研究引起了生命科学工作者的极大关注。寻找快速高效的蛋白质分离与检测手段成为人们关注的热点。
HPLC是蛋白质分离中最重要的手段之一，常与HPLC联用的蛋白质检测方法为紫外分光光度法，它的理论基础是朗伯比尔定律。该检测方法具有普遍、通用的优点，但选择性较差、灵敏度较低。与紫外检测器相比，ECD具有更加完善的灵敏度和检测限，克服了光学检测光程短的缺点，具有死体积小、响应速度快、方便灵活等优点，而且仪器的制造成本也低。传统的HPLC-ECD体系中的ECD通常是薄层ECD，如图3所示。薄层ECD含工作电极1、对电极2、参比电极3、薄层电解池4、电极座5、进液孔6、出液孔7、工作电极座8和套管10。工作电极1是玻碳电极。对电极2是不锈钢电极。对电极2上有进液孔6和出液孔7。参比电极3是Ag/AgCl电极。工作电极1嵌在工作电极座8中。对电极2固定在电极座5上。参比电极3固定在套管10中。套管10嵌在电极座5中。薄层电解池4是开在聚四氟乙烯薄膜上的圆孔。工作电极座8以将薄层电解池4夹在工作电极1与对电极2之间和以工作电极1与对电极2分居薄层电解池4两边的方式固定在电极座5上。所述的薄层ECD与HPLC组成的HPLC-ECD体系已成功地应用于对儿茶酚胺及其代谢产物如多巴胺、去甲肾上腺素等神经递质，电活性氨基酸如半胱氨酸、谷胱甘肽等生物活性小分子的检测，但是至今尚未见有所述的薄层ECD应用于HPLC-ECD体系实现对蛋白质分离检测的报道。主要原因是由于蛋白质庞大的三维空间结构使其电活性中心被包埋在多肽链中，而且蛋白质在玻碳电极表面的吸附变性会引起电极表面的钝化，所以蛋白质在玻碳电极上的电子转移速度很慢，不会产生有效的电流响应，使玻碳电极在蛋白质的直接电化学研究的应用受到限制。
量子点(quantum dot，QD)是显示量子尺寸效应的半导体纳米晶体，其尺寸小于其相应体相半导体的波尔直径，通常在2～20nm。量子点随着晶体尺寸的减小，半导体能级愈来愈分离，有效带隙增加，可以获得独特的光学和电学性质。这种独特的电学性质可望用来制作量子点修饰电极，实现对蛋白质，如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素c等在电极上的直接电化学检测。本发明人曾将量子点应用于化学修饰电极，制得PVP/CdS量子点修饰电极，实现对生物分子的直接电化学检测，并申请了发明名称和申请号分别为 “PVP/CdS量子点修饰电极及其制备方法”和“200510027143.2”的中国发明专利。
发明内容
本发明要解决的技术问题是推出一种用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法，即PVP/CdS量子点修饰电极在蛋白质高效液相色谱分离电化学检测方面的应用方法。该方法有灵敏度高、稳定性好、成本低廉、能实现对蛋白质的电化学检测的优点。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是所述的方法需在含蛋白质色谱柱的、HPLC与工作电极1为PVP/CdS量子点修饰电极的ECD组成的HPLC-ECD体系内实施，用HPLC技术分离蛋白质，HPLC泵驱动流经蛋白质色谱柱的流动相和待测液直接进入ECD，用工作电极1，即PVP/CdS量子点修饰电极对分离的蛋白质进行电化学检测。现对所述的HPLC-ECD体系简要介绍如下。
如图4所示，本发明采用的HPLC-ECD体系包括分离和检测两大部分。分离部分含流动相贮液瓶、HPLC泵、进样阀和蛋白质色谱柱。各部件由色谱体系专用的Peak管连接成为流动相的流动通道。检测部分含ECD、电化学工作站、数据记录仪和废液缸。ECD是薄层ECD；电化学工作站是CHI832电化学分析仪；数据记录仪是计算机。电化学工作站与ECD和数据记录仪之间分别由数据线连接；ECD经Peak管与蛋白质色谱柱和废液缸连接蛋白质色谱柱出液端通过Peak管与ECD的进液孔6连接，ECD的出液孔7通过Peak管与废液缸连接。特别要指出的是，本发明所采用的薄层ECD由图3所示的传统薄层ECD改良而成用PVP/CdS量子点修饰电极代替传统薄层ECD的玻碳电极作工作电极1，换句话说，本发明所采用的薄层ECD以PVP/CdS量子点修饰电极为工作电极1，分别以Ag/AgCl电极和不锈钢电极为参比电极3和对电极2，工作电极1、对电极2和参比电极3组成本发明的薄层ECD的三电极体系。带有圆孔的聚四氟乙烯薄膜夹在工作电极1与对电极2之间，聚四氟乙烯薄膜的圆孔部分作薄层电解池4。在对电极2上有进液孔6和出液孔7。PVP/CdS量子点修饰电极具有以下结构以已有的玻碳电极为基体电极，在基体电极的表面12上依次沉积有PVP/CdS量子点复合材料膜13和Nafion膜114。
现结合附图详细说明本发明的技术方案。
一种用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法，其特征在于，需在含蛋白质色谱柱的、HPLC与工作电极1为PVP/CdS量子点修饰电极的ECD组成的HPLC-ECD体系内实施，其操作步骤如下第一步流动相溶液的配置流动相A液为含0.1％三氟乙酸，即TFA的乙腈，B液为含0.1％TFA的水，将配好的流动相溶液分别放入流动相贮液瓶A和B中；第二步HPLC-ECD体系的运行在选定的蛋白质色谱柱条件下，启动HPLC泵，流动相的流速在1.0～5.0mL/min的范围内调节，流动相的梯度在20％～60％A梯度范围内以2％/min～10％/min的速度变化，通过计算机启动并控制电化学工作站在ECD上施加电压为-0.2～-0.4V的工作电位，计算机实时记录流动相在ECD上的电流响应情况，预运行10～15min后体系达到稳定状态流动相流速恒定、蛋白质色谱柱柱压稳定、薄层ECD电化学响应i-t基线稳定，所述的电化学工作站是CHI832电化学分析仪；第三步蛋白质的分离检测的定标用多种蛋白质以每次一种的方式对所述的HPLC-ECD体系进行定标，分别配置一种蛋白质一系列标准浓度为1.0×10-8mol/L～1.0×10-4mol/L的样品溶液，每次进标准样品溶液20μL，由计算机实时记录出峰时间及响应电流，用于定标的蛋白质与待测蛋白质的混合样品中待测蛋白质相对应，因蛋白质而异的出峰时间是相应的蛋白质在所确定的分离条件下的定性分析标准，按同种蛋白质不同浓度及其相应的响应电流值绘制的浓度—电流工作曲线是确定该蛋白质的浓度的定量分析标准；第四步蛋白质的分离检测进20μL待测蛋白质的混合样品，由计算机实时记录色谱峰的出峰时间及响应电流值，通过将测得的色谱峰的出峰时间与第三步所得的标准出峰时间对比，确定与该色谱峰对应的待测蛋白质的种类；通过将测得的响应电流值与第三步所得的工作曲线对比，确定与该响应电流值对应的待测蛋白质的浓度。
本发明的技术方案的进一步的特征在于，所述的蛋白质色谱柱是美国VARIAN公司的VARIAN Microsorb 300-5 C4色谱柱。
本发明的技术方案的进一步的特征在于，第二步中，流动相的最佳流速为1.0～2.0mL/min，ECD的最佳工作电位为-0.3V。
工作原理。
ECD采用CHI832电化学分析仪，利用该工作站中的i-t直流安培技术，通过计算机控制、传输、采集、记录数据。在以PVP/CdS量子点修饰电极为工作电极1，分别以Ag/AgCl电极和不锈钢电极为参比电极3和对电极2的薄层ECD的三电极体系中，在工作电极1与参比电极3之间施加工作电位，为样品发生还原反应提供所需的电位。在-0.2V～-0.4V电位范围内，当蛋白质经过蛋白质色谱柱分离，在不同的时间流经ECD的薄层电解池4时，在PVP/CdS量子点修饰电极上发生还原反应，产生还原电流峰，这种电化学响应在以玻碳电极为工作电极1的传统HPLC-ECD体系中是无法实现的，PVP/CdS量子点修饰电极能得到已有的玻碳电极上所无法得到的对蛋白质的电化学响应的原因是PVP/CdS量子点复合材料的粒子的粒径为2～5nm，由于粒径大大减小，使PVP/CdS量子点修饰电极具有高的比表面积，极大地增加了PVP/CdS量子点修饰电极与蛋白质的直接表面接触，提高了电子传递效率，促进了电子的迅速高效传递。
在蛋白质色谱柱、流动相组成、流速、梯度等分离条件确定的情况下，蛋白质的色谱峰的出峰时间因蛋白质而异同种蛋白质，出峰时间相同，不同种蛋白质，出峰时间不同。因此色谱峰的出峰时间是蛋白质的定性分析标准。在同一ECD上所施加工作电位一定时，在蛋白质的线性浓度范围内，随着蛋白质浓度的增加，峰电流线性地增加，通过一系列不同浓度的标准蛋白质的浓度与相应电流值的关系绘制出标准曲线是蛋白质的定量分析标准。对实际样品，即混合样品进行测定时，将其峰响应电流值代入工作曲线，就可得到蛋白质的浓度。
与背景技术相比，本发明的方法具有以下优点1、本发明的方法用以PVP/CdS量子点修饰电极为工作电极1的ECD与HPLC体系联用，能检测到在以玻碳电极为工作电极1的传统的HPLC-ECD系统上无法检测到的蛋白质电化学响应。
2、本发明的方法能够实现蛋白质的快速分离、高灵敏度检测。
3、本发明的方法对蛋白质分离检测的线性范围宽，检测限低。线性范围大于2个数量级，检测限低于5.0×10-8mol/L。与传统的UV-Vis法的检测限在10-5mol/L数量级相比，本发明的方法的灵敏度提高了100倍以上，因此，本发明的方法适于用来快速分离检测含微量蛋白质，如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素c等的样品，且重现性好、相对标准偏差小。
4、本发明的方法拓宽了PVP/CdS量子点修饰电极的应用范围，使其不但可以实现静态电解池中蛋白质的直接电化学测定，而且还可以实现对HPLC体系分离的蛋白质进行实时电化学测定。
5、本发明的方法操作简便，检测成本低廉。
图1是已有的玻碳电极的结构示意图。其中宏观图中1是工作电极，工作电极1是玻碳电极，微观图中12是工作电极1的表面，即玻碳电极的表面，微观图是宏观图中工作电极1的表面，即玻碳电极的电极端面处的结构示意图。
图2是本发明的方法所采用的PVP/CdS量子点修饰电极的结构示意图。其中宏观图中1是工作电极，工作电极1是PVP/CdS量子点修饰电极，微观图中12为玻碳电极的表面，13为PVP/CdS量子点复合材料膜，14为Nafion膜，微观图是宏观图中工作电极1，即PVP/CdS量子点修饰电极的电极端面处的结构示意图。
图3是PVP/CdS量子点修饰电极用于薄层ECD的分解图。其中1是工作电极、2是对电极、3是参比电极、4是薄层电解池、5是电极座、6是进液孔、7是出液孔、8是工作电极座和10是套管。
图4是HPLC-ECD系统的工作流程示意图。
具体实施例方式
所有的实施例均按照发明内容所述方法的操作步骤进行操作。
实施例1 用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法之一蛋白质色谱柱是美国VARIAN公司的VARIAN Microsorb 300-5C4色谱柱。
第二步中，流动相的流速为1.0mL/min，流动相在20％～60％A梯度范围内以2％/min的速度变化，电化学工作站施加在ECD上的工作电压为-0.3V，预运行10min。第三步中，分别配置标准浓度为1.0×10-8mol/L～1.0×10-4mol/L的三种蛋白质血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素c的溶液，三种蛋白质血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素c的色谱峰的出峰时间分别为12.49min、9.02min和6.33min，其浓度—电流工作曲线分别为y＝1.0841x+2×10-8，y＝1.1537x+1×10-8和y＝1.2451x+1×10-8，其中y和x分别为响应峰电流值(A)和蛋白质浓度值(mol/L)。用于定标的三种蛋白质与待测蛋白质的混合样品中待测蛋白质相对应。第四步中，待测蛋白质混合样品进样后，在6.33min、9.02min、12.49min分别出现了三个色谱峰，峰电流值依次为4.42μA、6.48μA和6.13μA。通过与第三步测得的标准出峰时间对比，可以确定与三个色谱峰对应的待测蛋白质分别是细胞色素c、肌红蛋白和血红蛋白。通过与第三步测得的工作曲线对比，可以确定三种待测蛋白质细胞色素c、肌红蛋白和血红蛋白的浓度分别为3.54×10-6mol/L、5.61×10-6mol/L和5.64×10-6mol/L。
实施例2 用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法之二第二步中，除以下条件与实施例1的不同外，其他条件与实施例1相同流动相的流速为2.0mL/min，流动相在20％～60％A梯度范围内以4％/min的速度变化，预运行12min。第三步中，血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素c的色谱峰的出峰时间分别为6.25min、4.51min和3.17min；在第四步中，混合样品进样后，在3.17min、4.51min和6.25min分别出现了三个色谱峰，峰电流分别为0.73μA、0.51μA和0.89μA。通过与第三步测得的标准出峰时间对比，可以确定与三个色谱峰对应的待测蛋白质分别是细胞色素c、肌红蛋白和血红蛋白。通过与第三步测得的工作曲线对比，可以确定三种待测蛋白质细胞色素c、肌红蛋白和血红蛋白的浓度分别为5.78×10-7mol/L、4.33×10-7mol/L和8.03×10-7mol/L。
实施例3 用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法之三第二步中，除以下条件与实施例1的不同外，其他条件与实施例1相同流动相的流速为5.0mL/min，流动相在20％～60％A梯度范围内以10％/min的速度变化，预运行15min。第三步中，血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素c的出峰时间分别为2.49min、1.80min和1.23min。第四步中，混合样品3进样后，在1.23min、1.80min和2.49min分别出现了三个色谱峰，峰电流值分别为98nA、75nA和84nA。通过与第三步测得的标准出峰时间对比，以确定与三个色谱峰对应的待测蛋白质分别是细胞色素c、肌红蛋白和血红蛋白。通过与第三步测得的工作曲线对比，可以确定三种待测蛋白质细胞色素c、肌红蛋白和血红蛋白的浓度分别为5.94×10-8mol/L、6.41×10-8mol/L和7.19×10-8mol/L。
综上，只要在ECD上施加的工作电位(-0.2～-0.4V)确定，按照本发明的方法就可以确定待测蛋白质的工作曲线，利用该工作曲线就可以进一步对蛋白质样品进行定量分析。
权利要求
1.一种用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法，其特征在于，需在含蛋白质色谱柱的、HPLC与工作电极1为PVP/CdS量子点修饰电极的ECD组成的HPLC-ECD体系内实施，其操作步骤如下第一步 流动相溶液的配置流动相A液为含0.1％三氟乙酸，即TFA的乙腈，B液为含0.1％TFA的水，将配好的流动相溶液分别放入流动相贮液瓶A和B中；第二步 HPLC-ECD体系的运行在选定的蛋白质色谱柱条件下，启动HPLC泵，流动相的流速在1.0～5.0mL/min的范围内调节，流动相的梯度在20％～60％A梯度范围内以2％/min～10％/min的速度变化，通过计算机启动并控制电化学工作站在ECD上施加电压为-0.2～-0.4V的工作电位，计算机实时记录流动相在ECD上的电流响应情况，预运行10～15min后体系达到稳定状态流动相流速恒定、蛋白质色谱柱柱压稳定、薄层ECD电化学响应i-t基线稳定，所述的电化学工作站是CH1832电化学分析仪；第三步 蛋白质的分离检测的定标用多种蛋白质以每次一种的方式对所述的HPLC-ECD体系进行定标，分别配置一种蛋白质一系列标准浓度为1.0×10-8mol/L～1.0×10-4mol/L的样品溶液，每次进标准样品溶液20μL，由计算机实时记录出峰时间及响应电流，用于定标的蛋白质与待测蛋白质的混合样品中待测蛋白质相对应，因蛋白质而异的出峰时间是相应的蛋白质在所确定的分离条件下的定性分析标准，按同种蛋白质不同浓度及其相应的响应电流值绘制的浓度—电流工作曲线是确定该蛋白质的浓度的定量分析标准；第四步 蛋白质的分离检测进20μL待测蛋白质的混合样品，由计算机实时记录色谱峰的出峰时间及响应电流值，通过将测得的色谱峰的出峰时间与第三步所得的标准出峰时间对比，确定与该色谱峰对应的待测蛋白质的种类；通过将测得的响应电流值与第三步所得的工作曲线对比，确定与该响应电流值对应的待测蛋白质的浓度。
2.根据权利要求1所述的用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法，其特征在于，所述的蛋白质色谱柱是美国VARIAN公司的VARIAN Microsorb 300-5 C4色谱柱。
3.根据权利要求1所述的用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法，其特征在于，第二步中，流动相的最佳流速为1.0～2.0mL/min，ECD的最佳工作电位为-0.3V。
全文摘要
一种用PVP/CdS量子点修饰电极实现蛋白质分离检测的方法，属于纳米修饰电极和生物检测的技术领域。该方法需在含蛋白质色谱柱的、HPLC与工作电极为PVP/CdS量子点修饰电极的ECD组成的HPLC－ECD体系内实施，用HPLC技术分离蛋白质，HPLC泵驱动流经蛋白质色谱柱的流动相和待测液直接进入ECD，PVP/CdS量子点修饰电极对分离的蛋白质进行电化学检测。该方法有灵敏度高、稳定性好、成本低廉、能实现对蛋白质的电化学检测等优点。
文档编号G01N30/02GK1731174SQ20051002893
公开日2006年2月8日 申请日期2005年8月19日 优先权日2005年8月19日
发明者金利通, 刘梅川, 张莉, 程欲晓, 张文, 鲜跃仲, 施国跃 申请人:华东师范大学