专利名称：小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法
技术领域：
本发明涉及一种测定小麦中高、低分子量麦谷蛋白亚基的方法，属于电化学分析及分离方法技术领域。
背景技术：
小麦蛋白主要有麦谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白四部分组成。其中小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基对小麦品质具有决定性作用，它不仅影响小麦的沉淀值、湿面筋含量、面团的形成时间、稳定时间以及面团的弹性和延展性，而且对小麦的烘烤品质也具有决定作用。但是在对小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的电泳分析方法中，由于清蛋白和球蛋白的存在影响了其电泳，而且由于低分子量麦谷蛋白与小麦醇溶蛋白分子量相近，特别是低分子量麦谷蛋白亚基条带多达20余条带型并且主要集中分布，因此在泳图谱中很难区分。目前常用于分离小麦高低分子量麦谷蛋白亚基与其它蛋白的溶液配方是含有0.625M2-氨基-2羟甲基-1，3-丙二醇(Tris)(ph＝6.8)、2％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.3％溴酚蓝、5％巯基乙醇和10％甘油的提取液。该溶液虽然能提取小麦高、低分子量麦谷蛋白，也能去除清蛋白，但是不能去除醇溶蛋白和球蛋白，另外该溶液中只用巯基乙醇来打破各亚基之间二硫键的结合，效果不充分，因此在电泳图谱中，球蛋白和醇溶蛋白的存在，使小麦麦谷蛋白亚基，特别是低分子量麦谷蛋白亚基各条带的区分极不明显，严重影响了小麦麦谷蛋白各亚基的研究及其检测。只有在充分剔出清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的情况下，并且打破各亚基之间的二硫键，才能清晰的区分高、低分子量麦谷蛋白各亚基，为小麦品质的遗传研究和育种应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取小麦高低分子量麦谷蛋白亚基的方法，通过加人异丙醇去除小麦蛋白中的醇溶蛋白，加人NaI去除球蛋白，而用水去除清蛋白，加人DDT、VP和巯基乙醇充分打破个亚基之间二硫键的结合，从而使各亚基处于分离状态，为SDS-PAGE奠定良好的基础。
本发明的技术方案是这样实现的1、小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，其特征在于采取如下步骤完成A、取1/3单粒小麦种子夹碎放人0.5ml ep管中，加入含有异丙醇和NaI的提取液I，离心分离去除小麦蛋白中的醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白；B、加入含有溶液B和二硫苏糖醇的提取液II，离心分离；C、加入含有溶液B和4-乙烯基吡啶的提取液III；D、加人麦谷蛋白提取液IV；E、利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行测定。
所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，步骤A所述的溶液I是0.3MNaI溶解于7.5％异丙醇中。
所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，步骤A所述的分离方法是在ep管中加入200μl提取液I，于65℃水浴1-2小时，10000rpm离心3-5分钟，弃去上清液。
所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，步骤B所述的提取液II的配制方法是0.04M 2-氨基-2羟甲基-1，3-丙二醇溶解于25％异丙醇中，调节pH为8.0得到溶液B，10ml溶液B加入0.1g十二烷基硫酸钠，200mg二硫苏糖醇得到提取液II。
所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，步骤B所述的分离方法是在步骤A得到的沉淀物中加人50μl提取液II，悬浮，65℃水浴2小时，10000rpm离心3分钟，取上清液。
所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，步骤C所述的提取液III的配制方法是10ml溶液B加入0.1g十二烷基硫酸钠，140μl 4-乙烯基吡啶得到提取液III。
所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，步骤C所述的分离方法是在步骤B得到的上清液中加入50μl提取液III，65℃水浴1小时。
所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，步骤D所述的提取液IV的配制方法是2％十二烷基硫酸钠，5％巯基乙醇，20％甘油，0.2％溴酚蓝，7.57g的2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇，水余量，pH为6.8。
所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，步骤D所述的分离方法是取步骤C的溶液，加人50μl提取液IV，混匀，静置30分钟，100℃水浴5分钟，冷却后所得溶液即为含有小麦高、低分子量麦谷蛋白的试样溶液，可冰箱保存或直接进行电泳分析。
本发明的技术进步效果表现在通过加人一定浓度的异丙醇去除小麦蛋白中的醇溶蛋白，加人NaI去除球蛋白，而用水去除清蛋白，依次加人二硫苏糖醇、4-乙烯基吡啶和巯基乙醇离心分离充分打破个亚基之间二硫键的结合，从而使各亚基处于分离状态，为利用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳奠定良好的基础。
图1是现有技术分离分析分析小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基电泳照片图2是本发明的分离分析方法小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基电泳照片图中1、小麦高分子量麦谷蛋白亚基 2、小麦低分子量麦谷蛋白亚基具体实施方式
一、试验溶液的配制1、提取液I的配制每升7.5％异丙醇中加人45克NaI，得到0.3MNaI溶液；2、提取液B的配制每升25％异丙醇加人0.48克2-氨基-2羟甲基-1，3-丙二醇()，得到0.04M Tris溶液，调节pH＝8.0；3、提取液II的配制10ml溶液B加人0.1g十二烷基硫酸钠(SDS)，在加入200mg二硫苏糖醇(DTT)；4、提取液III的配制10ml溶液B加人0.1g十二烷基硫酸钠(SDS)，再加人140μl 4-乙烯基吡啶(VP)；
5、提取液IV的配制2％十二烷基硫酸钠(SDS)，5％巯基乙醇，20％甘油，0.2％溴酚蓝，7.57g 2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇(Tris)，水余量。调节pH＝6.8二、试样制备1、取1/3单粒小麦种子夹碎放人0.5ml ep管中，加入200μl提取液I；2、65℃水浴1-2小时，10000rpm离心3-5分钟，弃上清液；3、加人50μl提取液II，悬浮，65℃水浴2小时；4、10000rpm离心3分钟，取上清液加50μl提取液III，65℃水浴1小时；5、加入50μl提取液IV，混匀，静置30分钟；6、100℃水浴5分钟，冷却后所得溶液即为含有小麦高、低分子量麦谷蛋白的试样溶液，可直接进行下一步电泳，进行高、低分子量麦谷蛋白亚基定性研究。
通过对照图1、图2高、低分子量麦谷蛋白亚基电泳照片，说明本发明采用的分离分析方法在充分剔出清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的情况下，并且打破各亚基之间的二硫键，才能清晰的区分高、低分子量麦谷蛋白各亚基，为小麦品质的遗传研究和育种应用奠定基础。
本发明列举的实施例旨在进一步地阐述小麦中高、低分子量麦谷蛋白亚基分离分析方法，而不对本发明的范围构成任何限制。
权利要求
1.小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，其特征在于采取如下步骤完成A、取1/3单粒小麦种子夹碎放入0.5ml ep管中，加入含有异丙醇和NaI的提取液I，离心分离去除小麦蛋白中的醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白；B、加入含有溶液B和二硫苏糖醇的提取液II，离心分离；C、加入含有溶液B和4-乙烯基吡啶的提取液III；D、加入麦谷蛋白提取液IV；E、利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行测定。
2.根据权利要求1所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，其特征在于步骤A所述的提取液I是0.3MNaI溶解于7.5％异丙醇中。
3.根据权利要求1所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，其特征在于步骤A所述的分离方法是在ep管中加入200μl提取液I，于65℃水浴1-2小时，10000rpm离心3-5分钟，弃去上清液。
4.根据权利要求1所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，其特征在于步骤B所述的提取液II的配制方法是0.04M 2-氨基-2羟甲基-1，3-丙二醇溶解于25％异丙醇中，调节pH为8.0得到溶液B，10ml溶液B加入0.1g十二烷基硫酸钠，200mg二硫苏糖醇得到提取液II。
5.根据权利要求1所述的小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，其特征在于步骤B所述的分离方法是在步骤A得到的沉淀物中加入50μl提取液II，悬浮，65℃水浴2小时，10000rpm离心3分钟，取上清液。
6.根据权利要求1小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，其特征在于步骤C所述的提取液III的配制方法是10ml溶液B加入0.1g十二烷基硫酸钠，140μl 4-乙烯基吡啶得到提取液III。
7.根据权利要求1小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，其特征在于步骤C所述的分离方法是在步骤B得到的上清液中加入50μl提取液III，65℃水浴1小时。
8.根据权利要求1小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，其特征在于步骤D所述的提取液IV的配制方法是2％十二烷基硫酸钠，5％巯基乙醇，20％甘油，0.2％溴酚蓝，7.57g的2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇，水余量，pH为6.8。
9.根据权利要求1小麦高、低分子量麦谷蛋白亚基的分离分析方法，其特征在于步骤D所述的分离方法是取步骤C的溶液，加入50μl提取液IV，混匀，静置30分钟，100℃水浴5分钟，冷却后所得溶液即为含有小麦高、低分子量麦谷蛋白的试样溶液。
全文摘要
本发明提供一种分离分析小麦中高、低分子量麦谷蛋白亚基的方法，通过加入异丙醇去除小麦蛋白中的醇溶蛋白，加入NaI去除球蛋白，而用水去除清蛋白，加入DDT、VP和巯基乙醇充分打破个亚基之间二硫键的结合，从而使各亚基处于分离状态，为利用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行测定奠定良好的基础。
文档编号G01N27/447GK1851444SQ20051004821
公开日2006年10月25日 申请日期2005年12月26日 优先权日2005年12月26日
发明者纪军, 刘冬成, 王志国, 李俊明, 张爱民 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所