专利名称：：用于检测与膜通道相互作用的分子的分析系统和方法
技术领域：
：本发明涉及用于检测与细胞膜通道相互作用的分子的分析系统和方法。更具体地，本发明涉及用于检测离子通道的调节剂的闪烁迫近分析(SPA)系统和方法。
背景技术：
：细胞膜包括很多分子例如营养物、废弃物和小分子可以通过的通道。离子通道是在所有细胞的膜中都可以发现的膜通道的一个例子。典型的离子通道包括跨膜蛋白或一组选择性地使离子通过膜的脂双层的蛋白质。按照通过通道的主要离子，离子通道的例子包括钠离子(Na+)通道、钾离子(K+)通道、氯离子(Cl-)通道、和钙离子(Ca2+)通道。离子通道可以是一直开放的，例如在钾离子渗漏通道中发现的那样。离子通道也可以是电压门控性的，一个例子是钠离子通道。可替代地，离子通道可以是配体门控性的。配体门控性通道是离子的渗透性对于与特定配体例如神经递质的结合敏感的离子通道。神经递质的例子包括但不限于，乙酰胆碱、谷氨酸、甘氨酸、或γ-氨基丁酸。膜通道的类别可以包括非离子传导，但却允许其他分子通过来进入和/或透出细胞的膜通道。在通道家族中，离子通道的结构是相同的。每个通道包括不同的蛋白质亚单位，其中该蛋白质亚单位是由可以选择性地在某些细胞类型中或在生物体发展和生长的某个时期表达的不同基因编码的。离子通道在形成神经和肌肉细胞的电活动性，以及控制神经递质和激素的分泌方面发挥关键性的作用。由于在脊椎动物中与各种生理过程，例如肌收缩、胰岛素从胰脏中的释放和神经系统中神经递质的释放之间的相关性，离子通道的研究对于制药工业越来越重要。特别地，钙通道是近来研究的重要靶点，因为它们是特定地调节Ca2+进出细胞的普遍存在的离子通道。Ca2+通过电压控制进入细胞，Ca2+通道发挥电信号的第二信使的作用起始事件例如收缩、分泌、突触传递和基因表达。钙通道可以分类为L-型(长效)、T-型(短暂)、N-型(既不是长效也不短暂，或者用于神经元)、P-型(浦肯野细胞)、Q-型和R-型(抗性的)，这是根据各种因素例如激活和失活动力学、离子特异性和对药物和毒素的敏感性分类的。除了低电压激活(LVA)通道-T-型通道外，L-、N-、P-、Q-、和R-型通道都是高电压激活的(HVA)。换句话说，HVA通道的激活阈值一般在-40mv以上。尽管据报道L-型和T-型Ca2+电流是范围广泛的细胞类型，但是在神经元中N-、P-、Q-、和R-型电流才是最主要的。设计分析法来鉴定对离子通道特异性调节的新药物会受到下列事实的干扰离子通道是由多种蛋白质亚单位构成的，仅仅是在通道处于膜的脂双层中时才能评价离子通道的功能。特别地，该离子通道调节的化合物鉴定分析法会由于下列的因素而变得复杂1)低密度的天然通道表达；2)通过经典的电压箝位法难以固定(由于它们复杂的内折结构，许多候选的用于研究的离子通道占据了难以钳住的细胞，这些细胞的例子包括树突状细胞、神经末稍细胞和肌细胞)；和3)许多其他通道的电流会掩蔽离子通道较小的电流。现有的鉴定离子通道调节剂的技术是产量、生理学关联性、敏感性和坚韧性之间妥协的产物。研究离子通道的一种广泛接受的分析法是膜片钳位术(Neher(1992)，Neuron，8605-612)。尽管一些公司试图将膜片钳过程自动化，但由于当前该实验程序的电流复杂性和再现性使得其不适合用于高效筛选(HTS)应用。使用电压敏感性染料或放射性同位素的光学记录法在电压门控性离子通道包括钙通道的研究中变得越来越流行。这些方法更容易自动化，并且为药物筛选应用提供了更高的效率(当前，高达每天100,000个化合物)，可以为离子通道活性提供更灵敏的分析法(Xu，等人(2001)，DrugDiscoveryToday，61278-12887)。但是，这些分析经常要求药理学介入以激活所研究的通道，导致可能产生假阳性结果(Denyer等人(1998)，DrugDiscoveryToday，3323-332)。适合HTS的另一种分析技术是竞争性结合测定。典型地，真空过滤法用于定量放射性标记的特定配体与离子通道的结合。配体与留在过滤器上的通道结合，用冲洗缓冲液洗去未结合的游离配体。该方法是比较麻烦的，因为它花费了较长的时间，而且需要较大体积的冲洗缓冲液。此外，分离方法包括用冲洗缓冲液反复洗涤，依次产生了大量的放射性液体废弃物，不仅处理昂贵，而且对于进行实验的人也有潜在的健康危险。发明简述本发明提供一种用于检测预细胞膜通道相互作用的分子的分析系统和方法。更具体地，本发明涉及一种检测离子通道的调节剂的闪烁迫近分析系统和方法。在优选的实施方案中，本发明的分析系统和方法可以提供下列优点，例如较高效、降低所需来源和试剂的成本，和减少废物。在优选的实施方案中，本发明提供可以在单个反应混合物中进行的同质分析。此外，本发明优选提供一种系统，其减少了假阳性结果和/或背景，因此产生了可靠的和可再现的分析结果。在一个方面，本发明提供一种检测与细胞膜通道相互作用的分子的分析系统，该分析系统包括a.包括一种或多种膜通道的细胞膜；b.载体，包含闪烁体和与细胞膜连接的偶联剂；c.选择与膜通道结合的配体，该配体包含激活闪烁体的标记物，其中载体与细胞膜的连接和配体与膜通道的结合导致了从载体的闪烁体中发射，其中，当与膜通道相互作用的受试分子存在时，改变了从载体的闪烁体中的发射。另一方面，本发明提供一种鉴定与细胞膜通道相互作用的分子的方法，该方法包括下列步骤a.提供包括一种或多种膜通道的细胞膜；b.在允许偶联剂与细胞膜结合的条件下，培养细胞膜和包含闪烁体和偶联剂的载体；c.在允许配体和膜通道结合的条件下，培养细胞膜和包含激活闪烁体的标记物的配体；d.培养细胞膜和怀疑与膜通道相互作用的受试分子；e.在受试分子存在时和在受试分子不存在时，测定载体的闪烁体中的发射；和f.比较当受试分子存在时从载体的闪烁体中的发射和当受试分子不存在时从载体的闪烁体中的发射。附图简述加入并构成本说明书一部分的附属的附图对本发明的若干方面进行了解释说明，其与优选实施方案的描述一起，用于解释本发明的原理。对附图的简要描述如下附图1的曲线图，说明的是在各小时里(X-轴)培养时间对于[125I]GVIA与离子通道结合的影响，用每分钟计数(cpm)来表示(Y-轴)，其中离子通道是在从大鼠脑中分离的细胞膜中，空方格非特异性结合(NSB)；填充格总结合。附图2的曲线图，说明的是mg/孔(X-轴)的珠浓度对于[125I]GVIA与离子通道结合的影响，用cpm来表示(Y-轴)，其中离子通道是在从大鼠脑中分离的细胞膜中，空方格非特异性结合(NSB)；填充格总结合。附图3的曲线图，说明的是μg//孔(X-轴)的细胞膜浓度对于[125I]GVIA与离子通道结合的影响，用cpm来表示(Y-轴)，其中离子通道是在从大鼠脑中分离的细胞膜中，空方格非特异性结合(NSB)；填充格总结合。附图4的曲线图，说明的是微微摩尔，pM(X-轴)的配体浓度对于[125I]GVIA与离子通道结合的影响，用cpm来表示(Y-轴)，其中离子通道是在从大鼠脑中分离的细胞膜中，空方格非特异性结合(NSB)；黑方格总结合；黑三角背景(BKG)。附图5的曲线图，说明的是pM(X-轴)的配体浓度对于[125I]GVIA与离子通道结合的影响，用cpm来表示(Y-轴)。该附图中的数据是附图4数据的重绘图。附图6的曲线图，说明的是竞争性配体的存在对于[125I]GVIA与离子通道结合的影响，其中离子通道是在从大鼠脑中分离的细胞膜中。竞争性配体浓度的log值在X-轴中表示，[125I]GVIA的结合，单位为cpm在Y轴表示，方格CTX-GVIA；圆CTX-MVIIA；黑三角CTX-MVIIC；空三角ω-Agatoxin。附图7的曲线图，说明的是GVIA与细胞膜中[125I]的膜通道的总结合(用方格表示)，和从大鼠中分离的细胞膜的非特异性结合(用三角表示)，用z因素来评价。样本数在X轴表示，[125I]GVIA的结合，单位为cpm在Y轴表示。附图8的曲线图，说明的是使用本发明的一个实施方案，[125I]MVIIA或[125I]MVIIC与离子通道的结合，其中离子通道是在从大鼠脑中分离的细胞膜中。总结合用灰色条来表示，非特异性结合用白色条来表示。附图9的曲线图，说明的是使用本发明的一个实施方案，[125I]GVIA或[125I]MVIIA与离子通道的结合，其中离子通道从IMR32细胞中分离出来的。总结合用灰色条来表示，非特异性结合用白色条来表示。附图10的曲线图，说明的是[125I]MVIIA与细胞膜中的离子通道的结合，其中该细胞膜与用麦胚凝集素(WGA-Ysi)或聚赖氨酸(PL-Ysi)包被的硅酸钇珠预偶联。总结合用灰色条来表示，非特异性结合用白色条来表示。发明详述将引用的所有出版物都通过参考引入本文。除非另有说明，本文使用的所有技术和科技术语都与本发明所属
技术领域：
普通技术人员的一般理解具有同样的含义。本文使用的术语“包含”、“含有”、“具有”和“包括”都是开放的和非限制性的。本文使用的“受试分子”是指怀疑与细胞膜通道相互作用的分子，将其用于本文所描述的分析系统和方法。“受试分子”、“受试化合物”、和“怀疑与膜通道相互作用的分子”在本文中是可以互换使用的。本发明的分析系统和方法可以用于检测与膜通道以任何方式相互作用的受试分子，其中该方式影响了膜通道结合配体的能力，根据对该教导的回顾上述含义将是可以理解的。本文使用的离子通道“调节剂”包括以影响离子通道活性的方式与离子通道相互作用的分子。调节剂的示范性例子包括降低、阻断、阻止、延迟激活，使其失活，失敏或向下调节通道活性，或者加速或增强离子通道失活的分子，例如通道抑制剂或阻滞剂。调节剂的其他示范性例子包括增加、开放、激活、促进、增强激活，敏化或向上调节通道活性，或延迟或减缓通道失活的分子，例如通道激活剂或开放剂。离子通道“调节剂”与感兴趣的膜通道的相互作用可以是直接或间接的。直接相互作用的例子包括分子与膜通道的配体结合位点的结合。间接相互作用包括以影响膜通道与配体结合的方式，与膜通道的其他任意位点之间的相互作用。这些间接的相互作用可以包括例如具有抑制剂或激活剂功能的分子。本文使用的“载体”是包含闪烁体和偶联剂的物理颗粒。可以提供任意适当结构的载体以掺入闪烁体和偶联剂，使得闪烁体可用于接受和发射能量，偶联剂可用于与细胞膜连接。载体的例子是闪烁迫近分析珠(SPA珠)、其可以是商业购买的，例如来自PharmaciaAmersham。也可以考虑其他形式的载体，例如乳胶颗粒或其他结构。任选地，载体可以进一步包括波长移动剂，例如1，4-二(5-苯基-2-唑基)苯；9，10-二苯基蒽；1，4-二(2-甲基苯乙烯基)-苯等等。当存在时，波长移动剂的功能是吸收闪烁体发射的光，和再发射波长更长的光，其可以与在闪烁计数器中使用的光敏监测器更好地匹配。载体的“闪烁体”是一种对射线敏感的试剂，其在射线照射下会闪烁(例如，发射光能)。闪烁体可以是物理或化学地掺入到载体中的。当用放射标记的反应试剂刺激时，受激的闪烁体释放出可以由闪烁计数器或其他监测装置例如光电倍增管检测的光能。闪烁体的例子包括但不限于，载有铈的玻璃，基于稀土鲸蜡醇的物质例如硅酸钇、镧系稀土金属化合物，或闪烁聚合物例如聚(乙烯基甲苯)。闪烁体的例子也包括荧光物质，当将其与放射性标记的反应试剂紧密靠近时，其会被刺激而发出光能。在本发明中有用的荧光材料包括在闪烁计数领域公知的任意的有机荧光物。一般地，可以选择适当的荧光物质，例如从OrganicScintillationDetection，E.SchramandR.Lombaert，ElsevierPublishingCo.，1963的“有机荧光物”和“有机闪烁体”中选择。荧光物质的例子包括2，5-二苯唑(PPO)；唑和1，3，4-二唑的衍生物，例如2-(4-叔丁基苯基)-5-(4-联二苯基)-1-3，4-二唑和2，5-二苯基唑；蒽；9，10-二苯基蒽；对-联三苯基、对四联苯基和它们的衍生物；2-(4-联二苯基)-5-(4-叔丁基-苯基)-1，3，4-二唑(丁基PBD)；PBD；2-(1-萘基)-5-苯基唑(α-NPO)；等等。可以与β射线形式(例如从14C、35S、33p和125I中发射的)的射线使用的优选闪烁体的例子是二苯基唑(PPO)。许多物质可以为载体的闪烁体提供粘合剂、基质或其他载体。适当的粘合物质的例子包括聚丙烯酰胺、丙烯酰胺、琼脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、Sepharose等等。珠，例如Sepharose4B珠是商业可用的(来自PharmaciaFineChemicals，Uppsala，Sweden)。将闪烁体掺入到载体中的方法将取决于下列因素，例如用于形成载体的物质、闪烁体、在载体中需要的闪烁体的负载密度等等。在一种掺入方法中，例如，将闪烁体吸附到形成载体的物质中。根据该特别的实施方案，可以选择闪烁体的可溶性溶剂。优选地，闪烁体在水中是不溶的，在这些实施方案中，所选择的溶剂与水是可混溶的。形成载体的物质在溶剂中培养，以使该物质脱水。然后，在能将闪烁体吸附到该物质的条件下，该物质可以在包含闪烁体的溶剂中培养，因此形成了包含闪烁体的载体。排出过量的溶剂，加入水或缓冲盐水溶液使闪烁体沉淀出来，因此，将闪烁体固定在载体的物质中。将闪烁体集中到载体例如珠中的适当方法在U.S.4,568,649和EP154,734中进行了描述。载体的“偶联剂”是与细胞膜，例如通过与细胞膜结合而连接的分子。这些连接可以是非特异性的或特异性的。例如，当连接是非特异性时，该连接依赖于细胞膜的一般性质，例如其负电荷。在非特异性连接的一个例子中，聚-L-赖氨酸可以与带负电荷的细胞膜结合。当是特异性连接时，该连接取决于，例如位于细胞膜表面内或上的特异性蛋白质。例如，麦胚凝集素与在膜表面包含低聚糖的N-乙酰基-β-D-葡糖胺结合；抗生物素蛋白链菌素与生物素化的蛋白质、肽和寡核苷酸结合；金黄色酿脓葡萄球菌蛋白A可以用于与抗体-抗原络合物结合；和可以选择在细胞膜的特异性位点结合的抗体。偶联剂的例子包括聚-L-赖氨酸、麦胚凝集素、抗生物素蛋白链菌素、金黄色酿脓葡萄球菌蛋白A、抗体等等。尽管文献已经报道了偶联剂与细胞膜结合的能力，但本发明并不要求在偶联剂和细胞膜本质上有结合作用。相反，在偶联剂和在其表面保留有载体的细胞膜之间任意连接，以进行本发明的分析，对于本发明都是合适的。在优选的实施方案中，偶联剂与细胞膜的亲和力的范围是约50nM到约1pM。可以用任意适当的方法将偶联剂与载体连接，这取决于下列因素例如用于形成载体的物质、闪烁体、所选择的特定偶联剂、偶联剂的需要的负载密度等等。在一些实施方案中，用连接剂例如溴化氰、碳二亚胺、鞣酸、戊二醛、或聚乙二醇将偶联剂掺入到载体中。可以将连接剂掺入到载体中，以与需要的偶联剂共价结合。在掺入偶联剂后，可以使用阻滞剂(例如甘氨酸)来阻断珠上剩余的激活位点，因此减少了细胞膜与载体的直接结合，而不是与偶联剂的结合。可以将偶联剂掺入到载体的物质中。所述掺入可以是物理(例如，嵌入)或化学的(例如，化学结合)。可替代的，偶联剂可以包被到载体的表面。将偶联剂掺入到载体中的方式并不是关键性的，只要根据本发明的分析方法，偶联剂可以有效地与细胞膜连接即可。在一个说明性的实施方案中，用溴化氰激活Sepharose4B珠，通过将载体置于包含蛋白A或抗体的溶液和适当的缓冲液中，以便将金黄色酿脓葡萄球菌蛋白A或细胞膜蛋白质的特异性抗体形式的偶联剂掺入到载体中。然后，洗去过量的蛋白A(或抗体)，用适当的阻滞剂例如甘氨酸阻断没有与蛋白A(或抗体)连接的载体剩余的激活位点。本文中使用的“激活闪烁体的标记物”是一种能激活闪烁体并与膜通道的配体连接的的试剂。根据在载体中包括的闪烁体的类型来选择激活闪烁体的标记物。例如，激活闪烁体的标记物可以包含放射性同位素。优选的放射性同位素在水中仅有有限的放射性，以使得在大部分情况下仅仅是结合到膜通道的标记的配体上的放射性同位素在实际上激活了在其上结合的载体的闪烁体。适当的放射性同位素的例子包括125I、3H、14C、59Fe、33P、35S、38Sr等等。在一个优选的实施方案中，当所选择的闪烁体是PPO时，可以使用发射β射线的同位素或γ射线发射中的俄歇电子。用适当的方法将激活闪烁体的标记物掺入到配体中，该方法基本上不会影响配体结合膜通道的能力(例如特异性)。用于标记的方法可以根据所使用的激活闪烁体的标记物的类型而不同。例如，放射性同位素的标记可以通过用相应的放射性同位素取代配体的一个原子而实现。根据该特别的实施方案，例如用氘(3H)取代一个或多个氢原子，用碳-14(14C)取代一个或多个碳原子，或用锶-38(Sr)取代一个或多个锶原子。在另一个实施方案中，与在配体中取代原子相反，可以将同位素加入到配体中。一般使用的放射性同位素的例子是碘-125(125I)和铁-59(59Fe)。在生物学有机体或者这些有机体的一部分能合成蛋白质时，可以通过将有机体和适当的放射性标记前体例如蛋氨酸-35(35S)一起培养来进行标记，以使得有机体将同位素掺入到其产物中。本发明提供检测与膜通道相互作用的分子的系统和方法，在优选的实施方案中，本发明涉及检测与离子通道相互作用的分子的系统和方法。为了解释说明，本发明也将其描述成了离子通道调节剂。但是，根据本发明的显而易见地，利用所述技术，本发明的分析系统和方法可以用于鉴别许多不同类型的分子，其与任意类型的膜通道相互作用。本发明的分析系统和方法用于检测与细胞膜通道相互作用的分子。在优选的实施方案中，本发明的分析系统和方法用于鉴定离子通道的调节剂。本发明提供一种鉴定与膜通道相互作用的分子的方法，该方法包括下列步骤(a)提供包括一种或多种膜通道的细胞膜；(b)在允许偶联剂与细胞膜结合的条件下，培养细胞膜和包含闪烁体和偶联剂的载体；(c)在允许配体和膜通道结合的条件下，培养细胞膜和包含激活闪烁体的标记物的配体；(d)培养细胞膜和怀疑与膜通道相互作用的受试分子；(e)在受试分子存在时和在受试分子不存在时，测定载体的闪烁体中的发射；和(f)比较当受试分子存在时从载体的闪烁体中的发射和当受试分子不存在时从载体的闪烁体中的发射。收集步骤(f)的信息用于评价与感兴趣的细胞膜相互作用的分子。在优选的实施方案中，本发明用于检测膜通道的调节剂。一般说来，一方面，本发明利用了2个部分，载体和配体，它们优选在细胞膜上相互作用，来输出指示受试化合物与膜通道相互作用的信息。利用掺入到载体中并包含闪烁体的偶联剂将载体与细胞膜连接。配体与细胞膜的膜通道特异性结合，并包含激活闪烁体的标记物。设计该分析，以利用(载体的)闪烁体和(配体的)激活闪烁体的标记物之间的空间间隔来确定调节剂与感兴趣的膜通道之间的相互作用。在一个说明性的实施方案中，配体的激活闪烁体的标记物是放射性同位素，例如125I。125I-标记的配体与膜通道结合，载体与细胞膜结合。当125I发射波长为λ1的射线时，载体就接收到了该射线，然后载体的闪烁体发射可以检测的波长为λ2的荧光辐射。由于在水中125I射线的平均范围相对较短，悬浮着的反应物的任何水性介质都可以作为发射的有效吸收体。结果，未结合的125I将不能形成可检测的信号输出；相反，未结合的125I中的发射将会被水性介质吸收。可以用测定125I的能量门控的标准液体闪烁计数系统来进行输出信号的检测。一般地，当激活闪烁体的标记物发射的能量在水中具有有限范围的距离时，未结合的配体典型地距离闪烁体太远而不能刺激闪烁体。结果，在测定分析信号前就不需要洗去膜络合物或除去包含激活闪烁体的标记物的未结合的配体。因此，该分析系统和方法提供了一种同质的系统，在分析结果读数前避免了另外的洗涤和/或分离步骤。优选地，载体具有适合所述接近分析的大小。例如在优选的实施方案中，优化载体的典型直径，以允许在载体中包含的闪烁体能足够地物理接近标记的配体，当载体和标记的配体分别与细胞膜和膜通道连接时，使激活闪烁体的标记物发射的能量可以到达载体的闪烁体，和导致闪烁体发射能量。典型地，载体的直径小于闪烁体的激活范围。例如，聚(乙烯基甲苯)(PVT)珠的典型直径是约5μm，而硅酸钇(YSi)的典型直径是约2.5μm。在优选的实施方案中，载体的浓度范围是分析反应溶液的约0.75-5mg/ml。优选地，载体与细胞膜培养的温度范围是室温(20-25℃)到约37℃，pH条件是约4到约8。本发明提供竞争性结合测定来检测与感兴趣的膜通道相互作用的分子。如上述讨论，标记的配体与感兴趣的膜通道结合。当在分析混合物中存在分子和标记的配体并且存在与感兴趣的膜通道相互作用的分子时，因此，两个部分将获竞争性地与膜通道结合。一般地说，如果该分子与膜通道相互作用(例如，结合或以其他方式影响与配体的结合)时，标记的配体将保留在溶液中。由于在水性溶液中激活闪烁体的标记物发射较短，因此溶液中标记物的发射将会在溶液中终止，并不能增加要检测的任意输出信号。换言之，根据下列的方法来测定配体与载体的接近当配合和载体都在激活范围内时，配体诱导载体的闪烁体发射可检测的能量。激活范围是与反应溶液中激活闪烁体的标记物中发射的范围相同的载体的距离。该分析是根据对发生两个事件形成的络合物的测定(1)标记的配体与膜通道的结合和(2)载体与细胞膜的结合，形成了配体/膜通道-载体/细胞膜络合物。可以利用该测定来检测一种或多种分子，其通过相互性作用，竞争性地取代标记的配体至激活范围以外的位置。如果一种或多种分子与膜通道相互作用(例如，结合)，取代的标记的配体将不能与膜通道结合，因此保留在溶液中和激活范围之外。因此，水性的反应溶液将会吸收标记的配体中的发射。从载体的闪烁体中的输出信号也相应地减少。另一方面，如果一种或多种分子没有与膜通道相互作用，将会有更多的标记的配体与膜通道结合，因此在激活范围之内。从载体的闪烁体中的输出信号也相应地增加。优选地，可以通过到达监测器的λ2带辐射的强度(或通过与标准曲线比较来确定)来推断形成的标记的配体/膜通道-载体/细胞膜络合物的程度。在本发明的实施方案中，反应介质是含水的，分析期间pH的范围是约3到约9，介质的温度范围是约25℃到约37℃。根据本发明，在允许偶联剂与细胞膜连接的条件下，培养细胞膜和包含闪烁体和偶联剂的载体。该细胞膜包含一种或多种通道。根据本发明，细胞膜可以包含完整细胞，部分的细胞膜，和/或膜囊。可以从任意适当类型的动物细胞，包括人、大鼠等等中获得细胞膜。可以分离完整细胞，并用细胞制备领域已知的方法来处理，包括全组织的机械或酶分裂，或细胞培养。在一些实施方案中，例如当细胞膜制备方法可能破坏或使细胞受体失活时，优选可以利用完整细胞作为细胞膜的来源在一些优选的实施方案中，可以在可控的条件下破坏膜，得到部分的细胞膜和/或膜囊。在一些实施方案中，部分的细胞膜和/或囊可以为本发明的分析和方法提供更简单的形式，因为在分析期间不用过多地关注细胞溶解和/或切力。细胞膜可以来自组织和/或培养的细胞。破坏细胞膜并使它们稳定的方法是本领域已知的。处理组织得到细胞膜的方法也是本领域已知的。包含在细胞膜内的膜通道可以是通过细胞内源性表达的天然膜通道，或诱导进入细胞的外源性DNA重组表达的膜通道。细胞膜的分离是本领域已知的，用于膜通道(例如离子通道)的构建重组宿主细胞的方法也是本领域已知的。在另一个实施方案中，可以把膜通道掺入到人造膜中(参见Cornell，BA等人(1997)，Nature387，580-583)。例如，这些人造膜可以包括拴在包含离子通道的类脂膜上的电极，并形成离子储库。本发明的分析系统和方法可以用于各种的膜通道。这些膜通道包括离子通道、配体门控通道等等。当本说明书用一个特定种类的通道，例如离子通道描述本发明时，显而易见地本文的技术也可以用于在细胞膜中存在的各种膜通道。在本发明优选的实施方案中，在每200μl分析反应溶液中存在0.5μg或更多的细胞膜。优选地，在每200μl分析反应溶液中存在约0.5到约20μg的细胞膜。在另一个方面，细胞膜优选的浓度是约2.5mg/ml或更大，优选范围是分析反应溶液的约2.5到约100mg/ml。在细胞膜中包含的膜通道的量将根据细胞膜的来源而不同。例如，在天然产生的细胞膜中，细胞膜制品中通道的浓度可以根据种类而不同(例如人与大鼠膜)。当确定在分析中包含的细胞膜的量时，可以考虑膜的来源，以达到需要的膜通道浓度。根据本发明，在允许配体和膜通道结合的条件下，培养细胞膜和包含激活闪烁体的标记物的配体。为了本文的讨论，包括激活闪烁体的标记物的配体也可称作“标记的配体”。选择该配体来与感兴趣的膜通道结合，在一些特别的实施方案中，该配体甚至能阻断贯穿膜通道的电导性。除了当它们靠近时能够刺激闪烁体的激活闪烁体的标记物外，本发明的配体基本上是生物学和化学鉴定的未标记的配体。在上句中，“基本上生物学和化学鉴定”是指以与未标记的配体(也就是说，缺乏激活闪烁体的标记物的配体)相似的方式将包含激活闪烁体的标记物的配体配制成可以与感兴趣的膜通道相互作用。换言之，激活闪烁体的标记物的掺入不会显著干扰配体的结构或功能，特别地，不会显著干扰配体和感兴趣的膜通道之间的相互作用。根据本发明，适当的配体的例子包括抗体、肽、或小分子。适当的抗体的例子包括与感兴趣的膜通道特异性结合的任意抗体。根据本发明，抗体可以是单克隆或多克隆的，其可以包含完全长度的蛋白质或片段(例如，Fc或F(ab)’)。已经鉴定了许多与膜通道结合的肽，其中任意一个都可以根据本发明使用。例如，对于钙通道，配体肽包括但不限于spider和conesnail肽毒素(参见例如Mintz等人，(1992)Neuron985-95；Randall等，(1995)J.Neurosci.152995-3012)。对于钠通道，很好地研究过的特异性阻滞剂包括但不限于蝎毒和腔肠动物触须的刺细胞中的肽毒素、热带蛙分泌的生物碱毒素、和其他从许多类型的植物的叶子中获得的脂溶性、杀虫性物质(参见Hille，Ionicchannelsofexcitablemembranes，2nded.，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，Mass)。对于钾通道，适当的配体肽的离子包括但不限于，毒素，例如在下表中所列出的那些。适当的配体和它们相应的离子通道的例子概述于下表I中。当配体是天然产生时，也指明了配体的来源。表I.用于离子通道分析的示例性配体离子通道肽来源Ca2+通道N-型ω-芋螺毒素MVILAConusmagnusω-芋螺毒素GVIAConusgeographusω-芋螺毒素CVID(AM336)Conussp.ω-芋螺毒素CVIAConussp.ω-芋螺毒素CVIBConussp.ω-芋螺毒素CVICConussp.ω-芋螺毒素SVIBConusstriatusω-芋螺毒素TVIAConussp.ω-芋螺毒素CNVIIAConussp.ω-芋螺毒素PtHAConussp.ω-AgoIHAgelenopsissp.ω-芋螺毒素MVIICConusmagnusP/Q-型ω-agatoxin-IVAAgelenopsisapertaQ-型ω-芋螺毒素MVIICConusmagnusT-型咪拉地尔L-型1，4-二氢吡啶类苯烷基胺苯并噻氮类BAYK8644Na+通道河豚毒素Tetradonstellatus和Tetraodontiformesorder的其它鱼类局部麻醉药(例如利多卡因)μ-芋螺毒素GIIIB肽毒素Conusgeographustoxin抗惊厥药(例如拉莫三嗪、苯妥英)抗心律不齐药(例如奎尼丁、美西律)蛙毒Phyllobatesaurotaenia乌头碱Aconitumsp.藜芦定碱Veratumsp.蝎毒LeiurusquinquestriatusATXIIAnthopleuraxanthogrammicaPhyrethorids(杀虫剂)Chrysanthemumsp.双鞭甲藻神经毒素PtychodiscusbrevisK+通道Kv1.1，1.2，1.6α-树突毒素肽DendroaspisangusticepsKv1.3北非蝎毒素LeiurusquinquestriatusHebreausKv1.3玛格毒素CentruoidesmargaritatusKv1，Kv3，Kv4.24-氨基吡啶类Kv1.1，1.6，2.1，Kv3四乙铵离子Ca2+-激活的K+(BK/hslo)Paxilline生物碱毒素PenicilliumpaxilliIberiotoxin肽ButhustamulusNS1608特别地，首先从Conusgeographus毒液中分离出来的GVIA是一种27个氨基酸的肽，是N-型钙通道的有效和选择性阻滞剂(Whorlow等人，ClinExpPharmacolPhysiol。1996，23(1)16-21)。MVIIA(也称作zincontide或SNX-111)是首先从Conusmagnus的毒液中分离出来的，其是一种25个氨基酸的肽，是有效的N-型钙通道阻滞剂(Olivera等人，(1987)Biochemistry262086-2090)。从Conusmagnus的毒液中分离出来的MVIIC是一种26个残基的肽，是N-型钙通道的弱阻滞剂，是P/Q-型钙通道有效的阻滞剂(Hillyard等人，(1992)Neuron969-77；Wheeler等人，(1994)Science264107-111；Sasaki等人，(2000)FebsLetters466125-129)。ω-AgatoxinTVA是从spiderAgelenopsisaperta中分离出来的，是一种48个氨基酸的肽，据报道可以与P/Q-型钙通道结合(Mintz等人，(1992)Neuron985-95)。在进一步的实施方案中，该配体包含与感兴趣的小分子结合的小分子。适当的小分子的离子包括拮抗类药物(钙通道)；以及四乙铵离子，和抗心律不齐药例如硝苯地平和奎尼丁(钾通道)；有机分子例如二磺基二苯乙烯类、芳基胺苯甲酸盐和磺酰脲类化合物(氯通道)。此外，可以使用晶体生物碱辣椒辣素。对于配体门控通道，根据本发明的一些实施方案可以使用内源性特异性配体例如乙酰氯、谷氨酸、甘氨酸、或γ-氨基丁酸。配体与感兴趣的膜通道的亲和力可以影响分析的灵敏度。例如，高亲和力的配体可以不会检测到结合较弱的分子；两一方面，低亲和力的配体会导致检测到的非特异性结合增加。因此，在优选的实施方案中，选择配体的亲和力在需要的范围内，例如分析获得的EC50值与传统方法例如膜片钳获得的值具有良好的相关性。例如，配体对膜通道的亲和力的优选范围是约1pM到约50nM，更优选的范围是约5pM到50pM。在优选的实施方案中，所存在的配体的量的范围是约10pM到约50pM，优选约12pM到约20pM，最优选约15pM。许多配体是容易从各种商业来源得到的放射性标记的形式。在优选的实施方案中，控制反应试剂和反应条件的选择，以减少标记的配体的非特异性结合。根据这些实施方案，这些不想要的非特异性结合包括标记的配体与任何感兴趣的膜通道以外的位点的结合。例如，非特异性结合可以包括膜脂和位于膜中的其它蛋白质。在其它情况下，非特异性结合包括标记的配体与载体的直接结合，或者与分析容器本身的结合。非特异性结合是不可饱和的，但是与在样品中存在的配体总浓度呈近似线性。当发生时，非特异性结合增加了背景计数，因此减少了分析中测定到的特异性信号。一般地，观测到的总配体结合是配体与相应受体(在存在的情况下，膜通道)的可饱和的(双曲线的)特异性结合和配体与各种位点(即感兴趣的膜通道以外的位点)的非饱和(线性的)结合的和。该关系可以如下表达(总结合)＝(与膜通道的特异性结合)+(与其他位点的非特异性结合)。典型地，通过在过量非标记的配体存在下进行结合研究来间接地获得特异性结合的组分值。非标记的配体与标记的配体竞争性地与膜通道结合。由于非标记的配体过量，特异性结合位点(膜通道结合位点)对于实验的配体将是不可用的，因此其结合被限制于非特异性位点。减少非特异性结合，包括根据组分彼此之间的竞争性和/或分析方式选择适当分析组分。在一个优选的实施方案中，例如，当ω-芋螺毒素用作配体时，优选的载体是用麦胚凝集素包被的PVT珠。在优选的实施方案中，非特异性结合维持在提供最佳信噪比的信号的水平。此外，可以优化分析条件例如缓冲液的pH，特异性离子或有机分子的存在，和/或培养时间来减少非特异性结合。在进一步的实施方案中，在缓冲液系统中可以包括添加物以减少非特异性结合。典型的NSB减少剂包括牛血清白蛋白(BSA)，聚乙烯亚胺(PEI)盐和洗涤剂。此外，分析容器例如微量滴定板是由非结合表面(NBS)的材料构成的，这些材料可以减少配体与分析容器的非特异性结合。根据本发明，将细胞膜和怀疑与膜通道相互作用的受试分子培养。根据本发明，载体和细胞膜连接，包含激活闪烁体的标记物的配体与感兴趣的膜通道结合。当这发生时，刺激包含在载体中的闪烁体来发射能量。然后比较当受试分子存在时闪烁体的发射和当没有受试分子时闪烁体的发射。当受试分子存在时发射的改变(例如，减小)标明了受试分子与感兴趣的膜通道的相互作用。如现在更详细地说明的那样，如果需要，可以改变分析的培养步骤的特定顺序。例如，在一些实施方案中，细胞膜、包含闪烁体和偶联剂的载体、包含激活闪烁体的标记物的配体和怀疑与膜通道相互作用的受试分子可以分别、连续加入到该分析中。换句话说，在该实施方案中，步骤(a)到(d)在分析中可以是分别、连续的步骤。优选该实施方案不需要任何分离或洗涤步骤，所有反应试剂都连续地直接加入到反应介质中。这些特别的实施方案可以提供很多优点，例如简单化的方式和过程。进一步地，在分析前不需要预培养期，因此反应试剂可以在分析的当天重新溶解或融化。在一些实施方案中，该特别的方式允许简单地优化膜和载体的比例，成为可以设置不同的膜浓度和不同的载体浓度的基质试验。优选地，使用稍微过量的载体以确保完全捕获该分析中存在的所有细胞膜。本领域技术人员可以利用已知的确定载体最佳浓度的方法，以用于本文所述的分析。对于本发明加入的特定顺序并不被认为是关键性的。在一些实施方案中，在加入分析的其他反应试剂前，在允许细胞膜和载体形成膜-载体络合物的条件下，细胞膜和载体进行了预培养。根据该实施方案，在向分析中加入细胞膜或标记的配体前，细胞膜和载体进行了预培养。一般地，作为达到该目的的一个代表性方法，在需要的温度下(典型地2-8℃)将细胞膜和载体在预培养期(典型地1到4小时)小心地搅拌。该特别的实施方案可以提供很多优点，例如减少向分析中加入的次数，因为载体和膜是作为一个反应试剂加入的。在一些实施方案中，该实施方案可以为分析条件提供均一性，因为对于分析的每种反应溶液都是使用同样的制品。可替代地，在一些实施方案中，在向分析中加入其它反应试剂前，在允许细胞膜和配体形成膜-配体络合物的条件下，细胞膜与用激活闪烁体的标记物标记的配体进行了预培养。根据该实施方案，加入的载体的量足以与分析反应混合物中的所有细胞膜连接。引入的过量体积将会导致与游离配体的结合的平衡移动，这样在进行测定前反应将会给出足够的时间来重新平衡。在一些实施方案中，该方式的分析的培养时间可以比连续方式加入反应试剂的情况更短。优选地，在进行本发明的方法的本文所述的所有实施方案中，优化细胞膜和载体的比例，以使得分析中存在的全部，或几乎全部的细胞膜与载体连接(比如，结合)。与未结合的膜(没有与载体连接的膜)结合的标记的配体对分析信号没有贡献，因为，该标记的配体距离载体的闪烁体太远而不能影响闪烁体的发射。在连续加入反应试剂或配体与细胞膜预培养的实施方案中，优选包括稍微过量的载体以确保载体捕获了所有的细胞膜。在本发明一个典型的表现中，表示配体与膜通道结合以及载体与细胞膜连接的信号将会持续增加，直至分析达到平衡。可替代地，在分析期间的特定时间点，t，进行测定。通过使用光电倍增管的任意适当的检测器来检测产生的输出。可以使用任意适当的商业可用的闪烁计数器作为检测器。如所述，本发明提供一种鉴定与膜通道相互作用的分子，因此，当在分析样品中存在怀疑与膜通道相互作用的分子时，该分子将与包含激活闪烁体的标记物的配体竞争性地和感兴趣的膜通道结合。结果，当该分子与膜通道结合时，它取代了标记的配体，因此降低了闪烁体发射的光能，这是因为从闪烁体附近清除了包含激活闪烁体的标记物的配体。如果该分子的竞争性更强，将会在分析输出中观测到可测定的改变。因此，本发明优选的实施方案可以提供很多优点，例如允许高效筛选怀疑与感兴趣的膜通道相互作用的分子的系统。此外，根据本发明优选的实施方案，在研究中仅仅通过系统的配体-膜通道的反应比例来控制分析的时间。根据本发明，仅仅需要与细胞膜结合的包含激活闪烁体的标记物的配体与载体的闪烁体足够紧密地接近，以允许标记的配体发射的辐射能轰击闪烁体。结果，不需要从反应混合物中洗去载体或以其他方式试图除去未结合的标记的配体；相反，可以用在分析混合物中存在的所有组分来测定发射能的水平。下面的实施例解释说明了本发明的各个方面。实施例反应试剂和方法结合缓冲液50mMhepes-Tris，pH7.4，和0.05％牛血清白蛋白(BSA)PVT-WGA珠聚(乙烯基甲苯)-麦胚凝集素SPA珠(商业可用的，来自Amersham，Piscataway，NJ，Cat.No.RPNQ0001)。Ysi-WGA珠硅酸钇-麦胚凝集素SPA珠(商业可用的，来自Amersham，Piscataway，NJ，Cat.No.RPNQ0011).Ysi-PL珠硅酸钇-麦胚凝集素SPA珠(商业可用的，来自Amersham，Piscataway，NJ，Cat.No.RPNQ0010).GVIAPerkinElmerLifeSciences，Boston，MA，Cat.NoNEX239[125I]MVIICPerkinElmerLifeSciences，Boston，MA，Cat.NoNEX323[125I]MVIIAPerkinElmerLifeSciences，Boston，MA，Cat.NoNEX316除非另有说明，在下列实施例中使用的SPA珠浓度是5mg/ml。细胞膜的制备根据Zhang等，(2001)Int.Immunopharmacol1955-965的方法，从人神经母细胞瘤(IMR32)中制备，从溴脱氧尿苷或成年雄性斯普拉-道来大鼠脑组织中分化来制备细胞膜。简言之，在冰冷的25mMTris(pH7.2)，2mMEDTA和320mM蔗糖中均匀化细胞或组织。在均匀化以后，首先将混悬液以100×g离心10分钟。收集所得到的上清液，然后以40,000×g离心20分钟。收集膜沉淀，再悬浮于结合缓冲液中，并在-70℃贮存。用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，使用Bradford试剂(Bio-Rad)来确定膜制品中蛋白质的浓度。细胞膜的量为2-5mg/ml。典型地，在大鼠脑膜蛋白中钙通道的量是约200fmol/mg。实施例1配体与钙通道的特异性结合本实施例说明的方法，是用于测定配体与包含在从大鼠脑组织中分离的细胞中的钙通道的特异性结合。在96-孔微量滴定板上，在室温下(20℃-25℃)进行分析。在每个孔中，加入2.5μg的如上所述从大鼠脑组织中分离的细胞膜(通过蛋白质浓度来测定)，1mgPVT-WGA珠，和将总反应溶液达到200μl体积量的结合缓冲液在室温和pH7.4下培养1小时。该预培养步骤产生了细胞膜/珠络合物。在培养后，向每个孔中加入15pM的下列标记的配体中的一种[125I]GVIA，或[125I]MVHC。所得到的混合物在室温和pH7.4下培养60分钟。当进行非特异性结合研究时，在加入[125I]GVIA前，向每个孔中加入100nM未标记的GVIA芋螺毒素，反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时，以得到平衡。存在过量的未标记的GVIA芋螺毒素，以使得在加入标记的GVIA前所有可用的钙通道特异性结合位点都通过未标记的配体结合。用PackardTopCountTM闪烁计数器测定微量滴定板发射的光能。光能的增加对应于膜-珠络合物的形成。GVIA的结合的结果如附图1所示。如上述，用[125I]GVIA培养不同的时间(0到20小时)，并在附图1的X-轴上表示。[125I]GVIA结合在Y-轴上表示，单位是cpm。配体的总结合如曲线A(填充格)所示，而非特异性结合如曲线B(空方格)所示。通过确定总结合(曲线A)和非特异性结合(曲线B)之间的差异来获得GVIA与钙通道的特异性结合。为了确定孔与孔之间的差异，在96孔板中测定48个总结合样品和48个非特异性结合样品。接着进行上述实施例1所述的分析方法。结果如附图7所示，其表明了单位为cpm(Y-轴)的[125I]GVIA的总结合和NSB样品的结合。X-轴表示样品的数目。在该附图中用方格表示总结合，用三角形表示非特异性结合。如所示，当测定的总结合为1641.3次每分钟(cpm)时，测定的非特异性结合(NSB)是264cpm。因此，确定GVIA的特异性结合(总结合-非特异性结合)是1377cpm。总结合与非特异性结合的计算比例是约6.Z-因子(Zhang等，1999，J.Biomol.Screening，467-73)是约0.75，提示该分析的再现性对于构建高效筛选是足够的。实施例2对标记的配体和细胞膜结合的影响确定载体浓度、细胞膜浓度和配体浓度对标记的配体和细胞膜结合的影响。载体浓度在设定的标记的配体和细胞膜的浓度下，检测改变载体的浓度的影响。在微量滴定板中制备包含不同浓度的SPA珠(0.75到5mg/ml)的孔。在每个孔中，含有2.5μg从大鼠脑组织中分离的细胞膜和结合缓冲液，两者的和使总反应溶液体积达到200μl。将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。作为对照，向每个孔中加入100nM未标记的GVIA，将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。未标记的GVIA要过量，以使得未标记的配体与所有可用的钙通道特异性结合位点结合。然后向每个孔中加入15pM[125I]GVIA，以获得平衡。用PackardTopCountTM闪烁计数器测定微量滴定板发射的光能。结果如附图2所示。SPA珠的浓度(mg/孔)如X-轴所示，单位为cpm的[125I]GVIA结合如Y-轴所示。光能的增加对应于珠-膜络合物的形成。如附图2所示，[125I]GVIA与细胞膜的结合取决于所存在的PVT-WGA珠的浓度。标记的-GVIA的总结合用曲线A(黑色圆)表示，标记的-GVIA的非特异性结合用曲线B(空白圆)表示。细胞膜浓度在设定的标记的配体和载体的浓度下，检测改变细胞膜的浓度的影响。在微量滴定板的孔中置入从大鼠脑组织获得的不同浓度的(3.125到25mg/ml)的细胞膜。在每个孔中，加入1mgPVT-WGA珠和使得总反应溶液体积达到200μl的结合缓冲液。将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。在培养后，向每个孔中加入100nM未标记的GVIA，将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。未标记的GVIA要过量，以使得未标记的配体与所有可用的钙通道特异性结合位点结合。然后向每个孔中加入15pM[125I]GVIA，将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时，以获得平衡。用PackardTopCountTM闪烁计数器测定微量滴定板发射的光能。结果如附图3所示。脑膜的浓度如X-轴所示(μg/孔)，[125I]GVIA结合如Y-轴所示(cpm)。光能的增加对应于珠-膜络合物的形成。如附图3所示，珠-膜络合物的形成取决于在分析混合物中存在的细胞膜的浓度。标记的-GVIA的总结合用曲线A(黑色圆)表示，标记的-GVIA的非特异性结合用曲线B(空白圆)表示。配体浓度在设定的标记的载体和细胞膜的浓度下，检测改变标记的配体的浓度的影响。在微量滴定板的孔中置入从大鼠脑组织获得的不同浓度的(3.125到25mg/ml)的细胞膜。向96-孔滴定板的每个孔中，加入1mgPVT-WGA珠，2.5μg从大鼠脑中分离的细胞膜和使得总反应溶液体积达到200μl的结合缓冲液。将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。在培养后，向每个孔中加入100nM未标记的GVIA，将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。未标记的GVIA要过量，以使得未标记的配体与所有可用的钙通道特异性结合位点结合。然后向每个孔中加入不同浓度(1到100pM)的[125I]GVIA，将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时，以获得平衡。用PackardTopCountTM闪烁计数器测定微量滴定板发射的光能.结果如附图4所示.单位为pM的[125I]GVIA的浓度如X-轴所示，单位为cpm的[125I]GVIA结合如Y-轴所示。光能的增加对应于珠-膜络合物的形成。附图4表明了[125I]GVIA浓度对于标记的配体与细胞膜结合的影响。在不含细胞膜的情况下确定背景(曲线B，三角形)。配体的总结合用曲线A(黑方格)表示，而非特异性结合用曲线C(空方格)表示。附图5显示的是在高浓度的配体下，[125I]GVIA与细胞膜的结合是可饱和的。单位为pM的[125I]GVIA的浓度如X-轴所示，单位为cpm的[125I]GVIA结合如Y-轴所示。在附图5中所示的数据是附图4数据的重绘图。该计算机绘出的曲线表示了数据的最佳拟合。在约12pM的浓度时达到了半数最大结合(EC50)，而在约25pM的浓度时达到了最大结合(Bmax)。对[125I]GVIA的饱和数据的分析表明，用一位点模型是结合的最佳拟合，解离常数(Kd)值是13pM，Bmax值是225fmol/mg蛋白质。实施例3钙通道的竞争性结合下面，研究其他钙通道配体和[125I]GVIA竞争性地与从大鼠脑中分离的细胞膜结合的能力。在96孔微量滴定板的每个孔中，加入下列物质1mgWGA-PVT珠，2.5μg从大鼠脑组织中分离的大鼠细胞膜，使总反应溶液体积达到200μl的结合缓冲液。然后向每个孔中加入15pM[125I]GVIA，将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。研究不同配体进争性地与细胞膜结合的能力，包括，向上述制备的反应混合物中加入下列一种配体GVIA、MVIIA、MVIIC、和ω-Agatoxin。加入的每种配体的浓度是0.01pM到0.1pM。将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时，以获得平衡。用PackardTopCountTM闪烁计数器测定微量滴定板发射的光能。结果如附图6所示，其表明了所研究的每种配体的结合曲线。通过单-位点结合模型进行抑制曲线的最佳拟合。配体的浓度如X-轴所示(l0gM)，[125I]GVIA结合如Y-轴所示(cpm)。CVIA的结合如曲线A(方格)所示，MVIIA如曲线B(圆)所示，MVIIC如曲线C(黑三角)所示，ω-Agatoxin入曲线D(空白三角)所示。观测到的[125I]GVIA与细胞膜结合的取代顺序如下GVIA＞MVHA＞MVIIC＞＞ω-Agatoxin。换言之，GVIA显示了最高的相对亲和力，而ω-Agatoxin对所分析的配体显示了最低的相对亲和力。通过单-位点模型对GVIA、MVIIA和MVIIC结合数据进行最佳拟合。结果表明，[125I]GVIA与从大鼠脑中分离的细胞膜中的N-型钙通道特异性结合。计算每种配体的亲和常数(Ki)，结果如表2所示。该数据表明，该分析方法提供了一种有效的系统来研究与钙通道竞争性结合的相互作用。表2特定配体的亲和常数实施例4配体与细胞膜的结合下面研究两种不同的配体与从大鼠脑中分离的细胞膜的结合。在微量滴定板中和室温下进行分析。在第一组设计用于检测[125I]GVIA结合的反应中，向每个孔中加入2.5μg从大鼠脑组织中分离的大鼠细胞膜，1mgWGA-PVT珠，和使总反应溶液体积达到200μl的结合缓冲液，将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。在第二组设计用于检测[125I]GVIA结合的反应中，向每个孔中加入5μg从大鼠脑组织中分离的大鼠细胞膜，1mgPVT-WGA珠，使总反应溶液体积达到200μl的结合缓冲液，将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。该预培养步骤产成了细胞膜/珠络合物。在上述培养后，向第一组反应中加入15pM[125I]MVIIA，向第二组反应中加入15pM[125I]MVIIC。将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时，以获得平衡。用实施例1的方法，以对反应混合物合适的方式，在100nM未标记的MVIIA(第一组反应)或MVIIC(第二组反应)存在下测定非特异性结合。用PackardTopCountTM闪烁计数器测定微量滴定板发射的光能。结果如附图8所示。每种配体的总结合如条形A所示，而每种配体的非特异性结合如条形B所示。单位为cpm的[125I]芋螺毒素的结合(第一组反应是MVIIA，第二组反应是MVIIC)如Y-轴所示。实施例5配体与IMR32细胞的结合如下所述研究标记的配体与IMR32细胞的结合。在微量滴定板中和室温下进行分析。向每个孔中加入10μg从上述的IMR32细胞中分离的细胞膜，1mgWGA-PVT珠，和使总反应溶液体积达到200μl的结合缓冲液，将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。该预培养步骤产成了细胞膜/珠络合物。在上述培养后，向反应混合物中加入15pM[125I]GVIA(第一组反应)，加入15pM[125I]MVIIA(第二组反应)。将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时，以获得平衡。用实施例1的方法，以对反应混合物合适的方式，在100nM未标记的GVIA(第一组反应)或MVIIA(第二组反应)存在下测定非特异性结合。用PackardTopCountTM闪烁计数器测定微量滴定板发射的光能。结果如附图9所示。每种配体的总结合如条形A所示，而每种配体的非特异性结合如条形B所示。单位为cpm的[125I]芋螺毒素的结合(第一组反应是GVIA，第二组反应是MVIIA)如Y-轴所示。实施例6包含不同偶联剂的珠的结合如下所述研究包含不同偶联剂的载体与细胞膜连接的能力和在配体-结合分析中的功能。在微量滴定板中和室温下进行分析。向每个孔中加入2.5μg从大鼠脑组织中分离的大鼠细胞膜，1mgYsi-WGA珠或Ysi-PL珠，和使总反应溶液体积达到200μl的结合缓冲液，将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时。该预培养步骤产成了细胞膜/珠络合物。在上述培养后，向反应混合物中加入15pM[125I]MVIIA。将反应混合物在室温和pH7.4下培养1小时，以获得平衡。用实施例1的方法，在100nM未标记的MVIIA存在下测定非特异性结合。用PackardTopCountTM闪烁计数器测定微量滴定板发射的光能。结果如附图10所示。总结合如条形A所示，而非特异性结合如条形B所示。单位为cpm的[125I]MVIIA的结合如Y-轴所示。我们观测到，该非特异性结合高于使用PVT-WGA珠的分析。根据对本说明书的思考或从本文公开的本发明的实施中，本发明的其他实施方案对本领域技术人员将是显而易见的。本领域技术人员可以做出对本文所述原理和实施方案的各种省略、改变和变化，而不脱离下列权利要求所指定的本发明的真正范围和精神。本文引用的所有专利、专利文献和出版物都通过参考引入，就像分别引入一样。权利要求1.一种检测与细胞膜通道相互作用的分子的分析系统，该分析系统包括a.包含膜通道的细胞膜；b.载体，其包含闪烁体和与细胞膜连接的偶联剂；c.选择性地与膜通道结合的配体，该配体包含激活闪烁体的标记物，其中载体与细胞膜的连接和配体与膜通道的结合导致了从载体的闪烁体中发射，其中，当与膜通道相互作用的受试分子存在时，改变了从载体的闪烁体中的发射。2.权利要求1的分析系统，其中该细胞膜是从表达天然膜通道的细胞膜中得到的。3.权利要求1的分析系统，其中该细胞膜是从重组细胞分离的，该重组细胞从外源性DNA表达膜通道。4.权利要求1的分析系统，其中该细胞膜是人造膜。5.权利要求1的分析系统，其中该膜通道是离子通道。6.权利要求5的分析系统，其中该离子通道选自钠通道、钾通道、氯通道、钙通道和配体门控离子通道。7.权利要求6的分析系统，其中该离子通道是钙通道。8.权利要求1的分析系统，其中该膜通道是配体门控通道。9.权利要求1的分析系统，其中该载体包含珠。10.权利要求1的分析系统，其中该载体包含二苯基唑。11.权利要求1的分析系统，其中该载体包含聚(乙烯基甲苯)。12.权利要求1的分析系统，其中该载体包含硅酸钇。13.权利要求1的分析系统，其中该偶联剂与细胞膜以非特异性方式连接。14.权利要求13的分析系统，其中该偶联剂依靠细胞膜的负电荷与细胞膜连接。15.权利要求13的分析系统，其中该偶联剂选自麦胚凝集素A型和麦胚凝集素B型。16.权利要求1的分析系统，其中该偶联剂与细胞膜以特异性结合相互作用的方式连接。17.权利要求16的分析系统，其中该偶联剂是直接对抗在细胞膜上表达的一种或多种蛋白质的抗体。18.权利要求1的分析系统，其中该配体选自抗体或抗体片段、肽和小分子。19.权利要求18的分析系统，其中该配体选自GVIA、MVIIA、MVIIC。20.权利要求1的分析系统，其中该激活闪烁体的标记物是放射性同位素。21.权利要求1的分析系统，其中该分子是离子通道调节剂。22.权利要求1的分析系统，其中当存在与膜通道相互作用的分子时，从载体的闪烁体中的发射减少。23.一种鉴定与细胞膜通道相互作用的分子的方法，该方法包括下列步骤a.提供包括一种或多种膜通道的细胞膜；b.在允许偶联剂与细胞膜结合的条件下，培养细胞膜和包含闪烁体和偶联剂的载体；c.在允许配体和膜通道结合的条件下，培养细胞膜和包含激活闪烁体的标记物的配体；d.培养细胞膜和怀疑与膜通道相互作用的受试分子；e.在受试分子存在时和在受试分子不存在时，测定载体的闪烁体中的发射；和f.比较当受试分子存在时从载体的闪烁体中的发射和当受试分子不存在时从载体的闪烁体中的发射。24.权利要求23的方法，其中在步骤(c)或(d)之前进行步骤(b)。25.权利要求23的方法，其中在步骤(b)之前进行步骤(c)和步骤(d)。26.权利要求23的方法，其中测定从闪烁体中的发射包括测定光能的发射。全文摘要本发明提供一种检测与膜通道相互作用的分子的分析系统，该分析系统包括，包含一种或多种末通道的细胞膜；载体，包含闪烁体和与细胞膜连接的偶联剂；选择性地与膜通道结合的配体，该配体包含激活闪烁体的标记物。根据本发明，载体与细胞膜的连接和配体与膜通道的结合导致了从载体的闪烁体中发射，其中，当与膜通道相互作用的受试分子存在时，改变了从载体的闪烁体中的发射。也公开了鉴定与膜通道相互作用的分子的方法。文档编号G01N33/68GK101023355SQ200580031637公开日2007年8月22日申请日期2005年7月19日优先权日2004年7月20日发明者S·－P·张,E·E·科德申请人:詹森药业有限公司