专利名称：小反刍兽疫病毒荧光定量rt－pcr检测试剂及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以小反刍兽疫病毒基因片段为靶目标设计合成、制备的生物制剂，尤其是能够对小反刍兽疫病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法和应用。
背景技术：
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是FAO/OIE规定的A类烈性传染病，我国规定为一类动物疫病，是一种严重的烈性、接触性传染病，主要感染小反刍兽，特别是山羊高度易感，其它野生动物也可发生。该病以突然发热、精神沉郁、眼和鼻排出分泌物、口腔溃疡、呼吸失调、咳嗽、恶臭的腹泻和高死亡率为特征。本病发病率可达100％，严重暴发期死亡率为100％。。
本病于1942年在西非科特迪瓦首次发现，随后证实该病存在于非洲的尼日利亚、塞内加尔和加纳。近年来该病呈蔓延的趋势，并且越来越明显。由西非、中非和东非向东扩散，目前已经传播到西亚和南亚地区，且有上升趋势。目前，与我国接壤的南亚地区印度、尼泊尔、孟加拉国、巴基斯担和阿富汗也暴发了PPR。该病作为一种重大的跨国动物疫病，严重威胁我国的动物卫生安全，对该病开展研究具有重要的现实意义。
小反刍兽疫的病原是副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(Peste despetits ruminants virus，PPRV)。PPR和牛瘟(Rinderpest，RP)除临床症状和病理变化相似以外，二者还具有血清学相关性，以前认为PPRV是RPV的一株变异株，PPRV适应于山羊，有时是绵羊，并丧失感染牛的能力；Gibbs等证实PPRV和同属的RPV、犬瘟热、人类麻诊病毒抗原性存在明显的联系，具有血清学相关性，能够产生交叉保护。现在根据PPRV部分F基因序列的遗传特性，把PPRV毒株化分为四群三群起源于非洲，一群起源于亚洲；其中非洲群中的一株也在亚洲发现。
PPR病毒的基因组由单股负链无节段RNA组成，RNA链从3’至5’依次分布着N-P-M-F-HN-L6个基因，编码相应的6种主要结构蛋白。PPR病毒粒子呈圆形，在病毒包膜的里面是核衣壳，由核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)组成。N蛋白由N基因编码，包含一个开放的阅读框架(ORF)，编码525个氨基酸残基；P蛋白和L蛋白构成病毒的多聚合酶。在病毒包膜上有1种基质蛋白(M蛋白)和2种糖蛋白突起(F蛋白和HN蛋白)。M蛋白由M基因编码，该基因长1466nt，包含一个开放的阅读框架(ORF)，编码335个氨基酸残基。HN糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，具有较高的变异性，含有T细胞决定簇，可能与宿主细胞的特异性有关。F糖蛋白具有细胞融合活性，由F基因编码的蛋白，该基因长2321nt，从第489nt到第549nt内含有4个ATG，第4个ATG为编码蛋白的起始子，编码一个含546氨基酸，分子量为59.310Da的蛋白多肽。F基因在麻疹病毒属中高度保守，其5’端序列在具有病毒特异性；F蛋白是决定病毒感染成功与否的关键因素，能够引起病毒诱导的细胞病变，具有病毒诱导细胞溶血素、细胞溶合和启动感染的生物学活性。HN和F糖蛋白在该属病毒中是主要的保护性免疫原，能够诱导机体产生中和抗体。
常用的抗原检测方法主要有病毒分离试验、琼脂凝胶免疫扩散(AGID)、对流免疫电泳(CIEP)、免疫捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光抗体试验(IFAT)等。病毒分离试验鉴定PPR病毒可以用原代羔羊肾或非洲绿猴肾(Vero)细胞组织培养分离。PPR病毒产生的CPE在5天内出现，主要表现为细胞变圆、收缩，最终形成合胞体，合胞体的细胞核呈圆形，犹如表盘状排列。PPR病毒分离物通常采用病毒中和试验(VN)或电子显微镜作进一步鉴定。病毒RNA检测目前常用PPR特异性的cDNA探针和RT-PCR两种方法检测。还有报道根据编码N蛋白的3’末端基因序列设计一组引物，该引物可以特异性扩增一个300碱基对的片段，用限制性内切酶消化或用非放射性寡核苷酸探针杂交技术验证扩增片段的特异性来诊断PPR。
该病常规血清学试验采用病毒中和试验(VN)、竞争ELISA。病毒中和试验通常在原代羔羊肾细胞或Vero细胞的转管培养进行。RPV抗体和PPRV抗体会产生交叉反应，可与牛瘟病毒进行交叉中和试验，当PPR中和滴度高于牛瘟时，则判为PPR阳性。竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)Libeau G应用重组杆状病毒表达的核蛋白(N-B)建立C-ELISA试验用于检测PPRV抗体。针对PPRV核蛋白的特异性MAb能够和这种N-B的特异性位点结合。
对于快速检测PPR病毒，病毒分离方法费时，不能作出快速诊断，且有生物安全隐患，需要选用敏感的宿主或细胞。其它检测方法的敏感性和特异性不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用小反刍兽疫病毒H基因序列设计合成的小反刍兽疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂。
本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。
本发明的再一目的是提供这种检测试剂的应用。
本发明系选择小反刍兽疫病毒H基因的保守片段为靶目标，应用primerExpress软件和primer prere5.0软件，设计合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最适合的引物和探针。
本发明所述的小反刍兽疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为76bp，引物和探针序列为引物PPV-H-F5’-GGGTCCCCCTGTTTTCCAT-3’PPV-H-R5’-CGCTAAAAGACATCTCCGATAGTCA-3’探针(FAM)5’-TGACCAACTATCTCACAGTGAACATGAGT-3’(TAMRA)。
本发明所述的小反刍兽疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法由以下步骤组成一、选择PPV H基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为GGGTCCCCCTGTTTTCCATATGACCAACTATCTCACAGTGAACATGAGTGATGACTATCGGAGATGTCTTTTAGCG；二、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针；三、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；六、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量临床样品的检测应用评估，得到如权利要求1所述的扩增效率和特异性好的引物和探针。
研究建立特异、敏感、可对低含量PPV病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要意义。本发明研制的小反刍兽疫病毒实时荧光定量RT-PCR将PCR与荧光检测相结合，克服了传统PCR费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点，可对样品中的PPV进行准确的定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点。
本发明的优点和积极效果为1、本试剂与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点。小反刍兽疫病毒荧光定量RT-PCR可对样品中低含量的PPV病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，是一种PPV检测的良好方法。
2、本试剂可对细胞培养物、分泌物、血液、组织等多种样品中的PPV进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。
3、本荧光定量RT-PCR试剂除了具有特异性高、敏感性强外，可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险。比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规RT-PCR和免疫捕获RT-PCR产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。
4、与常规PCR相比，荧光定量PCR作出一个定量的、客观的估计，判定出阳性、阴性和可疑。CT值为30.00可确定为阳性和阴性的临界值(cut-off)。更重要的是荧光定量RT-PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。
5、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。该荧光定量RT-PCR试剂盒是一种检测临床样品中PPV的敏感和可靠的方法。
具体实施例方式
1、PPV H基因重组质粒的构建按照黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，中国科学出版社，2003年1月，第1217页至第1259页，进行小反刍兽疫病毒H基因克隆和测序，构建PPV H基因重组质粒，将重组质粒命名为pBAD-H。
2、设计引物和探针本发明选择PPV H基因的保守片段为靶目标，通过对GenBank中报道的PPV各分离株病毒基因的DNA序列和上述1克隆和测序的小反刍兽疫病毒PPV基因DNA序列进行同源性分析比较，选定PPV基因的保守片段(69bp)，应用primerExpress软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针，引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量临床样品的检测应用评估，确定扩增效率和特异性最好的一对引物和一条探针，扩增目标片段长度为76bp。
3、RNA提取小反刍兽疫病毒RNA和标准品同时制备。参照黄祯祥主编《医学病毒学基础及实验技术》，科学出版社(1990年)第143-146页，先测定毒价，以Reed和Muench氏法计算TCID50。取100μL病毒原液，参照卢圣栋主编《分子生物学实验室常用技术》，科学出版社(1999年)第61-62页，酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。用无RNA酶的超纯水溶解总RNA，稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的每个反应管。水泡皮、水泡液、血液(抗凝血)、血清和细胞组织等材料直接提取RNA。荧光RT-PCR和常规RT-PCR试验用同批次提取的RNA。
4、PPV荧光定量RT-PCRPPV荧光定量RT-PCR采用50μL体积反应液，在7000型荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行42℃30min反转录；95℃预变性5min；95℃变性15sec，60℃1min，扩增40个循环。
引物和探针的浓度进行精确筛选，以获得最低的CT值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。每次检测时，设立用水代替病毒RNA样品的4个阴性对照(或正常组织、细胞阴性对照)；设立相当于1000、100、10、1TCID50/每反应管的FMDV标准各4个对照；每个样品检测做3管平行试验。在4个阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判定结果。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。
5、常规RT-PCR常规RT-PCR的上游引物和下游引物与荧光定量RT-PCR相同，扩增目标片段长度为76bp，按常规方法进行扩增。检测用3％琼脂糖电泳分析，阳性扩增结果出现一条76bp特异性条带。
6、PPV荧光定量RT-PCR的特异性、敏感性用RPV、BVD、BTV、EHD、AKAV以及正常BHK21细胞、野外采集山羊和绵羊的组织样品和血清进行特异性比较检测。对PPV样品进行10倍系列稀释，用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测，比较它们的敏感性。
7、荧光定量RT-PCR稳定性和重复性试验在评估PPV荧光定量RT-PCR检测PPV方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用相当于1000TCID50的样品RNA，在同样反应条件下，反复进行荧光定量RT-PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次。
8、标准阳性对照样品的制备、标准曲线的建立及核酸拷贝数的计算上述1构建的重组质粒pBAD-H，转化大肠杆菌TOP10，LB培养基(含Amp100μg/mL)增殖，碱裂解法提取，经试剂盒纯化，质粒浓度用分光光度计测OD260定量。模板浓度的计算在作绝对定量时，首先制备标准曲线。对标准品进行10-1、10-2、10-3、10-4～10-7稀释，通过测OD知道质粒原液(标准品)的浓度后，换算成每个PCR管中模板的数量。做荧光定量RT-PCR检测，以拷贝数或TCID50的对数为X轴，CT值为Y轴作回归曲线，获得标准曲线。
9、引物和探针及其浓度的筛选选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得荧光定量RT-PCR反应的最低CT值和最高ΔRn，提高扩增效率和敏感性。应用含有目的片段的质粒标准品和PPV细胞毒，经系列稀释，制备DNA和RNA不同含量的检测样品。对设计的二对引物和各自的探针，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探针终浓度，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。
10、对PPV样品的检测用荧光定量RT-PCR对PPV细胞培养物、组织、RPV、BTV、EHD、BVDV、正常BHK21细胞、山羊和绵羊组织等试验样品进行检测。提取的RNA稀释后检测，阳性样品的CT值均小于或等于30.0，阴性对照样品的CT值均大于35.0，试验特异性强。CT值35.0可作为是阳性和阴性的临界值。CT值大于35.0可判为阴性，CT值小于或等于30.0可判为阳性，在30.0-35.0之间为可疑，须重新试验。荧光定量RT-PCR检测PPV的特异性强，敏感性高，重复性很好。
11、PPV荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序11.1试剂盒组成(50μl反应×50次)根据上述1～10试验结果，按照反应条件优选、对比试验和验证试验确定的反应条件，配制如下试剂盒组份
11.2操作方法
11.2.1总RNA提取(1)取1ml-1.5ml组织样品研磨上清液或液体样品置1.5ml eppendorf管中，12000rpm，4℃，离心5min，弃上清液。
(2)加入1ml溶液I，充分振荡混匀，置室温5min，彻底裂解。
(3)加200μl溶液II，小心盖上帽盖，用力快速振荡15sec，室温放置3min。
(4)12000rpm，4℃，离心15min。
(5)小心吸取上层水相，转移至一新的1.5ml eppendorf管中，加入500μ1溶液III，混匀，室温放置10min。
(6)13000rpm，4℃，离心10min，弃上清液。
(7)加1000μl溶液IV，充分振荡混匀，12000rpm，4℃，离心5min。小心充上清液。管底部可见有乳白色胶样RNA沉淀。
(8)小心打开管盖，室温自然干燥沉底的RNA。
(9)取11μl溶液IX置入已半干燥的沉底RNA，溶解RNA。可直接用于反转录或-70℃保存备用。
11.2.2反应组份配制(1)取一支200μl光学PCR反应管，反应总体积为50μl，向反应管中加入下列反应物 (2)定量按需要对标准品进行稀释后制作标准曲线，至少7个稀释度。
(3)设立对照阳性对照和阴性对照各设2管。
11.2.3扩增按下列参数设置反应条件
11.2.4结果分析和判定(1)结果分析条件设定直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
(2)质控标准——阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线。
——阳性对照的Ct值应小于30.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，特别是在Threshold(荧光临界值)附近。否则，此次实验视为无效。
——定量用的标准品扩增曲线出现典型的扩增曲线，指数区较明显，7个点具良好的线性范围，平台区汇于一起，相关系数在0.98以上。
(3)结果描述及判定——阴性Ct值应大于35.0或无扩增曲线，表示样品中无小反刍兽疫病毒。
——阳性Ct值小于等于30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在小反刍兽疫病毒。
——有效原则Ct值在30.0～35.0之间的样本建议重做。重做结果Ct值大于35.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。
——定量根据标准曲线作出定量。
权利要求
1.一种小反刍兽疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为76bp，引物和探针序列为引物PPV-E-F5’-GGGTCCCCCTGTTTTCCAT-3’PPV-E-R5’-CGCTAAAAGACATCTCCGATAGTCA-3’探针(FAM)5’-TGACCAACTATCTCACAGTGAACATGAGT-3’(TAMRA)。
2.按照权利要求1所述的小反刍兽疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成(一)、选择小反刍兽疫病毒特异而各分离病毒株间比较保守的H基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为GGGTCCCCCTGTTTTCCATATGACCAACTATCTCACAGTGAACATGAGTGATGACTATCGGAGATGTCTTTTAGCG；(二)、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针；(三)、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；(四)、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；(五)、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；(六)、应用初步确定的候选引物和探针，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量临床样品的检测应用评估，得到如权利要求1所述的扩增效率和特异性好的引物和探针。
3.权利要求1所述的小反刍兽疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂在制备PPV荧光定量RT-PCR标准化试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种以小反刍兽疫病毒基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对小反刍兽疫病毒进行快速检测的试剂以及这种试剂的制备方法和应用。本发明系选择小反刍兽疫病毒特异而各分离病毒株间比较保守的H基因片段为靶目标，通过精心设计、合成引物和探针。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，并经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，得到最适合的引物和探针。本发明所述的小反刍兽疫病毒荧光定量RT－PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为76bp。
文档编号G01N21/64GK1840700SQ20061001061
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月6日 优先权日2006年1月6日
发明者花群义, 周晓黎, 董俊, 杨云庆, 徐自忠, 肖荣海, 尹尚莲 申请人:云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心