专利名称：：蛋白脂质膜和脂质膜生物传感器的制作方法蛋白脂质膜糊旨质膜生物传麟5优先权信息本申请要求于2005年4月12日提交的美国序列号60/670,524的优先权，，本文中被全文引入作为参考。
背景技术：
：io用传统的生物传感器例如Biacore，sX,2000,3000，TIOO，S51和C系统或按需要新己技术例如基于荧光的途4辣测定脂质是困难的，因为在非极性环境下本领域熟练技术人员所知的各种猝灭或激发情况，标记无法良好工作。此夕卜，标i腿常以不可预测地、更严重的是不希望的方式扰乱用来研究脂质的系统。基于流动的系统例如Biacore，干扰需要维持在一財及性环境中并在一財及性环is境下謝于湖懂的结构脆弱的环境。此外，SPR流动，試仅仅麟非常低的样品通过量，这会相当程度地增加形成合适环境和使得蛋白质正确附着(attachment)、组装(assembly)和折叠(fold)的时间，并且增加了对和蛋白质的任何相互作用进行最终测试以确定蛋白质是否在流动环境中正确附着和折叠的时间量。20
发明内容本发明的一个实施方案提供了比色俱嘴生物传或基于移植的波导生物传感器(grating-basedwaveguidebiosensor),其中生物传感器表面是氧化钛(titaniumoxide)、二氧化钛或磷酸钛，其中一种或多种非极性分子固定在氧化25钛或磷酸钛的表面上。非极性分子可以是脂质、杂官能脂质、同功能脂质、磷月旨、胆固醇、单链亲水脂肝、双麟水脂好、胶粒形成化合物、月旨质体形;^才料、离子型清洁剂、阴离子清洁剂、阳离子清洁剂，或两性离子清洁剂。非极性分子可以没有^i己。生物传感器可以被结合到微量滴定板的底部，或可以呈现微阵列格式。生物传感器可以被结合到微量滴定板的底部，其中微量滴30定板的每个孔约为5mm2到约50mm2。氧化钛、二氧化钛，或磷酸钛的表M^T以涂覆以硅烷，以形成钛-硅烷或磷^f太-硅烷表面。生物传感器可以进一步涂覆以一种或多种表面活性剂。钛-硅烷表面或磷酸钛-硅^面可以涂覆以聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的PEO(aHVO(b》PEO(a)形式的嵌段共聚物o本发明的另一个实施方案提供了一种分析脂质层中化学或物理相互作用的5方法，其中脂质层被固定在比色谐振生物传麟或基于移植的波导生物传感器上。此方、跑括用物种接触脂质层，并通过如下方法测定脂质层和该物种之间的相互作用(a)对用于照谢生物传繊的光，检测反lt波长的极大值^t^t波长的极小值，其中如果光的波长偏移，另卩么物种和脂质层相互作用；或(b)检测用来照射生物传，的光的折射率的变化，其中折射率的变化反映了物种io己经与脂质层相互作用。在大约十射中或更短时间内可以分析大约300或更多的样品。月旨质层可以与物种在静止割牛下接触。月旨质层和物种的相互作用在静态^#下分析。脂质层和物种可以是辆斜己的。本发明提供了微量滴定板形式或微阵列形式的生物传感器，其允许脂质测定(assay)或基于脂质的测定可以在单位时间内湖啶更多样品的数量/读数。15当前，典型的在单一體上采用脂质体SPR传^i啶单次结合相互作用时间的测定花费20-30^H中。可见于例如Baird等，Analyt.Biochem.2002310:93-99。在这种时间量中，本发明育,在单一装置上为4到6个384个孔的样品生物传板读数。有利地，在本发明中检测不需要^H己。20图1显示了比色il^生物传自如SRUBiosystemsBIND生物传感器的脂质应用。图2显示了产创旨质体的方法。图3显示了剥离^i^烷(rcpelsilane)比己烷洗涤是更有效的SbK^面处理。25图4显示了在PPL和醛处te后的链霉抗生物素结合。图5显示了聚-苯丙氨酸-,酸(Poly-Pheiys)与聚-赖氨酸(Poly-Lys)在剥离硅烷处te后的附着。图6显示了优JW7jC凃层以改善模蛋白PPL的捕获的结果。图7显示了进ta剥;^^烷处理后的生物传自的水^M角测量。30图8示例的是表面活性剂(聚氧化丙烯)的^7jC嵌段和i5yc性剥离表面之间的有利相互作用，更大量的PLURONIC⑧表面活性剂得以结合。对PLURONIC財L而言，N=24，对对照孔而言，N=8。图9显示了链霉抗生物素与外露的TiO之间结合的繊i随着PLURONIC肝量的变化而变化。5图10显示了吸附了较高浓度PLUROMC⑧的表面繊辱了与下层的g[7KTiO表面之间的链霉抗生物素结合。对照组表面包括外露的TiO和剥离改性的TiO。对PLURONIC斷L而言，N-24，对对照孔而言，N=8。图11显示了与各种PLURONIC⑧改性表面的链霉抗生物素结合。图12显示了在PLUROMC⑧涂覆表面上具有不同的链霉抗生物素表面浓io度的孔的BINDImager图像。图13显示了生物传感器表面可以;M稳定的清洁剂吸附而组装。图14显示了硅烷改性TiO和TiO/Si02表面的醛改性的BINDBIOSENSOR(g)ft号。N-l板(96孔)。图15显示了由TIP改性5t烷表面的更大的BINDBIOSENSORPWV偏is移附正实的醛改性方面的改善。结果是可重复的。N-l板(96孔)。图16显示了用磷酸处理的样品在80'C下T^燥18小时时TIP层的持久性。发明详述Stenlund等指出了在商业可得到的SPR设备中试图为活性膜结合蛋白创造20合适的环境的困难之处，参见Analyt.Biochem.2003，316:243-250。这些设备典型地是基于流动的设备，使工艺复杂化。Stenlund指出，疏水材料和清洁剂的正确组合物不仅是关键的，需要实现，可肖树于不同的蛋白质是不同的，而且该组合物只能根据经验而获得。从经济上考虑，也即同时考虑时间和花费，对在商业企业的约束内的科学家来说，这种类型的开发只能以类似如下的设备25得以实现以基于多孑L微量滴定板的或基于微阵列载玻片(slide)的格式，大的表面区域的比色i離生物传麟離于光栅的波导。进而，SPR类型设备具有很小的尺寸(由于釆样空间的技^卩经济方面显著地被限制)以至于可能由i^7K材料和清洁齐啲次雌的"浑浊"组合物而容易变得PM。这种类型的PIS对比色谐振生物传lill载玻片皿于微量滴定板的30设备或基于光栅的波导来说是不可能的。在比色谐振生物传感器中出现的混浊也不会mi见有的SPR设备那样导致时效的财高。进而，如同Stenlund戶舰明，这种方法最合适的活性蛋白是那些在最初包含蛋白的细胞组分未完全溶解之后不经意具有活性的蛋白。比色谐振生物传自或基于光栅的波导设备会为微弱溶解但是含有活性蛋白的细胞组分的直接施加,充足的、实用的表面，5就像通过另外的途径一样导致获得更高比例的活性蛋白。皿径对于Stenlund途径来说是不可行的，因为微弱溶解的细胞组分将最大可會她PfiS所使用的设备，并为材料的适宜附着,不足的表面区域。进而，已经发现，将从膜结合蛋白的天然环境中取出的膜结合蛋白进行正确的附着和折叠是一个相当耗时间的因素(可参见Cantor和Schimmd，《BiophysicalChemistiy》，第1-3部分，Theiobehaviorandstudyofbiologicalmolecules，W.H,FreemanandCompany,纽约,1980年出版，明确记载于第25章第1327-1371页IntroductiontoMembraneEquilibriaandtoBilayere)，它是一个在流动设备中可能不可实现的因素。在静态模式下操作的比色谐振生物传繊或基于光栅的波导设备将是顿宜的，肖辦鄉对附着禾晰叠的进展的实时测量。15本发明的一个实施方案是在比色谐振生物传感器和/或基于光栅的波导生物传上在非极性环境或部分非极性环境下允许结合和固化情况的测量。参见例如Cunningham等，"Colorimetricresonantreflectionasadirectbiochemicalassaytechnique",《SensorsandActuatorsB》，第81巻，第316-328页，2002年1月5日；美国专利公开No.2004/0091397;美国专利No.6，958，131;美国专利20No.6，787，110;美国专利No.5,738,825;美国专利No.6，756，078。比色i赚生物传感器和基于光栅的波导生物传自不是表面等离子体谐振生物传感器。比色谐振生物传麟具有用作表面结合平台的比色谐振衍射光IK面。使用导向模式谐振mm来产生当用白光照射时被设置为仅仅反射一种波长的光学结构。当分子和表面附着时，反射波长(颜色)由于耦M入光栅的光的光学25途径的改变而偏移。皿接收分子与光面的连接，可以不使用任何种类的荧光探针或粒子标记而对互补性结合^T进行检测。检测技术肖娜^fl材料结合的0.1nm厚度的变化，可以由棘浸没在流体中赫千燥的光臓面进行。读数系统由如下部件乡賊例如，^^法线入射皿例如光学纤维探针照射光栅小位点的白光灯，以及通过第二纤维也是沿着法线入射收集反射光线的30分光计。在几毫秒内进行单次分光i十读数，从而有可能很快地测量在光栅表面上同时发生的大量的分子间相互作用，并实时监测反应动力学。光的反射波长的最大值或者透射波长中的最小值可以用来TO生物传感器，可以检测至恍的波长偏移。在基于光栅的波导生物传感器中的反应可以aiiilt测所用来照朝生物传感器的光的折射率的变化而确定，其中折射率的变化显示出物种已经和生5物传表面上的非极性^相互作用。此技术在例如同st测量^生物分子相互作用的应用方面，特别是在当^f标记改变或抑制被研究的分子的功能时的应用中是有用的。用目标蛋白对药物化^t/库进行高皿，选，以及针对蛋白质组学对蛋白质-蛋白质相互作用进行的微阵列筛选，是需要M^方赚供的灵和:量的应用的实例。也可参见美国申请系列号No.60/244,312，io提交日10/30/00;美国申请系列号No.09/929,957，提交日8/15/01;美国申请系列号No.60/283,314，提交日4/12/01;美国申请系列号No.60/303,028,提交日7/3/01;美国申请系列号No.09/930，352，提交日8/15/01;美国申请系列号No.10/415,037，提交日10/23/01;美国申请系列号No.10/399,940，提交日1/16/04;美国申请系列号No.l0/059，060，提交日1/28/02;美国申请系列号No.is10/058,626，提交日1/28/02;美国申请系列号No.10/201,818，提交日7/23/02;美国申请系列号No.10/237,641，提交日9/9/02;美国申请系列号No.10/180,374，提交日6/26/02;美国申请系列号No.10/227,908,提交日8/26/02;美国申请系列号No.l0/233，730，提交日9/3/02;美国申请系列号No.10/201,878，$|^日7/23/02;美国申请系列号No.10/180,647，提交日6/26/02;20美国申请系列号No.10/196,058，提交日7/15/02;美国申请系列号No.10/253,846，提交日9/25/02;美国申请系列号No.l0/667696，提交日9/22/03，所有这些文件在这里都全文弓l入本文作为参考。比色谐振生物传繊鹏于光栅的波导表面可以是具有高折射率的材料例如硫化锌、二氧化钛、氧化钛、氧化钽以及氮化硅。各种表面化学与支持需要25月旨质环境的蛋白质研究的生物传感器的组装兼容。参见美国专利No.6，645,644(有mii鹏和无机磷鹏涂覆)；美国专利No.6，146，767(自装配有机单层)；Gawalt等(2001)Langmuir,Self-AssembylandBondingofAlkanephosphonieAddsontheNativeOxideSurfaceofTitanium17(19)，573&5738(来自溶液的麟烃膦酸在钛的天然氧化物表面的组装，随后微微加热得到强烈表面接合的酸的链30烷烃链有序膜)；Gawalt等，(1999)Langmuir,Enhancedbondingofalkanephosphonicacidstooxidizedtitaniumusingsurface-boundalkoxyzirconiumcomplexinterfaces，15:8929-8933;Wang等(1998)AdvancedMaterialsPhotogenerationofhighlyamphiphilicTi02surfaces10(2):135-138;Folkers等(1995)Langmuir，Self-assembledmonolayersof1ong《hainhydroxamicacidsonthe5nativeoxidesofmetals11:813-824)。在本发明的一个实施方案中，生物传表面涂覆以硅烷、表面活性剂、聚氧化乙烯和聚氧化丙烯以PEO(a)-PPO(b)-PEO(a)形式的嵌段共聚物，皿组合。由于表面具有固有的疏水特性(除一3皮放置于强紫外线场中或浸没于水溶液中超过8小时)，比色i^g生物传離的TiO/ri02涂层辦别适宜于jt鹏io的。此处记载的处理使在特定的生物学关联环境下对结合事件进行研究从而对禾口细胞和生舰程研究相关的结合事件进行测量成为可能，特别是无需实用微滴定器或者微芯片形式的^i己。脂质单层、脂质双层、脂质、脂质体、蛋白脂质、双层脂质膜、胶束、膜结合蛋白质、脂蛋白、细胞、细胞提取物、合成纤维衍生材料等(即，非极性分子)可以被固定到本发明的生物传表面。这15些非极性分子，例如脂质层、可以包括例如碳水化合物、蛋白质、私以及其他生物分子。一旦固定，它们可以用迚添加物种(例如樹可类型的化合物，月旨质或蛋白质)到生物传繊表丽测定例如横跨脂质层的被动药物吸附、蛋白质磷脂酰肌醇(phosphotidylinositol)相互作用、以及膜受体(membrane-receptor)-配体相互作用。参见图1和图2。在本发明的一个实施方案中，与^及20性分子、物种、或非极性分子和物种同时都不被标己。特别地，本发明使与膜结合蛋白的研究相关的旨测定工作，特别是被称为的G-蛋白耦合受体的种类(药物公司和生,术公司;M亍的药物耙向物)，成为可能。GPCRs可以在例如生物传繊表面上柳旨质膜方面被固定到比色谐振生物传感器表面上或基于光栅的波导生物传感器上，并可以用来检测抑制剂25结合。另一类治疗学上重要的与本发明相关的蛋白质是控制细胞内和细胞间的离子通道和细胞表面蛋白。工作内容包括对这些蛋白质在其天然环境下在下列情况时进行研究当其和药物、其它膜结合蛋白或相关蛋白(与细胞附着或未附着)、信号蛋白、代谢产物的交互作用，以及经历与这些交互作用(例如诱导和细胞内的多种组分相互作用)相关联的变化时。其他一財及性材料可以固定30至哒些表面上以供对结合相互作用进行分析。与本发明相关的功能优位点包括研究这些蛋白质、月旨质、脂质基肝、以及其他辆及性材料在其天然环境中并且在例如微滴定器孔中没有标己时的组合性质。结合性相互作用或者结构变化可以使用本发明的组^l和^^定量。可以在比色谐振生物传麟表面，例如实施例1中记载的M7jC比色谐振生5物传繊表面上，创造出樹可大小鄉度的脂质层。例如，脂质单层(如在TaO上的POPC脂质体繊束)、月旨质双层(例如，含有亲脂基团(象麟烃)以锚定脂质体的7K凝胶；结合脂质双层的Lahiri两亲性锚定脂质表面(Langmuir2000，16，7805-7810);SA表面上的生物素化的脂质体(Bieri等,NatureBiotech.199917,1105-1108);蛋白脂质体双层(将清洁剂溶解的GPCR以定向方式附io着到表面上，并利用脂质胶束在去除清洁剂同时围绕固定的GPCR重构脂质膜(Analyt.Biochem.2002Jan15;300(2):132-8;采用含有过表达的受体的膜部分)。月旨质表面也可以是如Baiixi等，Analyt.Biochem.2002310:93-99;Stenlund等，Analyt.Biochem.2003，316:243-250;Abdiche和Myszka^AnalytBiochem.2004328:233-243;Ferguson等，BioconjugateChem.200516:1457-1483;美国专利.No.is6,756,078中戶/fi己载的那样。月旨质，例如PEG2000、与DPPE脂质附着的PEG5000、与DPPE月旨质附着的PEG2000-生物素、在脂质上的羧基-NHSPEG、POPC(l-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷醚旦碱；mw760.1;avanti850457)、PE-ihod(二Stt磷脂酰乙醇胺—丽丝胺若丹明B;18:1;mw1259.11;avanti810150;exc550em590)20氟在脂质体的外部上)、MPEG-5000-PE(1，2-二棕榈SK-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲縫(聚乙二醇)-5000;mw5727;avanti880200)、MPEG-2000画PE(1,2-二棕榈,-sn-甘油基磷酸乙醇胺-N-[甲縫(聚乙二醇)-2000;mw2731.39;avanti880160)、PE-NBD(18:1，12:0-N-NBD，磷脂酰乙醇胺-NBD;mw1259.11;avanti810133;exc460em534)氟在脂质体的内部上)可以被固定到25生物传感器的表面。脂质在比色谐振生物传麟鹏于光栅的波导生物传麟表面覆盖的離可以通过如下进行测定例如，向脂质体中引入荧光脂质并j顿用于脂质单层和双层的模型预测信号核对荧光信号；或监测BSA结合(融合的脂质表面将抵制BSA结合)。30在本发明的一个实施方案中，本发明的生物传可以包含内表面，例如含有液体的容器的底表面。含有液体的容器可以是例如微量滴定板孔、试管、培养皿，或微流通道。本发明的一个实施方案是被导入到樹可类型的微量滴定板的生物传繊。例如生物传麟可以通过将反应容器的壁组装到生物传麟表面上而被导入到微量滴定板的底面，从而，^孔可以暴露到不同的测，5品。从而，每个单独的微量滴定板孔可以作为单独的反应容器。从而，单独的化学反应育辦在相邻的孔中进行而不会混杂反应流体，且在化学上不同的测试溶液肖嫩施加到各个孔中。对于药物学上高iiM量ff^实验室、M生物学研究实验室，以及诊断测定实验室而言，最普通的测定格式是微量滴定板。板是标准尺寸的塑料筒体，io可以包含以栅格形式安置的96、384或1536个单独反应容器。由于这些板的标准机械构造，液体分配、自动板操作以及检观係统被设计成以这种普通格式工作。本发明的生物传繊可以被弓l入到标准微量滴定板的底面。因为此生物传，表面可以制作成很大的面积，并且因为读数系统不与生物传表面产生物理接触，所以可以限定任意数目的单个生物传感器区域，这些区域仅仅受i5到照射光学系统的聚焦分辨率和扫描横跨生物传表面的照射/检测探针的x-y辦台限定。微量滴定板的齢孔可以是例如大于约lmm2，或者大约5、10、15、20、30、50、10(W顿大。在本发明的另一实施方案中，生物传可以是微阵列的形式。一种或多种分开的非极性物种(例如脂质)"位点"被安扫瞎生物传繊上的不同位置的20微阵列中。非极性物种位点的微阵列包括在生物传感器的表面上的一个或多个非极性物种位点，从而表面包含许多不同的位置，旨均有不同的非极性物种位点，或不同数量的与財及性物种位点。例如，阵列可以包括l,10，100，l，OOO，IO，OOO或100,000个不同的位置。这样的生物传表面被称为微阵列，因为一个或多个位点被典型地在x-y坐标中安置在规则的网格模式。然而本发明的25微阵列可以包括以任何类型的规则或无规则模式设置的一个或多个位点。例如，不同的位置可以限定一个或多个待定辆及性物种的位点的微阵列。本发明的微阵列的一个实例是核酸微阵列，其中阵列内的旨不同位置包含不同的核酸分子。在此实施方案中，在核酸微阵列中的位点检测与测试样品中核酸的相对舰互补性的化学结合。30在本发明的一个实施方案中，大约100，200，300，400，500，1,000，2,000或更多个^^虫的,品肯辦在大约5,10，20,30，40，50，60併中^E短的时间内，ilil一，数親皮分析。此处以说明性质记载的本发明可以适宜地省去在本文中没有具体公开的任意一个或多个要素、一个或多个限定形式被实施。因此，例如此处在任何情况5下使用的术语"包括"、"基本由...组成"以及"由...乡賊"中的任一个可以与其他两个术语中的任一个相互替代。此处所采用的术语和,被用作记载性的术语而非限制，在使用这些术语和，时没有意图排除任何所显示和记载的特征的等同物或其部分，但应当承认在本发明要求的范围之内可以进行各种可能的修正。从而，应当理解，尽管本发明皿优选的实施方案被具体地公开，但是本io领域技术人员可以考虑至体文公开的敝的任选特征、变体和改变，而且所述的变体和改变被认为在本发明说明书和后附的权禾腰求限定的范围之内。此外，虽然本发明的特征或方面被依照马库什分组或其他替换方式分组进行了描述，但是本领^术人员将认可，本发明当然也可以依照马库什组或其他组中倒可单个成员或者成员小组进行描述。15下述是仅仅为了示例目的而被提供的，而不是出于对上文中宽范围记载的本发明范围的限制。所有本发明中弓阅的参考文i^被弓IA^文作为参考。实施例实施例h稳定的^7K生物传SII表面20通过将剥离硅烷(AmershamBiosciences17-1332-01),进入包含比色谐振生物传麟HO表面的孔，例如96-孔板，中可以制备出稳定的船JC比色谐振生物传繊表面。保温7併中。向針孔中^A90ul己烷(^7jO(Sigma227064)。用多通道吸管吸出90ul皿混合物。向孔中注入90ul己烷(第二次注入)。用多通道吸管吸出90ul硅烷混，(第二次吸出)。向孔中^A90ul己25烷(第三次注入)。1顿与真空雜接的8—鹏不辦闪歧管吸出孔中所有保留的溶液。在最后吸出之后允许生物传^^空气中固化。用100mLpbs洗涤板2次，然后用100|oLPBS充i離。对鹏声波处理5-10秒，細声波浴中来回移动板，以使育瞳在fei:均匀分散。{顿^枪千赚的背面。30鄉例2:针对^7jCl^S行的i^K^f专^M^-苯丙氨酸-^S酸KI只泖賦表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>对于齡所，隨的数字而言，N为32个孔5用剥离硅烷(在八甲靴环四硅鄉中，2%w/v)处理比色谐振生物传感器表面，^Mii由50mJ剥1^烷在微量滴定生榭专麟板的孔中保温7辨中进行处理的。g溶液被吸出，用90mJ己烷洗涤表面三次。在最后的己烷洗涤之后，M使板千燥，^滴定生物传麟板固化5射中。板用pH7.4的PBS洗涤三次。PPL波沉积至l胜烷处理过的生物传麟表面。向微量滴定生物传感io器板的*6mm直径的孔中加入40pi的PPL在lOmM磷,pH9,05中的0.1mg/ml溶液。微量滴定生物传板在室温下过夜千燥。然后用PBS洗涤三次。由聚-苯丙氨酸-赖氨,TiO表面的提高的附熟正实，用剥^^m生物传自表面的处理增加了生物传表面的疏水性能。和己烷洗涤相比，剥离15是更有效的疏水表面处理。参见图3和表1。链霉抗生物素结合一后PPL和醛处理表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>对于旨所报道的数字而言，N为32个孔剥离涂覆(repelcoating)的目的是提高TiO的ifeK特性，戶脱特性舰5于生物膜环境的形成必须的表面性能。适宜的剥离涂覆导致通过与苯丙氨酸残基和剥离硅烷的非极性相互作用增加了测试(蛋白)聚合物聚-苯丙氨酸-赖氨酸在生物传感器中的吸附。疏水剥离类型的表面对于在生物传自上创建膜状环境是很重要的，所述环境会为蛋白质的正确附着和折叠il^支持。在此情况下，赖氨酸上的胺(在苯丙氨酸-赖氨酸聚^t/中的竊^^涉及至lJlW7jCio相互作用中)随后被基本上化学转化成肖娜与其他蛋白质形成Schiff碱其伯胺)的醛基。在此实施例中蛋白质是链霉抗生物素。向微量滴定生物传自板的^6mm直径的孔中，加入50mJ的链霉抗生物素在pH5.0的醋,中的0.1mg/ml溶液。溶航孔中保温1小时，随后用pH5.0的醋,洗涤三次。结果显示于图4和表2。表2中显示的数据证明，在生物15传感器上己经创建出均匀的it7K涂覆层，此涂覆层的化学改性均匀，以及额外的功能蛋白质层随后附着在生物传感器上。聚-苯丙氨酸-赖氨酸vs聚-赖氨酸附着后剥离^^烷处理表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>向生物传SI^量滴定板内加入50mj剥离砝院，保持7射中。吸出g，用90mJ己烷洗涤三次生^#自。在用睹^后洗涤之后板固化5分钟。用5PBSpH7.4洗涤三次板。向孔中加入40W的PPL在10mM磷,pH9.05中的0.1mg/ml溶液。生物传驗板在室温下千鹏夜，然后用PBS洗涤三次。图5和表3说明了结合不JM过和生物传S^表面的静电相互作用驱动的，而是由生物传/ill表面的i^K特性导致的。两种聚，聚-苯丙氨酸—赖氨酸(PPL)和聚一赖氨酸一赖氨酸(PLL)除了在PPL中存在有疏水苯丙氨酸io離之外几乎是相同的。赖氨酸残基带正电，可能会影响聚合物的结合，被用来测试与生物传感器的这种附着模式。在此实施例中，很清,氨酸上的电荷不是聚合物向生物传感器附着的主要驱动力，SS51与PPL相tt^氨酸非常低的附着得到证实。生物传0^皮ipyc凃覆，吸弓I和吸附其他船K聚合物比如本实施例的蛋白质(PPL)。15实施例3:为提高PPL结合的剥离硅烷处理在剥离处理之前，生物传自板先经02等离子体处理。在生物传板的6mm直径的孔中进行50mJ剥离硅烷处理7^H中。吸出剩余的砝院，用90pJ己烷洗涤生物传自三次。在最后一次己烷洗涤之后固化生物传板5射中。20用PBSpH7.4洗涤生物传,板三次。在10mMNaH2P03，pH为6.0、7.4、9.0，以及10,1的缓冲液中制备O.lmg/mlPPL溶液，所述缓冲液;iM31用1MNaOH调节11mMNaH2P03pH4.0缓冲液制备的。向生tK专li^板的孔内加入40ml的PPL溶液，在室温下千鹏夜。用PBS洗涤生物传1次。图6显示了为改善模蛋白PPL的捕获，对i5yc涂覆进行最优化的结果。实施例4:为改善表面敵K特性的剥^^烷处理在剥离处理之前，生物传先经02等离子体处理。在生物传自材料的部分，行剥离桂烷处理7射中。吸出乘蜍的麟，用己烷洗涤生物传麟5三次。在最后一次己烷洗涤之后固化生物传麟5辦中。然后用PBSpH7.4洗涤生物传^tl三次。水接触角测量是用AST产品(Billerica,MA)水接触角测4^g进行的。参见图7。水接触角测试的结果进一步证实了疏水表面是在生物传感器表面被创建的。水接触角越高，代表着表面越疏冰。这类测鄉于证实为制备脂质研顿io象而在生物传表面上创建不同层，是很容易在比色谐振生物传，行的，但在商业可得的SPR流动设备Jda行,微佳得多，这是因为这些流动设备的表面区域非常小(典型地是lmm2)以及所提供的流动室的密封特性。因为本发明常规上是大概28mm2的表面积，并且相当开放，因此很容易实现这种类型的测量和其他量化的表面分析(即，X-射线光电谱(XPS)、能量分散谱15仪(EDS)、原子力显微镜(AFM))。表4PLUROMC⑧表面活性剂是聚环氧乙烷和聚氧化丙烯以PEO(a)-PPO(b)~PEO(a)形式的嵌段共聚物。_<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>TiO表面的PLURONIC⑧改性制备pluromc⑧表面活性剂在水中的1%溶液。将100m1的此溶液分散进裸露的TiO或疏水性TiO(剥离硅烷改性过的)孔中。使表面活性剂可以吸附到生物传麟表面上，进行2小时。用水洗涤生物传繊三次。蛋白质结合到生物传自表面制备浓度为O.lmg/mL的链霉抗生物素在pbs中的溶液。将IOOmL的此溶液分别分配到孔中。溶液在L中保温1小时。去除未结合的材料，并用pbs洗涤三次生物传繊。5创建具有不同蛋白浓度的表面制备从lmg/mL到O.OOlmg/mL的各种浓度的PLURONICF127在水中的溶液。将IOOmL的PLURONIC溶液分酉战ljit7jC性处理的TiO(剥离眭烷改性的)孔中。使表面活性齐l顺附到生物传麟表面2小时。去除液体表面活性剂，并用水洗涤生物传SH三次。将IOOmL的HS抗生物素溶液(lmg/mL，io在PBS中)分配到PLURONIC涂覆的孔中，鄉温1小时。去除麟抗生物素，用PBS洗涤三次生物传感器。PLUR0N1C⑧表面活性剂是非离子型清洁剂，它和生物膜在细胞环境中创建分区相同的方式形束，从而将一类5H^/种例如非极性部分和极性部分中分开。这使其成为育嫩在生物传麟上创造出允许混合极性蛋白(即，带有15—些极性区域和一些非极性区域的蛋白质)正确附着和折叠的环境的^g模型和试剂。PLURONIC与剥离涂覆的TiO的结合图8证实，由于在表面活性剂(聚氧化丙烯)^7jC嵌段与5l7K剥离表面之20间良好的相互作用，PLURONIC表面活性剂结合的量更多。对于PLURONIC孔而言，N=24，对于对照孑L而言，N=8。1，PLURONIC⑧生物传感器显示减少了蛋白质与TiO的结合图9显,霉抗生物素与裸露TIO的结合随着PLURONIC表面活性剂肝量的变化而下降。这证明了PLURONIC清洁剂吸附到生物传麟的功25效和在剥离层上部形成了PLURONIC层，从而在生物传感器上形成双层(即，剥离疏水层和PLURONIC⑧疏水层)的洤释。这也进一步证实了控制蛋白质与,改性传liH表面的附着和附着浓度的能力。对于PLURONIC孑L,N=24，对于对照孔，N=8。2.PLUROMC⑧表面活性剂减少了麟抗生物素与TiO和剥离涂覆的TiO30的结合图10显示了更高浓度的PLURONIC⑧吸附表面减少了，抗生物素与下面的疏水TiO表面的结合。对照组表面包括裸露的TiO以及剥离改性的TiO。对于PLURONIC孑L，N=24,对于对照孔，N=8。3.通过改变PLURONIC⑧层浓度的浓度，PLUROMC⑧吸附的表面用来创5建出不同的链霉抗生物素浓度PLURONIC表面活性剂可以用来控希ij与剥离改性表面结合的蛋白质的量。里面分散有蛋白的PLURONIC吸附层可以ffi^宜自择感兴趣的蛋白和通过仔细控制PLURONIC的浓度以将蛋白质适配到吸附的表面活性剂层中的间隙中，而作为膜结合蛋白的模型系统。图11显示了链霉抗生物素与io各禾中PLUROMC⑧改性表面的结合。随着PLURONIC浓度降低至l偫定的关键浓度，结合蛋白量减少，而后随着PLURONIC⑧涂覆的完全'ft/连续性的变化而增加。图12中的BINDImage图像显示了在PLURONIC涂覆表面上具有不同抗生物素表面浓度的孔。15清洁剂TWEEN⑧20结合用reSpH7.4洗涤生物传麟fe次。去除PBS，力口入新溶液并保温25-40倂中a.PBS20b.DMSO在PBS中的2.5%溶液c.甘油在？83中的2.5%溶液d.TWEEN20在PBS中的0.5%溶液e.DMSO在PBS中的5%溶液板用PBS洗涤10次。25在合皿状环境的组合物中，清洁剂是很重要的试剂。图13显示生物传感器表面可以通过稳定的清洁剂吸附进行组装。TWEEN⑧是一种带有极性末端和非极性尾部的非离子性清洁剂。生物传感器表面化学能够被操控以使TWEEN⑧定向，这是构MM^环境所需的。30为提高5t烷层的密度用磷酸对Ti02表面改性包含磷,的环境是生物脂质的一个重要的特性。他们通常微现作为脂质的杂-功能元素，使脂质^和定向从而分离出一一及性隔室。此实施例证实了拥有生物传和膜状环境的组合组分，尤其是当其涉划旨质研究支持表面时是具有睡烷官能性的鹏磷離构造。5对Ti02表面进行改性以获得带电的和反应性的磷醱太(TiP)层的方案TiCV凃覆的BINDBIOSENSOR⑧样品被浸没于0.0145MH3P04的水溶液中不同时间。从磷酸浴中取出生物传样品，并用7jC彻底洗涤。样品在80'C千燥18小时，Dt存直至进一步的分析和改性。1恪氨基丙基三甲竊硅烷io于95%乙醇中的1%溶液。生物传S^被浸没于辦羊审陬的竊丙基三甲氧基St烷于95X乙醇中的溶液中l分钟，用乙l^fe涤四次并在氮气下干燥。在铝箔皿中于65%的相对湿度下忙存生物传/§^过夜。表5显示了TiP和硅烷改性TiP表面的XPS结果。15表<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>Si列显示麟含量随着TiP改性的变化而增加，其中用H3P04改性2小时的表面具有最高的硅烷含量。硅烷和磷Kk清MJ4存在。表6中的给出了得自XPS结果的原子百分比，所述结果经过了归一化，没有考虑磷和钛，考20虑了单4虫^^烷在XPS谱中的贡献。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>5尽管1^04改性表面的硅烷含量可与110表面相比，但Jiii^顿戊二醛改性试剂测SM基一硅烷改性表面的醛反应程度，证实在两，面的胺基的活性是不同的。表6中给出的氮(N)和硅(Si)的显著存在证实了向生物传感器表面稳定地施加目的材料，即3-^丙基三甲硅烷，和通31^f述目的材料进行改性。实际上，在分析的表面深度出是没有预期到这两种元素的存在的，io除非^31il稳定地添加戶服目的材料。图14显示了硅烷改性TiO和TiO/Si02表面的醛改性的BINDBIOSENSOR(S)f言号。N=l板(96孔)图15显示了醛改性的,，i^MiiTIP改性^^面具有更高的BINDBIOSENSORPWV偏移得到证实。结果是可重复的。N=l板(96孔)。"图16显示了当用磷酸处理的样品被于80'C干燥18小时时TIP层的持久性。i顿水,角结果和时间的变化絲，对在室温下千燥的样品进行了比较。冷却的样品维持了亲水表面，^il过接触角随着时间变化稳定地保持很低得到了证实，而未;t4卩的样品恢复到天然Ti(^表面高的,角(60-70)特性。我们已经证实了各种會,制膜蛋白附着的单层舰层的创建。对于如下5领域熟练技术人员来说，本发明变成了用于研究生物分子、小分子以及测试试齐蜮者直接附着、折叠和结合到戶;f^环境中的生物传麟上或者附着、折叠和结合到以前固定在所^环境中的生物传感器上的蛋白质上的工具使用其他替代试剂，例如不同的疏冰材料，包括但不限于脂质、杂和同功能脂质、磷月旨、胆固醇、单链和双链亲水脂分子、胶束形成化合物、脂质体形^^才料、离10子型清洁剂、阴离子清洁剂、阳离子清洁剂，两性离子清洁剂，以及其它创建适宜的旨嫩附着禾哳翻结合蛋白的环境所需的试剂。权利要求1.一种比色谐振生物传感器或基于光栅的波导生物传感器，其中生物传感器的表面是氧化钛、二氧化钛或磷酸钛，其中一种或多种非极性分子固定在氧化钛或磷酸钛的表面上。2.权利要求1的生物传感器，其中非极性分子是脂质、杂官能脂质、同功能脂质、磷脂、胆固醇、单链亲水脂針、双麟水脂針、胶束形成化合物、脂质体形^^料、离子型清洁剂、阴离子清洁剂、阳离子清洁剂，或两性离子清洁剂。io3.权利要求i的生物传感器，其中生物传/i^M合并到微量滴定板的底部或是微阵列形式。4.权利要求3的方法，其中生物传自被合并到微量滴定板的底部，且其中微量滴定板的^孔为约5mn^到约50mm2。5.权利要求1的生物传感器，其中非极性0没有*私己。6.权利要求1的生物传感器，其中氧化钛、二氧化钛或磷^^太表面涂覆有硅烷以形成钛^^烷或磷Mlt-^^^面。7.权利要求6的生物传感器，其中生物传if^皮进一步涂覆以一种或多种表面活性剂。8.权利要求6的生物传感器，其中钛-硅烷表面或磷^l太-硅^^面被涂覆20以聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的PEO(a)-PPO(b)-PEO(a)形式的嵌段共聚物。9.权利要求1的生物传S^，其中氧化钛、二氧化钛或磷Mf太表面被涂覆以聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的PEO(a)^PPO(b)-PEO(a)形式的嵌段共聚物。10.—种分析脂质层中化学或物理相互作用的方法，其中脂质层被固定到比色谐振生物传感器或基于光栅的波导生物传感器上，包括用物种接触脂质25层，并Sil如下方法分析脂质层和物种的相互作用(a)测定用于照射生物传感器的光的反射波长的极大值^iilt波长的极小值，其中如果光的波长偏移，那么物种和脂质层已经发生相互作用；或(b)湖i淀用来照射生物传感器的光的折射率的变化，其中折射率的变tt^M示物种已经与脂质层发生相互作用。11.权利要求10的方法，其中生物传被合并到微量滴定板的底部或30是微阵列形式。12.权利要求11的方法，其中生物传KI被合并到微量滴定板的底部，且其中微量滴定板的^孔为约5皿2到约50mm2。13.权利要求10的方法，其中大约300个或更多样品可以在约10，内或更短时间内被分析。14.权利要求10的方法，其中脂质层在静态剝牛下与物种,。15.权利要求10的方法，其中脂质层和物种的相互作用是在静态^K牛下被分析的。16.权利要求10的方法，其中生物传感器的表面是氧化钛、二氧化钛或磷勝太。17.权利要求10的方法，其中脂质层l杂官腳旨质、同功能脂质、磷脂、胆固醇、单链亲水脂^、双链亲水脂M、胶束形成化^tl、月旨质体形成材料。18.权利要求io的方法，其中生物传/i^皮合并到微量滴定板的底部。19.权利要求10的方法，其中脂质层和物种是无丰斜己的。全文摘要本发明提供了通过使用包含至少一个将固定一种或多种非极生分子的表面的比色谐振生物传感器进行测定的无标记方法。文档编号G01N33/543GK101180541SQ200680011565公开日2008年5月14日申请日期2006年4月12日优先权日2005年4月12日发明者C·L·贝尔德,G·B·王,G·乔吉卡尔马特,J·格尔斯滕迈尔,L·莱恩申请人:Sru生物系统公司