用于测定糖蛋白Ibα(GPIBα)蛋白质的方法

专利名称：：用于测定糖蛋白Ibα(GPIBα)蛋白质的方法
技术领域：
：本发明处于生物化学测定系统、特别是用于测量蛋白质的生物化学测定系统领域内。更具体地，本发明涉及检测并定量糖蛋白Iba(GPIba)蛋白质。
背景技术：
：在血管生物学中，血小板功能是正常的止血和血栓形成的基础。血小板通过保持血管完整性和控制损伤后的出血而对维持正常血液循环作出贡献(Ruggeri，J.Clin.Invest.99:559-564(1997))。尽管血小板栓的形成是存活所需要的防御机制，然而，它还可能促成了疾病如心肌梗死，尤其在动脉粥样硬化微环境下(Fuster，N.Engl.J.Med.326:242-250(1992))。此外，发达国家中发病率和死亡率的一个主要原因是急性血栓形成性动脉闭塞(Ruggeri，J.Clin.Invest.99:4559-564(1997))。这凸显以揭示血小板对血管损伤的应答机制、以及检测该复杂途径中成分的商业方法为中心的研究的意义。血小板的受体复合体即糖蛋白(GP)Ib/IX/V在血小板应答机制中是重要的。这种血小板受体直接与形成至受损血管壁的桥的冯.维勒布兰德因子(vWF)结合(Miura,J.Biol.Chem.275:7539-7546(2000))。该效应通过vWF与内皮下基质结合而触发并受到微血管内血流所提供剪切应力的调节(Turitto，Blood65:823-829(1985))。该事件进一步导致来自受损血管壁的胶原受体与血小^目互作用，引起血小板激活、血小板聚集并且形成封闭内皮溃疡和阻止血液渗漏的止血栓(Girma，Blood70:605-615(1987))。与vWF-胶原基质结合的血小板受体GPIb/IX/V由四个亚基即GPIba、GPIbj8、GPIX和GPV组成(Modderman，J.Biol.Chem.267:364-369(1992))。基于其功能及大小，这些亚基中最重要的亚基是150誦kDaGPIba链(Uff，J.Biol.Chem.277:35657-35663(2002))。GPIba负责通过与vWF的Al-结构域上的多个位点结合而初始祐附至vWF。在GPIba内的突变可以引起出血性病症、贝-苏综合征(BSS)和vWF维勒布兰德病(Pt-vWD)。vWF是GPIba的主要配体，与此同时已经鉴定与该糖蛋白结合的其它蛋白质，包括凝血酶、激肽原、因子XI、因子XII、P-选择素和Mac-l(Uff，J.Biol.hem.277:35657-35663(2002))。GPIba的生物学重要性是显而易见的，并且因此对筒单的、判定性生物学测定法以鉴定并定量GPIba的需要变得迫切。目前定量GPIba的可用生物学测定法费时、费力、受限于某些同种型并且操作成本昂贵。体内(invivo)方法包括大鼠尾静脉出血模型和狗Folts动物模型，而瑞斯托菌素诱导的血小板凝集测定(RIPA)构成目前可用的体外(invitro)测定法(Folts，Circulation83:IV3-IV14(1991)，Dejana，Thromb.Haemost.48:108-111(1982)，WeissJ.Clin.Invest.2:2708-16(1973))。这些测定法伴有背景噪音高、灵敏性有限、成本高、需要大量劳动力，并且具有明显的测定间变异性。因此，需要可以精确而迅速地在数种生物学样品类型内检测并定量大范围水平的GPIba的测定系统。更具体地是可以在研究实验室环境下以及在临床和诊断场所内精确而高效地测量GPIba的方法。具备简单、精确并高度可重复性地检测GPIba的生物学活性的新方法非常受欢迎。本发明满足了这些要求并且还提供相关的优点。本发明的其它目的和优点将部分地在后续描述内叙述，并且将部分地自此描述中显而易见，或可以通过实施本发明获知。本发明的目的和优点将通过在所附带权利要求书中特别提出的组成部分和组合加以实现。应当理解，如所要求那样，在先的一般描ii^随后的详细描述仅是示例性和解释性的，并且不限制本发明。发明筒述GPIba在血管生物学中的重要性已经充分认可，然而没有检测GPIba或测量其生物学活性的简单、有效的试验或诊断性测定法。描述于本文中的本发明涉及了开发高效、可重复性和价廉的用于检测并定量GPIba的生物活性的方法。本发明可应用于临床和研究环境中。本发明还允if^t感而特异地区分GPIba的不同同种型并且因此在执行质量控制和检测GPIba产生水平中极为有用。本测定法的敏感性和特异性包括，但不限于测定GPIba产生和纯化过程中可能的污染性同种型，允许区分活性和非活性的GPIba-Fc融合蛋白的能力。本发明涉及确定生物学样品内GPIba存在的测定方法，包括(a)提供包含GPIba的物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIba的结合蛋白接触；(c)添加对GPIba特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物(complexingcompound);和(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中阳性检测信号预示着生物学样品内存在GPIba。在另一个实施方案中，本发明涉及检测生物学样品内GPIba的蛋白质浓度的测定方法，包括(a)提供包含GPIba的物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIba的结合蛋白接触；(c)添加对GPIba特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；和(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中与已知标准曲线相比较的检测信号预示着生物学样品内GPIba的蛋白质浓度。在又一个实施方案中，本发明涉及检测生物学样品内GPIba的结合活性的测定方法，包括含(a)提供包含GPIba的物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIba的结合蛋白接触；(c)添加对GPIba特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中与已知标准曲线相比较的检测信号预示着生物学样品内GPIba的蛋白质浓度；和(f)计算GPIba的结合活性。在又一个实施方案，本发明涉及通过测量生物学样品内GPIba同种型的结合活性而检测GPIba同种型的测定方法，包括(a)提供包含GPIba的物质和GPIba样物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIba的结合蛋白接触；(c)添加对GPIba特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中与已知标准曲线相比较的检测信号预示着生物学样品内GPIba的蛋白质浓度；(f)计算GPIba同种型的结合活性；和(g)将同种型的结合活性与已知GPIba对照的结合活性比较。附图简述亏1入本说明书并构成其部分的附图，以及连同;MS述共同起到解释本发明原理的作用。图1是GPIba结合测定方式的示意图。首先混合生物素vWF、GPIba-Fc融合蛋白和BV-标记的抗人Fc抗体并在室温温育2小时。温育后，添加链亲和素(SA)珠至此混合物并再温育30分钟。图2是在vWF上的GPIba结合区域的示意图。图3是用于GPIba-vWF结合测定法的标准曲线图示。信号/背景(S/B)比对于本测定法接近于10，而ELISAGPIba结合测定法的S/B是处在其最大值2上，具有l个log线性轴。图4是用于GPIba-Al结合测定法的标准曲线图示。图5是产物变体的结合活性的图示。WT对应于野生型GPIba。VI、V2和V3是功能增进的GPIba变体。根据体内实验结果，功能增进的变体具有增加的结合GPIba的能力。在vWF结合测定法中，可以容易地观察到V3、V2、V1和WT之间的差异，而在A1结合测定法中，变体之间的差异极为有限。图6是四种不同的低分子量(LMW)同种型在vWF结合测定法中结合活性的图示。对照是未切割的GPIba分子。截段、截段1-276、截段1-282和截段Fc代表不同切割的GPIba同种型。图7A是GPIba样品稳定性试验的图示。GPIba的原料药物质(BDS)贮藏在4°C并且将高分子量(HMW)的百分数作为时间的函数进行监测。图7B是GPIba样品稳定性试验的图示。GPIba的原料药物质(BDS)贮藏在4°C并且将结合活性的百分数作为时间的函数进行监测。示。试验样品包括未处理用于体内试验的未处理动物对照；LMW:低分子量的GPIba(典型截段)；加载在阴离子交换(AEX)柱分离前上载的对照样品；全部石危酸盐化全部石克酸盐化作用位点经石危酸盐化的GPIba;和非硫酸盐化硫酸盐化作用位点均未经硫酸盐化的GPIba。图9是来自狗Folts动物模型的体外数据和体内数据比较的图示。试验样品包括未处理用于体内试验的未处理的动物对照；单体完整的未经切割的GPIba单体；LMW1和LMW2:来自AEX柱分离的GPIba的低分子量级分；全部硫酸盐化全部硫酸盐化作用位点经硫酸盐化的GPIba;和非硫酸盐化硫酸盐化作用位点均未硫酸盐化的GPIba。图IO是在AEX-HPLC上分离的硫酸盐化同种型的图示。图11是在SEC-HPLC上通过大小分离的GPIba的同种型的图示。图12是GPIba测定法的可重复性和计算的变异百分数的图示。图13A是GPIbcr测定法与对照(Fcprtnl)的结合特异性的图示。图13B是GPIbcr测定法与对照(Fcprtn2和Fcprtn3)的结合特异性的图示。发明详述除非另外定义，本文中所用的全部技术术语和科学术语具有如本发明所属领域内一般技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文中所述的那些方法和材料相似的方法和材料可以用于实施或测试本发明，但是合适的方法和材料描述如下。本文中提及的全部出版物、专利申请、专利和其它参考文献完整地引用作为参考。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并且将不是限制性的。本发明的其它特点和优点将自详述、附图及自权利要求书中显而易见。缩写和定义本文中使用如下缩写"ATCC"意指美国典型培养物保藏中心，"vWF"意指冯*维勒布兰德因子，"GPIba"意指糖蛋白lb-a，"CHO"意指中国仓鼠卵巢细胞，"NIH3T3"意指国立卫生研究院3T3细胞。如本文中所用，术语"抗体"意指，而不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、基因工程抗体、双特异性抗体、抗体片段及代表抗体活性部分的单链。产生如上提及的每一抗体形式的方法在本领域内是众所周知的。如本文中所用，术语"生物学样品"意指，而不限于任何(原核或真核)细胞、任何组织或器官，或者其重组技术或遗传工程的任何产物。"生物学样品，，还可以是血浆样品、细胞培养上清液或来自纯化过程的緩冲液。在血浆的情况下，其来源可以是来自任何哺乳动物，包括但不限于猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、猪、狗、马和人。血浆是全血中的包含可溶解蛋白质的部分。备选地，该测定法可以在全血上实施，无需分离出血浆。细胞培养上清液可以分离自表达GPIba的任何细胞培养系。细胞系可以选自CHO细胞系、NIH-3T3细胞系或从ATCC得到的任意细胞系，任意的这些细胞系已经被操作以表达GPIba。如本文中所用，术语"同种型"意指，而不限于，低分子量(LMW)GPIba、高分子量(HMW)GPIbo(见图11)，GPIba的其它变体形式(Vl、V2、V3)和小分子，包括但不限于完全-危酸盐化或部分;危酸盐化的GPIba蛋白(见图10)。描述本发明是特异而灵敏地检测并定量生物学样品内GPIba或GPIba样杂质存在的方法。在一个实施方案中，测定法包括(a)提供包含GPIba的物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIba的结合蛋白接触；(c)添加对GPIba特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；和(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中阳性检测信号预示着生物学样品内存在GPIba。在一个实施方案中，包含GPIba的生物学物质可以是血浆、来自细胞系的上清液或緩冲液。在另一个实施方案中，血浆可以来源于选自猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、马和人的哺乳动物。上清液可以来自CHO细胞系、NIH-3T3细胞系或从ATCC得到的细胞系。在又一个实施方案中，对GPIba特异的检测化合物是抗体或者更优选地是抗体的Fab片段。在另一个实施方案中，对GPIba特异的结合蛋白是具有与以上抗体的活性结合位点不同的结合位点的蛋白质。在另一个实施方案中，对GPIba特异的结合蛋白是vWF的片段，如vWF的Al结构域。该片段可以是vWF的Al结构域的重组形式。备选地，对GPIba特异的结合蛋白是完整的vWF蛋白。在另一个方面，对GPIba特异的结合蛋白经过生物素酰化或经His标记。在又一个实施方案，结合步骤(d)中结合蛋白的复合物是链亲和素包被的磁珠或抗His抗体包净皮的磁珠。另一个实施方案涉及用化学发光物质标记的对GPIba特异的检测化合物。更具体地，对GPIba特异的抗体的Fab片段用化学发光物质标记。在另一个方面，检测与步骤(e)内结合蛋白结合的检测化合物还包含使化学发光物质暴露于光下并测量与GPIba的存在相关联的化学发光物质的激发。在本发明的又一个实施方案中，将链亲和素包被的磁珠放置而使其与生物素酰化的vWF接触，其中生物素酰化的vWF将与在分析物或生物学样品内的GPIba结合(图1)。将用化学发光物质标记的并对GPIba上另外的抗原位点特异的抗体与生物素酰化的vWF接触2小时(图1)。该步骤后，使磁珠与生物素酰化的vWF接触30分钟。该过程与ELISA不同，因为最多仅存在2个步骤并且不需要洗涤步骤。接触位点是在GPIba和vWF的Al结构域之间(图2)。检测结合的GPIba通过使全部复合体(由链亲和素包被的珠子、生物素酰化的vWF，GPIba和标记的GPIbot特异的化学发光抗体组成)暴露于光下并测量发射至检测器上的光信号而实施(图1)。在本发明的另一个实施方案中，用抗His抗体包被的磁珠替换链亲和素包,皮的>^珠。将这些珠子放置而使其与His标记的Al结构域接触，其中Al结构域将与生物学样品内的GPIba结合。抗体用化学发光物质标记并对GPIba上另外的抗原位点特异。检测结合的GPIba通过使全部复合体(由链亲和素包,皮的珠子、生物素酰化的vWF，GPIba和标记的GPIba特异的化学发光抗体组成)暴露于光下并测量发射至检测器上的光信号而实施(图1)。在本发明中，生物学样品或分析物可以选自但不限于血浆、细胞培养上清液或来自纯化过程的緩冲液。在血浆的情况下，来源可以是来自任何哺乳动物，包括但不限于猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、马和人。血浆是包含可溶解蛋白质的全血的部分。备选地，该测定法可以在全血上实施，无需分离出血浆。细胞培养上清液可以分离自表达GPIbot的任何细胞培养系。细胞系可以选自CHO细胞系、NIH-3T3细胞系或从ATCC得到的任意细胞系，任意的这些细胞系已经被操作以表达GPIba。包含GPIba的纯化緩沖液可以选自TRIS、TRIS氯化钠、甘氨酸、甘氨酸-氯化钠、乙酸钠、组氨酸緩沖液以及含氯化钠、蔗糖和Tween的组氨酸緩冲液。EDTA也可以用作分析物。本发明的另一个方面是测量生物学样品内GPIba的蛋白质浓度的方法，其包括(a)提供包含GPIba的物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIba的结合蛋白接触；(c)添加对GPIba特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；和(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中与已知标准曲线相比较的检测信号预示着生物学样品内GPIba的蛋白质浓度。在一个实施方案中，包含GPIba的生物学物质可以选自血浆、来自细胞系的上清液或緩沖液。在另一个方面，血浆可以来源于哺乳动物，包括，但不限于猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、马和人。上清液可以来自CHO细胞系、NIH-3T3细胞系或从ATCC得到的细胞系。在另一个实施方案中，对GPIba特异的检测化合物是抗体或者备选地是抗体的Fab片段。在另一个实施方案中，对GPIba特异的结合蛋白是具有与以上抗体的活性结合位点不同的结合位点的蛋白质。在另一个实施方案中，对GPIba特异的结合蛋白是vWF的片段，如vWF的Al结构域。该片段可以是vWF的Al结构域的重组形式。备选地，对GPIba特异的结合蛋白是完整的vWF蛋白。在另一个方面，对GPIba特异的结合蛋白经过生物素酰化或经His标记。在另一个方面，结合步骤(d)中结合蛋白的复合物是链亲和素包被的磁珠或抗His抗体包被的磁珠。在另一个实施方案中，对GPIba特异的抗体用化学发光物质标记。更具体地，对GPIba特异的Fab片段用化学发光物质标记。在本发明的另一个实施方案中，GPIba的蛋白质浓度如下测定，即用已知量的与vWF(图3)或与vWF的重组Al结构域(图4)结合的GPIba生成标准曲线并将来自未知生物学样品的光密度读数与已知标准物的光密度读数进行比较。将链亲和素包被的磁珠放置而使其与生物素酰化的vWF接触，其中生物素酰化的vWF将与分析物内的GPIba结合。抗体用化学发光物质标记并对GPIba上另外的抗原位点特异的。结合性GPIba的检测和定量通过使全部复合体暴露于光下并测量发射至检测器上的光信号而实施。随后将测量的值(光密度)与从已知标准物中产生的值比较并且可以外推出未知GPIba的浓度(图3和图4)。在本发明的另一个方面，经生物素酰化并用来结合生物学样品内GPIba的vWF可以是三种变体形式VI、V2和V3之一。全部三种变体形式具有超过vWF野生型形式的增加的结合活性，其中结合活性V3>V2>Vl(图5)。当测试变体形式结合A1的能力时，观察到相似的趋势，但是变体结合活性与总体结合活性之间的差异与完整vWF相比较不明显(图5)。在本发明的另一个方面涉及对照GPIba的低分子量(LMW)结合活性和高分子量结合活性(图6)。本发明的这个方面允许将GPIba与其它相近的同种型区分开，当在质量控制环境下产生并纯化GPIba时，本方法特别有意义。图6显示与野生型对照GPIba相比，GPIba的4种切割的不同LMW同种型(表示为截段产物)的差异性结合百分数。结合活性在测定法中下降至42.5%,并且对于无Fc部分或结合蛋白的其它LMW同种型，几乎没有产生信号，显示了将切割的分子与完整分子区分开的能力。在图7A和7B中，GPIba的原料药物物质(BDS)在4°C贮藏不同时间段。随着时间增长，样品的高分子量(HMW)百分数升高。在结合测定法中，在4。C贮藏较长时间的样品显示减少的结合活性。负相关允许使用本发明来监测样品内GPIba的。/。HMW的聚集水平(即具有高百分数的HMW的样品显示较低的结合活性)。在本发明的又一个方面，GPIba的石克酸盐化形式具有差异性结合活性；完全硫酸盐化的GPIba比非硫酸盐化的GPIba具有更高的结合活性(图8和图9)。本发明的另一个方面是计算生物学样品内GPIba的结合活性的方法，其包括:(a)提供包含GPIba的物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIba的结合蛋白接触；(c)添加对GPIba特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中与已知标准曲线相比较的检测信号预示着生物学样品内GPIba的蛋白质浓度；和(f)计算GPIba的结合活性。在一个方面，包含GPIba的生物学物质可以选自血浆、来自细胞系的上清液或緩沖液。在另一个实施方案中，血浆可以源于哺乳动物，包括但不限于猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、马或人。上清液可以源自CHO细胞系、NIH-3T3细胞系或从ATCC得到的细胞系。在另一个实施方案中，对GPIba特异的检测化合物是抗体或备选地是抗体的Fab片段。在另一个实施方案中，对GPIba特异的结合蛋白是具有与以上抗体的活性结合位点不同的结合位点的蛋白质。在另一个实施方案中，对GPIba特异的结合蛋白是vWF的片段，如vWF的Al结构域。该片段可以是vWF的Al结构域的重组形式。更优选地，对GPIba特异的结合蛋白是完整的vWF蛋白。在另一个方面，对GPIba特异的结合蛋白经过生物素酰化或经His标记。在另一个实施方案中，结合步骤(d)中结合蛋白的复合物是链亲和素包被的磁珠或抗His抗体包被的磁珠。对GPIba特异的检测化合物在本发明的某些方面中用化学发光物质标记。更具体地，对GPIba特异的Fab片段用化学发光物质标记。在另一个实施方案中，检测与步骤(e)内的结合蛋白结合的检测化合物还包括使化学发光物质暴露于光下并测量化学发光物质的激发，其中与已知标准曲线相比较时，所述的激发预示着GPIba的蛋白质浓度。在另一个实施方案中，步骤(f)的结合活性X通过(A/B)x100%计算，其中A是通过vWF相互作用对GPIboc所测定的蛋白质浓度，并且B是通过(但不限于)A蛋白HPLC或Fc捕获免疫测定法测定的蛋白质浓度。在本发明的又一个方面，GPIba的结合活性通过如下确定，即首先计算GPIba的浓度，随后应用式(A/B)xl00。/。，其中A是通过vWF相互作用对GPIba所测定的蛋白质浓度，并且B是通过(但不限于)A蛋白HPLC或Fc捕获免疫测定法对试验参考所测定的蛋白质浓度。这些优点明显地胜过当前的技术。可用的GPIba检测测定法包括体内方法和体外方法。先前才艮道用于测量GPIba-Fc蛋白活性的一种方法是在实施例4内所述的大鼠尾静脉出血模型。由于GPIba在凝血、尤其在凝固/出血级联中是必需，因此测量体内出血时间是测量GPIba活性的间接途径。使用该动物模型的缺点是其间接性、耗时、费力、昂贵和大的变异百分数(至少在30%范围)。先前才艮道的另一个方法是狗Folts动物模型。实施例5内描述的该方法专用于研究其中GPIba的功能被视为关键的不稳定性心绞痛。尽管该方法可以直接测量GPIbaFc的功能，它也伴随有包括时间、劳动力、成本和精确性在内的相同缺点。另一个用来检测GPIba结合活性的方法是表面等离子共振(SPR)测定法。此方法能够测量两种蛋白质之间的结合事件。然而，此方法极度费时并且灵敏性低。SPR测定法通常将对数差异1视为背景噪音。还测试了作为检测GPIba的可能测定法的常规ELISA。尽管ELISA消耗劳动力最小，但是结果的非特异性高并且变异大，特别是当捕获抗原是vWR时。本发明的重要方面将克服因处于多聚体形式的vWF的已知"粘稠性"带来在体外环境下使用它作为生理学相关试剂的困难。发明性步骤是开发均质结合反应以允许vWF在更天然的构象下而不是在固定化条件下与GPIba结合。捕获珠仅在反应最后30分钟才加入，^全部的混合物在最后温育后立即在读数仪上读数。采用这种设计，vWF很难有机会与其它的非特异性分子或表面结合。这是唯一能够特异而高效地测定GPIba活性的体外结合活性测定法。此外，作为对已建立的聚集、硫酸盐化作用测定法需要的替代，本测定法可以用来极为迅速并精确地监测已表达的GPIba-Fc融合蛋白。又一个优点是本发明篩选靶向GPIba的小分子的用途，因为本测定法对来自抑制剂的影响极为敏感。本发明的新测定方法具有胜过现存GPIba检测系统的数个优点(1)本文中所述的本发明利用一步骤或两步骤直接测定法，所述测定法测量GPIba并且仅需要一个测定GPIba活性的步骤。(2)本测定法使用对其捕获过程是特异的、明确的化学结合作用，而不是非特异性结合作用。(3)检测位点是使用电化学发光(ECL)技术的稳定位点。(4)循环利用检测底物，从而允许有效地放大读出信号。(5)本测定法无需洗涤步骤并且因此具有高的测定通量。(6)本测定法利用具有增强特异性的试剂并且因此具有最小基质干扰性。(7)本测定法利用具有增强特异性的试剂并且因此具有高灵敏性。(8)本发明的新测定系统提供比其它现存用于GPIba的检测测定法高2-5倍的信号对噪声比。(9)本发明的新测定系统拔_供跨2对数的显著线性标度。总体而言，与本领域可用的检测方法相比，提出的发明更快捷、更便宜、可重复性(见图12)、更特异(图13A和13B)、更灵敏并且能够将活性GPIba-Fc融合蛋白与非活性形式区分开(图5和6)。实施例制本文中所述并要求保护的本发明。本发明的如此变体，包括目前已知的或今后开发的全部等效物的替换(这处于本领域技术人员的能力范围内)，以及在配方上的改变或在实發没计上的细微改变，将视为处于本发明的范围内。实施例l:准备标准曲线标准曲线緩冲液通过添加15的R5CD1介质至30ml緩冲液(PBS,含0.05%、Tween20和0.5%BSA)产生。该緩冲液足够用于90个测定平板(基于96孔平板)。为制备标准物，将4pl标准物贮存液添加至20ml标准曲线緩冲液内。这提供0.2卩g/ml浓度的标准物。通过吸取2ml已制备的标准物并添加1ml标准曲线緩沖液而制备系列稀释物。此稀释物足够用于8个测定平板。在96孔平板内，每孔分配50;d。每一平板通过平板读数仪读数并将光密度(透光度)对已知标准物的浓度作图，生成标准曲线。实施例2:制备对照具有0.08pg/ml浓度的对照样品通过将20GPIba参考标准添加至105pl介质内得到。1^，通过吸取5W上ii^照并添加至10ml緩沖液内进行1:2000稀释。这足够用于18个测定平板(基于96孑L平板)。在96孔平板内，每孔分配50/d。实施例3:GPIba-vWF结合测定方案如下方案概述了检测并定量来自生物学样品内GPIba的水平的方法。该方案包括在检测GPIba的存在以及测量GPIba的蛋白质浓度和结合活性的过程内所用试剂、方法、设备和软件。在96孔微量滴定平板(Corning/Costar，Wilkes-Barre，PA)内以每孔50/d体积分配GPIba标准物(浓度1mg/ml;自制重组蛋白)。对照随后如上所述制备并每孔分配5(^1。为制备样品，从每一样品中吸取至少5W并在緩沖液内稀释样品至0.08和0.04/ig/ml，终体积约lml(制备至少500pi)并每孔分配50/d。为制备生物素-vWF，对每个测定平板每6ml緩冲液吸取2gl生物素-vWF贮存液(浓度1.31mg/ml，自制缀合物；vWF:AmericanDiagnostica，Greenwich,CT;生物素Pierce,Rockford，IL)。为制^^亲和素珠，添加192pl珠贮存液(浓度10mg/ml;来自IGEN，Bioveris，Gaithersburg，MD，或来自DynalBiotech,LakeSuccess,NY)至每个测定平板每6ml緩冲液并且每孔分配50/d。全部标准物和对照将稀释于R5CD1介质内。将试剂和样品才艮据如下方法在平板内分配添加50W标准物(0.2Ag/ml至0.005/tg/ml)、对照或样品；添加50/U终浓度0.4pg/ml(抗FcORI-TAG抗体，H&存浓度1.07mg/ml，原始材料来自JacksonImmunoResearch，WestGrove,PA的"Fq片段特异的亲和纯F(ab')2片段山羊抗人IgG")的抗FcORI-TAGAb。在添加标记抗体后，添加50的b-vWF(终浓度0.1gg/ml)和50/d的b-vWF(终浓度O.l/tg/ml)。在室温温育2小时并混合。温育后，添加50链亲和素缀合的珠子(终浓度16/tg珠/孔)并在室温温育30分钟，同时混合。微量滴定平板在M8或M384分析仪上读数。为使用M8或M384分析仪，首先必须校准。为实现校准，运行"水对照"96孔平板。通过添加250/iLRODi水至全部孔而制备96孔微量平板。将平板置于分析仪内，并启动平板读数仪。全部孔内的结果应当是相似的。其次，通过将250jttL阳性校准物添加至第1、2、3、7、8和12列中的孔内而制备96孔微量平板。将250]LiL阴性校准物添加至4、5、6、9、10和11列中的孔内。将平板置于分析仪内，并开启平板读数仪。如果信息;1精确的，继续对平板读数。若全部阳性校准物CV小于7%并且值是得数80,000±10%时，则质量控制(QC)是可接受的。在右边窗口内应该不显示警告消息。若QC处于这些指标之外，则查阅用户手册以寻找问题提示建议。一旦正确地校准机器，将含待测试样品的平板置于Stacker内，选择待运行的程序并启动平板读数仪。保存全部数据。为分析收集的数据，在MicrosoftExcel下打开文件并下载数据至Softniax-Pro。使用根据如下平板图建立起来的模板分析数据。如下代表用于该测定法的网格图。包括标准物(std)、对照和样品(S)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>标准物认可指标如下8个标准物中至少6个标准物在两个标准重复点间读数的CV应当40。/。。对照认可指标要求对照回收率需要在80%至120°/。范围内。样品认可指标要求重复样品间读数的CV应当40%。仅考虑范围内的读数。实施例4:大鼠尾静脉出血如下的实施例4戈表体内测定法，以测定GPIba的效力和所观察到的体外数据是否与体内试验相关。35只(35)雄性Wister大鼠(l-2月龄，200-230克；CharlesRiverLaboratoriesInternational,Inc.,Wilmington,MA)分成5组，每组7只动物。5个组大鼠才艮据下表接受不同的方案处理表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在大鼠夹内固定每只大鼠并使用灭菌刀片剃光毛发，距离大鼠后端基部1.5英寸在尾部4故皮下切口。同时，靠近切口部位静脉内注射相等剂量(体积根据每只大鼠体重变动)。在^15分钟内范围内，记录出血事件和凝结百分数。将每一组的数据进行平均，并且作图为平均值士标准差(SD)。如可以在图8内观察到，体内动物模型出血时间与体外结合测定结果相关。在图8中，未处理、LMW、加载、完全硫酸盐化和非硫酸盐化分别指GPIba的低分子量同种型、AEX(阴离子交换)柱中所用的原材料，6个石克酸盐化作用位点均被硫酸盐化和疏酸盐化作用位点均未被疏酸盐化的GPIba。图8显示本发明体外结合测定法与大鼠尾出血动物模型之间的相关性。实施例5:狗Folts动物模型如下实施例代表作为研究不稳定性心绞痛方面的模型被广泛接受的狗Folts动物模型。该模型可相当肯定地判断抗血小板剂和抗凝血剂在不稳定性心绞痛的临床环境下的成效。该模型涉及开胸制备并且包括分离冠状动脉左旋支。将超声流量探头放置在该动脉上并实时监测动脉血液流量。重度狭窄和血管损伤的双重伤害引起血小板堆积;5Uk栓形成。当动乐^f皮完全阻塞时，如零血流量显示，通过震动阻塞性血栓机械性地破坏血小板栓。通过冠状动脉血流量(CFR)的周期性流量减少监测重复的血栓形成。当观察到5个连续CFR时，治疗性地施用GPIba和其它用于比较的因子。以尺度0-4记录反应(图9)。在图9中，未处理、单体、LMW、加载、完全石克酸盐化和非石克酸盐化分别指未处理的GPIba、未切割的GPIba、GPIba的低分子量同种型、AEX(阴离子交换)柱中所用的原材料，6个石克酸盐化作用位点均被硫酸盐化的和硫酸盐化作用位点均未被硫酸盐化的GPIba。与图8相似，图9显示本发明和可用的体内测定系统之间显著相关。本文中所引用的全部参考文献在本文中完整地并且以相同程度地引用作为参考用于全部目的，如同每个出版物或专利申请#1特别地和单独地提及以便完整地引用作为参考用于所有目的。当引用作为参考的出版物和专利或专利申请至如此程度而与本说明书内包含的公开相抵触时，该说明书将优于和/或在先于任何此类相抵触的材料。将表述本说明书和权利要求书内所用成分的量、反应条件等的全部数字在任何情况下理解为受术语"约，，修饰。因此，除非明确地说明，否则说明书和后续权利要求书内描述的数字参ltA概数，其可以根据由本发明意图得到的所需特性而变化。至少，并且不意图将等效物原理的应用限于权利要求书的范围内，每个数字^t应当根据有效数字位数和常用约数方法进行解释。可以产生本发明的众多修改和变体而不脱离本发明的精神和范围，这对于本领域技术人员是显而易见的。本文中所述的具体实施方案仅以举例的方式提供并且无论如何不意图是限制性的。本说明书和实施例将应当仅视为是举例，本发明的真实范围和精神将通过如下权利要求书指出。权利要求1.检测生物学样品内GPIbα存在的方法，包括(a)提供包含GPIbα的物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIbα的结合蛋白接触；(c)添加对GPIbα特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；和(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中阳性检测信号预示着生物学样品内存在GPIbα。2.权利要求1所述的方法，其中包含GPIba的生物学样品是血浆。3.权利要求2所述的方法，其中血浆来自哺乳动物。4.权利要求3所述的方法，其中哺乳动物是人。5.权利要求1所述的方法，其中包含GPIba的生物学样品来自细胞系的上清液。6.权利要求5所述的方法，其中细胞系是CHO细胞系。7.权利要求l所述的方法，其中检测化合物包含抗体。8.权利要求7所述的方法，其中检测化合物包含Fab片段。9.权利要求1所述的方法，其中结合蛋白包含具有与权利要求7所述抗体的结合位点不同的结合位点的蛋白质。10.权利要求9所述的方法，其中结合蛋白是冯.维勒布兰德因子(vWF)的片段。11.权利要求10所述的方法，其中片段是vWF的Al结构域。12.权利要求9所述的方法，其中结合蛋白是完整的vWF蛋白。13.权利要求l所述的方法，其中结合蛋白是经生物素酰化的。14.权利要求11所述的方法，其中vWF的Al结构域是经His-标记的。15.权利要求13所述的方法，其中完整的vWF是经生物素酰化的。16.权利要求1所述的方法，其中与结合蛋白结合的复合物是链亲和素包纟皮的磁珠。17.权利要求1所述的方法，其中与结合蛋白结合的复合物是抗His抗体包,皮的磁珠。18.权利要求7所述的方法，其中对GPIba特异的检测化合物用化学发光物质标记。19.权利要求8所述的方法，其中对GPIba特异的Fab片段用化学发光物质标记。20.权利要求1所述的方法，其中对步骤(e)内的检测化合物的检测还包括使化学发光物质暴露于光下并测量化学发光物质的激发。21.测量生物学样品内GPIba的蛋白质浓度的方法，包括(a)提供包含GPIba的物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIba的结合蛋白接触；(c)添加对GPIba特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；和(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中与已知标准曲线相比较的检测信号预示着生物学样品内GPIba的蛋白质浓度。22.权利要求21所述的方法，其中对检测化合物的检测还包括使化学发光物质暴露于光下并测量化学发光物质的激发，与已知标准曲线相比较的激发预示着GPIba的蛋白质浓度。23.检测生物学样品内GPIba的结合活性的方法，包括(a)提供包含GPIba的物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIba的结合蛋白接触；(c)添加对GPIba特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中与已知标准曲线相比较的检测信号预示着生物学样品内GPIba的蛋白质浓度；和(f)计算GPIba的结合活性。24.权利要求23所述的方法，其中(f)的结合活性X通过(A/B)xl00。/。计算，其中A是通过vWF相互作用对GPIbot所测定的蛋白质浓度，并且B是通过A蛋白HPLC或Fc捕获免疫测定法测定的蛋白质浓度。25.测量生物学样品内GPIba同种型的结合活性而检测GPIba同种型的方法，包括(a)提供包含GPIba的物质和GPIba样物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIba的结合蛋白接触；(c)添加对GPIba特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中与已知标准曲线相比较的检测信号预示着生物学样品内GPIba的蛋白质浓度；①计算GPIba同种型的结合活性；和(g)将同种型的结合活性与已知GPIba对照的结合活性相比较。26.权利要求25所述的方法，其中(f)的结合活性X通过(A/B)x100%计算，其中A是通过vWF相互作用对GPIba所测定的蛋白质浓度，并且B是通过A蛋白HPLC或Fc捕获免疫测定法测定的蛋白质浓度。全文摘要本发明提供用于检测生物学样品内GPIbα的存在、浓度和结合活性的新测定系统。用于确定生物学样品内GPIbα的存在的方法包括(a))提供包含GPIbα的物质；(b)使来自步骤(a)的物质与结合GPIbα的结合蛋白接触；(c)添加对GPIbα特异的检测化合物；(d)添加结合来自步骤(b)的结合蛋白的复合物；和(e)检测来自步骤(c)的检测化合物，其中阳性检测信号预示着生物学样品中存在GPIbα。文档编号G01N33/86GK101176000SQ200680013504公开日2008年5月7日申请日期2006年4月21日优先权日2005年4月22日发明者J·H·周申请人:惠氏公司