专利名称：使用细胞叶酸维生素受体定量法而用于癌症预后的方法
技术领域：
本发明涉及通过定量确定维生素受体在癌细^^中表达的水平来用 于获得癌症预后的方法和试剂盒，并涉及指导控制或研制用于癌症的有 效疗法。本发明还涉及用于测定癌细月包上维生素受体存在的方法和试剂 盒，以筛选应当通过利用维生素受体靶向术的疗法进行治疗的患者。
背景和概要
癌症的有效治疗方案常常取决于获得可靠预测癌症的能力，因此可 研制适于患者的最有效治疗方案。临床上重要的优先顺序在于提高预测 癌症的能力和研制基于分子的治疗法，以改进对患者的管理和治疗。在 确定最适治疗方案中，关键在于对确诊患有癌症的患者属于预测组进行 确定，因此这决定了患者的存活率。
例如在北美洲中，乳腺癌是最常见的确诊危急生命的恶性肿瘤。在 美国，乳腺癌是30-50岁女性死亡的主要原因，并且美国每年有出现超 过200,000个新病例。尽管还在使用胂瘤分级(Tumor grade)、核分级 (nuclear grade)、组织类型、DNA倍数性以及激素受体状态，但肿瘤大 小和淋巴节状况(nodal status)仍然是预测结果的最可靠方法。仅仅已经 鉴定了几种乳腺癌的肿瘤标记物，并且那些标记中的多数不足以可靠来 用于预测分析中。因此，迫切需要适于乳腺癌和其它癌症的更好的预测 分析法。
此外，筛选应当通过特殊疗法进行治疗的患者，可取决于检测肿瘤 表面上的胂瘤标记物的存在的能力，因此可测定靶向肺瘤标记物的疗法 是否是保险的。例如，在约25%的乳腺癌症患者中发生人表皮生长因子 受体2(HER2)的过表达。已经研制了针对HER2蛋白的单克隆抗体 Herceptin (Genentech,Inc.,San Fmncisco,CA)， 以4乍为乳&泉癌疗法。然
而，并不将Herceptin⑧施用于乳腺癌症患者，直到确定了乳腺癌症患者 的HER2状态为止。如果乳腺癌症患者是HER2阳性，那么许可进行 Herceptin⑧治疗。
维生素受体在癌细胞中是过表达的。例如，高亲合性叶酸受体被鉴 定为胎盘和滋养层细胞中的抗原所决定的单克隆抗体的膜相关糖蛋 白。高亲合性叶酸受体在最普通细胞中是很少表达的，或是无法检测 的。然而，它在上皮细胞源的癌中是过表达的或优先表达的，也许这提 供了适于这些恶性细胞的生长优势。在〉90%的卵巢癌中，可检测到叶 酸受体的高水平表达，但在子宫内膜癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、脑癌、 子宫癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌和结肠直肠癌、淋巴瘤及其它头颈癌 中，检测到叶酸受体表达的较低阳性度。
例如，根据所用的技术和所分析的组织，通过研究叶酸受体在乳腺 癌中的表达，已经获得了不同的结果。Ross等人测量了叶酸受体 mRNA,发现与正常乳房样本相比，5种癌中的叶酸受体的mRNA水平 提高。然而，提高程度比在卵巢癌中所观察到的水平低了约十倍(Ross 等,Cancer73:2432-2443(1994))。 Garin-Chesa等人使用小鼠单克隆抗体 LK26，以评价叶酸受体在各种新冻癌中的表达。研究了其中53个乳腺 癌，两个显示同质的LK26染色，另九个癌显示脂肪染色(Garm- Chesa 等，Am.J.Pathol.142(2)557-67(1993))。
申请人已经研究了维生素受体在癌细胞中的过表达的用途，以分析 用于获得癌症的预测法和用于指导控制或研制适于患者的有效疗法。该 方法利用确定维生素受体在癌细胞中的过表达量。申请人还研究了确定 癌细胞中维生素受体存在的方法的用途，以筛选应当通过利用维生素受 体靶向术的疗法进行治疗的患者。
在本发明的一个例证性实施方案中，通过定量测定维生素受体在癌 细胞中的表达，提供了确定癌症预后的方法。该方法的步骤包括定量测 定维生素受体在癌细胞中的表达，和确定癌症预后。在另一个例i正性实 施方案中，维生素受体是叶酸受体。在另一个实施方案中，癌细胞是乳 腺癌细胞，或者癌细胞选自卵巢癌细胞、子宫癌细胞、子宫内膜癌细胞、 结肠直肠癌细胞、脑癌细胞、肾癌细胞、淋巴瘤细胞以及肺癌细胞。在 癌细胞是乳腺癌细胞的实施方案中，乳腺癌包括淋巴结(node)阴性疾 病，但本发明不限于淋巴结阴性疾病。该方法的步-豫还包括确定适于癌的治疗方案。
在另一个例证性实施方案中，定量测定的步骤包括使用抗体，进行 免疫组化染色。在该实施方案中，抗体是多克隆抗体或其混合物，或者 是单克隆抗体或其混合物，或者是多克隆抗体和单克隆抗体的组合。可 替代的或另外的，定量测定的步骤包括使用应用了放射性标记配体的放 射受体分析，进行原位杂交或受体定量。
在本发明的另 一 个例证性实施方案中，提供了确定癌症预后的免疫 组化方法。该方法的步骤包括将癌细胞接触耙向维生素受体的抗体、定 量测定维生素受体在癌细胞中的表达，和确定癌症预后。在一个例证性 实施方案中，维生素受体是叶酸受体。在另一个实施方案中，癌细胞是 乳腺癌细胞。在该实施方案中，乳腺癌是淋巴结阴性疾病，但本发明不' 限于淋巴结阴性疾病。在另一个实施方案中，癌细胞选自卵巢癌细胞、 子宫癌细胞、子宫内膜癌细胞、结肠直肠癌细胞、脑癌细胞、肾癌细胞、 黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞以及肺癌细胞。
在其它例证性实施方案中，抗体是多克隆抗体或其混合物，或者是 单克隆抗体或其混合物，或者是多克隆抗体和单克隆抗体的组合。
在另一个实施方案中，提供了确定适于所筛选的癌症患者的治疗方 案的方法，以通过利用维生素受体靶向的疗法而进行治疗。该方法的步 骤包括将来自患者的癌细胞接触靶向维生素受体的抗体、定量测定维生 素受体在癌细胞中的表达，和确定适于癌症患者的治疗方案。
在本发明的另 一个例证性实施方案中，提供了用于确定癌的预测法 的原位杂交法。该方法的步骤包括将癌细胞接触核酸探针、定量测定维 生素受体在癌细胞中的表达、以及确定癌症预后，其中核酸〗笨针杂交编 码维生素受体的核酸或杂交与维生素受体的编码核酸互补的核酸。
在一个例证性实施方案中，维生素受体是叶酸受体。在另一个实施 方案中，癌细胞是乳腺癌细胞。在该实施方案中，乳腺癌包括淋巴结阴 性疾病，但本发明不限于淋巴结阴性疾病。在另一实施方案中，癌细胞 选自卯巢癌细胞、子宫癌细胞、子宫内膜癌细胞、结肠直肠癌细胞、脑 癌细胞、肾癌细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、'淋巴瘤细胞以及 肺癌细月包。
在本发明的另 一 个例证性实施方案中，提供了确定癌症预后的方 法。该方法的步骤包括将癌细胞接触结合配体的放射性标记维生素受体 或其类似物、定量测定维生素受体在癌细胞中的数量，和确定癌症预 后。
在一个例证性实施方案中，维生素受体是叶酸受体。在另一个例证 性实施方案中，癌细胞是乳腺癌细胞。在该实施方案中，乳腺癌包括淋巴结阴性疾病，但本发明不限于淋巴结阴性疾病。在另一实施方案中， 癌细胞选自卵巢癌细胞、子宫癌细胞、子宫内膜癌细胞、结肠直肠癌细胞、脑癌细胞、肾癌细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞以及肺癌细胞。在另一个例证性实施方案中，放射性标记配体是放射性标记叶酸或其类似物。
在本发明的另一个例证性实施方案中，提供用于实施免疫组化染色 分析的试剂盒。试剂盒包括校准显微照片，其中校准显微照片来自用维生素受体抗体染色过的癌组织。在一个例证性实施方案中，试剂盒还包 括维生素受体的抗体。在另一个实施方案中，试剂盒还包括用于免疫组化染色的试剂。在另一个实施方案中；试剂盒包括用于校准显微照片和用于实施免疫组化染色分析的说明书。
在本发明的另一实施方案中，提供用于实施原位杂交荧光分析的试 剂盒。在该例证性实施方案中，试剂盒包含校准显微照片，其中校准显微照片来自癌组织，而癌组织的核酸已经与荧光标记的核酸探针进行原 位杂交。核酸探针杂交编码维生素受体的核酸，或者探针杂交互补于维 生素受体的编码核酸的核酸。在另一个实施方案中，试剂盒还包含荧光标记的核酸探针。在另一个实施方案中，试剂盒包含用于原位杂交的试剂。在另一个实施方案中，试剂盒包含用于校准显微照片和用于实施荧光原位杂交分析的说明书。
在另一个例证性实施方案中，提供用于实施维生素受体结合分析的 试剂盒。在该例证性实施方案中，试剂盒包含可确定癌细胞上的维生素受体数量范围的校准表，其中该范围与癌的有效结果对比无效结果有关。在另一个例证性实施方案中，试剂盒还包含放射性标记的维生素受 体结合配体，或其类似物。在另一个例证性实施方案中，试剂盒还包含用于实施维生素受体结合分析的试剂。在另一个例证性实施方案中，试剂盒还包含用于实施维生素受体结合分析的说明书。
附图简述
图1显示在包含细粒状弱斑点的乳腺癌细胞中，叶酸受体的强度1 + 免疫组化斑点。
图2显示在包含粗粒状斑点的乳腺癌细胞中，叶酸受体的强度2+免疫组化斑点。
图3显示在包含浓密度粗粒状的乳腺癌细胞中，叶酸受体的强度3+ 免疫组化斑点。
图4显示疾病复发对比叶酸受体染色平均强度的实例。
图5显示用叶酸受体a的单克隆抗体(mAb 343;组A和组B )来 免疫组化染色胰腺癌的实例。组A和组B显示柱细胞(空箭头)的顶端 表面的膜染色，组B显示柱细胞(实箭头)的粒状细胞质染色。组C显 示通过非免疫的mlgGl进行切片温育。
图6显示用叶酸受体cc的单克隆抗体(mAb 343; A组和B组)来 免疫组化染色子宫内膜(endometnod)癌的实例。组A和组B显示在腺状 上皮细胞中的明显的细胞质和顶膜染色(空箭头)。未染色表示腺体(组 B中的实箭头)之间的基质。组C显示通过非免疫的mlgGl进行切片温 育。
图7显示用叶酸受体oc的单克隆抗体(mAb 343;组A和组B )来 免疫组化染色子宫颈鳞状细胞癌的实例。显示了鳞状细胞的集中细胞质 染色(组B中的空箭头)。组C显示通过非免疫的mlgG!进行切片温育。
详细i兌明
通过定量测定维生素受体在癌细胞中的表达和通过指导控制或研 究用于癌症的有效疗法，提供用于预测癌症的方法和试剂盒。还提供用 于确定维生素受体在癌细胞中存在(即检测维生素受体)的方法和试剂 盒，以筛选应当通过利用维生素受体靶向术的疗法进行治疗的患者。在 例证性实施方案中，维生素受体是叶酸受体，癌细胞选自卵巢癌细胞、 子宫癌细胞、子宫内膜癌细胞、结肠直肠癌细胞、脑癌细胞、肾癌细胞、 黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、'淋巴瘤细胞以及肺癌细胞。可通过外 科手术从患者切除该方法中所用的癌组织。在癌细胞是乳腺癌细胞的实 施方案中，乳腺癌包括淋巴结阴性疾病，但本发明不限于淋巴结阴性疾 病。该方法可在原发性恶性物质上进行实施，并具有用于新陈代谢疾病 的预测价值。
在其它例证性实施方案中，通过使用例如免疫组化染色法、荧光原位杂交法、Southern印迹法、斑点印迹杂交、利用了》欠射性标记配体的 放射受体分析法等等的方法，确定维生素受体的表达量。在使用了免疫 组化染色法的实施方案中，所用的抗体是多克隆抗体或其混合物，或者 是单克隆抗体或其混合物，或者是多克隆抗体和单克隆抗体的组合。
还在其它的例证性实施方案中，提供了使用任何上述特征的免疫组 化染色法或原位杂交法或利用了放射性标记配体的放射受体分析。
在本发明的另 一 个例证性实施方案中，提供用于实施免疫组化染色 分析的试剂盒。试剂盒包含校准显微照片，其中校准显微照片来自用维 生素受体抗体染色过的癌组织。在一个例证性实施方案中，试剂盒还包 含维生素受体的抗体。在另一个实施方案中，试剂盒还包含用于免疫组 化染色的试剂。在另一个实施方案中；试剂盒包含用于校准显微照片和 /或用于实施免疫组化染色分析的说明书。
还在本发明的另一个实施方案中，提供用于实施荧光原位杂交的试 剂盒。在该例证性实施方案中，试剂盒包含校准显微照片，其中校准显 微照片来自癌组织，而癌组织的核酸已经与荧光标记的核酸探针进行原 位杂交。核酸探针杂交编码维生素受体的核酸，或者探针杂交互补于维 生素受体的编码核酸的核酸。在另一个实施方案中，试剂盒还包含荧光 标记的核酸探针。在另一个实施方案中，试剂盒包含用于原位杂交的试 剂。在另一个实施方案中，试剂盒包含用于校准显微照片和/或用于实施 荧光原位杂交分析的说明书。
1在另一个例证性实施方案中，提供用于实施维生素受体结合分析的 试剂盒。在该例证性实施方案中，试剂盒包含可确定癌细胞上的维生素 受体数量范围的校准表，其中该范围与癌的有效结果对比无效结果有 关。在另一个例证性实施方案中，试剂盒还包含放射性标记的维生素受 体结合配体，或其类似物。在另一个例证性实施方案中，试剂盒还包含 用于实施维生素受体结合分析的试剂。在另一个例证性实施方案中，试 剂盒还包含用于校准表和/或用于实施维生素受体结合分析的说明书。
根据本发明，如本文中所用的"定量测定"或"定量"，意味着确 定维生素受体在癌细胞上的数量，或意味着确定维生素受体在癌细胞中 直接或间接表达的水平。在实施例5、 8、 9和10中描述了如本文中所 用的"定量测定"或"定量"的含义实例，其中将免疫组化染色(实施例5、 8和9)定义为染色强度l + 、 2+或3+。例如，对于荧光原位杂交 (FISH),通过统计胞核中的表示维生素受体基因存在的信号、并将维生 素受体基因的信号量与未进行扩增的基因的信号量进行比较，得到扩增 基因的信号与未扩增基因的信号(实施例10)的比值，从而对维生素受 体基因的扩增进行定量。对于扩增HER-2/new基因的定量法，所述的方 法是本领域中已知的。例如，"定量测定"或"定量"还意谓着通过使 用利用了放射性标记配体的维生素受体结合分析(实施例11),确定癌 细胞上维生素受体的绝对量。
需要本文所述的"定量"类型，使得医生根据通过维生素受体结合 分析所测定的免疫组化染色强度或荧光强度或受体数量，可对患者分 组，例如"有效结果，，组或"无效结果"组，这以便医生确定适于患者 的最有效的治疗方案。高染色强度是与无效结果相关(例如2+或3+免 疫组化染色强度或荧光强度)，并且所述的患者应当接收主动治疗方 案。
本发明的方法和试剂盒可用于人临床医学和兽医学用途。可单独使 用本文所述的方法和试剂盒，或者联合其它的预测方法、或预测指示物 (例如本文所述的指示物)、或预测试剂盒、或用于研制适于癌的有效 疗法的试剂盒进行使用本文所述的方法和试剂盒，或者联合用于确定癌 细胞上维生素受体的存在的方法或试剂盒进行使用本文所述的方法和 试剂盒，以筛选应当通过利用了维生素受体靶向术的疗法进行治疗的患 者。当单独使用维生素受体表达而不使用另 一种预测指示物以确定预测 法时，维生素受体表达被认为是独立的预测因子。
癌细胞是致癌的癌细胞群体，包括良性胂瘤和恶性肿瘤(如，转移 性)，或癌细胞是非致癌的。癌细胞群体可自发出现的，或通过宿主动体是化学性、病毒性、i放射性诱导的。本发明可用于获;寻适:或检测癌上的维生素受体的预测法，癌例如是癌瘤、肉瘤、'淋巴瘤、霍奇金病 (Hodgekin，s disease, HD)、黑素瘤、间皮细胞瘤、Burkitt淋巴瘤、鼻咽 癌、白血病以及骨髓癌(如，多发性骨髓瘤)。癌细胞群体包括但不限 于，脑癌、口腔癌、甲状腺癌、内分泌癌、皮肤癌、胃癌、食道癌、子 宫内膜癌、喉癌、其它头颈癌、胰腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、 骨癌、卵巢癌(如血清、子宫内膜样以及粘蛋白样的)、子宫颈癌、子
宫癌、乳腺癌、睾丸癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肝癌、以及肺癌(如， 恶性腺瘤和间皮细胞瘤)，或任何过表达维生素受体的其它癌。
例如，已知在前述段落中的多数癌种类是维生素受体阳性的(参见Ross等，Owcer 73: 2432- 2443 (1994); Garin-Chesa等，J附.尸^/2。/. 142(2): 557-67 (1993); Franklin等，/献，/. Qwce厂 S甲/ /. 8: 89-95 (1994); Li等，./ A^wc A/e^. 37:665-672 (1996); Toffoli, /献Owcer 74: 193-198 (1997); Veggian, r画r 75:510-513 (1989); Weitman等， 7 e^^/x'/z 52: 3396-3401;以及Bueno等，./. 7Tzo厂.Ow/. Swk 121: 225-233 (2001))。
作为获得癌症预后的结果所研制的治疗性方案包括，例如，在下列 出版物中所述的维生素受体靶向疗法或这些疗法的组合美国专利申请
发明者C·P·利蒙, L·C·哈特曼, P·R·埃利斯, P·S·罗 申请人:普渡研究基金会;恩多塞特公司;梅奥医学教育和研究基金会