专利名称：结核抗原的检测分析及疫苗的制作方法
结核抗原的检测分析及疫苗
相关申请
本申请要求申请日为2005年7月1日、名称为"结核抗原 才t测分析及疫苗"的美国临时申请No.60/696439的优先权，并且 要求申请日为2005年9月14日、名称为"结核抗原检测分析及 疫苗"的美国临时申请No.60/717062的优先权。上述申请的全部 内容在oHi通过引i正并入本文。
政府支持
本发明得到了来自于世界卫生组织的No.TDA30469A号拨 款和来自于全国卫生研究会No.NIH AI43529号拨款的全部或者 部分支持。政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
全世界有多于三分之一的人感染过结核分枝杆菌，该细菌能 够导致结核(TB)疾病。每年，有八百万人感染结核，两百万人 死于结核疾病。结核给发展中国家带来了4艮大的影响，也症会世界 上的发达地区带来了日益严重的困扰。
感染了结核的患者可能在相当长的一段时间内是无症状的， 可能处于结核疾病的潜伏期。当到达活性期时，结核疾病通常表 现为肺部的急性炎症，并导致发烧以及千咳。如果不接受治疗， 通常会导致严重的并发症以及死亡。现有的it断检测通常不够准
确，不能够辨别出病人是处于疾病的潜伏期还是处于疾病的活性 期。
当前，接种活细菌是一种对人体进行免疫以抵抗结核疾病的 方法。然而，接种带有某些活细菌的结核疫苗的方法在一些国家 中引起了争i义，包4舌美国，因此该方法没有在美国进4亍广;乏的4吏 用。除此之外，很多时候，当前的诊断测试不能区分哪些人是经 过免疫的，哪些人是感染了结核的。
有效的4秦种疫苗以及对疾病进行准确的早期诊断，对于疾病 的控制是4艮重要的。因此，需要一种有效的诊断4全测，能够探测 到结核细菌产生的活性感染。进一步的需要一种疫苗，所述疫苗 不需要使用活细菌，并且能够提供针对该疾病的保护性免疫原性 应答。
发明内容
本发明涉及分离的多肽分子，所述多肽分子具有结核分枝杆 菌抗原的免疫原部分，或者具有所述抗原的变体的免疫原部分， 其中所述变体的区别仅^义在于发生了保守性替代和/或修饰。所述
抗原具有序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、 序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、序列 26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、序列38、 序列40、序列42、序列44、序列46、序列48所示的氨基酸序 列、或者具有上述序列的组合所形成的氨基酸序列；或者具有由 核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述核酸分子具有序列1、序 列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序 列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、 序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序歹'J 43、序列45、序列47所示的序列、或者上述序列的组合所形成
的序列；或者该核酸分子具有序列1、序列3、序列5、序列7、 序列9、序歹'J 11、序歹'J 13、序歹'j 15、序歹'J 17、序歹'J 19、序列21、 序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列 35、序歹'J 37、序歹'J 39、序歹'J 41、序歹'J 43、序歹'J 45、序歹'J 47的 编码区域、或者上述序列的组合的编码区域；或者所述核酸分子 具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序歹'J 13、 序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列 27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序歹'J 39、 序列41、序列43、序列45、序列47的互^卜序列、或者上述序列 的组合所形成的序列的互补序列；或者该核酸分子具有与序列1、 序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、 序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列 29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、 序歹'J 43、序歹'J45、序列47进行杂交的序列、或者与上述序列的 组合进行杂交(例如，在高度严格的条件下)的序列。在一种实 施方式中，所述分离的多肽分子刺激宿主或者动物(例如，人类， 鼠类，猪，山羊，猴子)体内的免疫原性特异性结核(TB)应答。 在另外一种实施方式中，本发明包括一种分离的多肽分子，所述 多肽分子具有结核分枝杆菌抗原的免疫原部分，其中所述的抗原 包4舌由核酸分子编码的氨基酸序列，该序列与上述提及的序列中 的任意一个序列具有大于或者等于70%的序列同一性(例如，大 约80%的序列同一性，90%的序列同一性，大约95%的序列同 一性)。在一种实施方式中，本发明包括分离的多肽分子，该分 子中的氨基酸序列与上述提及的序列具有大于或者等于70 %的 序列相似性(例如，大约80%的序列相似性，大约90%的序列 相似性，大约95 %的序列相似性)。
本发明进一步描述了分离的核酸分子，所述的核酸分子编码 含有结核分枝杆菌抗原的免疫原部分的多肽分子，或者编》马含有
该抗原的变体的免疫原部分的多肽分子，其中所述的变体的区别仅仅在于发生了保守性替代和/或修饰。编码所述抗原的核酸分子
具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、 序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列 27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、 序列41、序列43、序列45、序列47所示的序列、或者上述序列 的组合所形成的序列；或者该核酸分子具有序列1、序列3、序 列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序 列 19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、 序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列 45、序列47的编码区i或、或者上述序列的组合的编码区域；或 者所述核酸分子具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、 序列11、序列13、序列15、序列'17、序列19、序列21、序列 23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、 序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47的互补 序列、或者上述序列的组合所形成的序列的互补序列；或者该核 酸分子具有与序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、 序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列 25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序歹'J 37、 序列39、序列41、序列43、序列45、序列47进4亍杂交的序列、 或者与上述序列的组合进行杂交(例如，在高度严格的条件下) 的序列；或者所述核酸分子具有编码序列2、序列4、序列6、序 列8、序列10、序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、 序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列 34、序歹列 36、序列38、序列 40、序列 42、序列 44、序列 46、 序列48的序列、或者上述序列的组合所形成的序列。所述的分 离的核酸分子编码多肽分子，该多肽分子能够刺激免疫原性特异 性结核应答。本发明还包括分离的核酸分子，所述的核酸分子编 石马含有结核分枝杆菌抗原的免疫原部分的多肽分子，其中多扁码该 列同一'〖生(例如，大约80%的序列同一4"生，90%的序列同一性， 大约95°/。的序列同一性)。在一种实施方式中，本发明包4舌编码 多肽分子的核酸分子，所述核酸分子的序列与上述提及的序列具 有大于或者等于70%的序列相似性(例如，大约80%的序列相 似性，大约90%的序列相似性，95 %的序列相似性)。
本发明的另外一种实施方式包4舌含有上述核酸分子或者编 码上述多肽分子的载体、质4立以及宿主细力包。所述的宿主细月包可 以是任何细胞，包括大肠埃希氏杆菌，酵母以及哺乳动物细胞。 除此之外本发明还包括在严格条件下(例如，高度严格或者中度 严格条件)与上述的核酸分子进行杂交的探针。
本发明包括与上述多肽分子中的一个或者一个以上相结合 的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体，或者是多克隆抗体。本发 明还涉及融合蛋白，所述融合蛋白包4舌上述的一个或者一个以上 核酸分子(例如，两个多肽分子)。除了本发明所述的多肽分子 之外，所述融合蛋白也可以包括其他结核分枝杆菌抗原，包括那 些存在于主要组织相容性复合体(MHC) 2级分子中的抗原(例 如，CD4+T细胞途径结核抗原)。
本发明包括刺激个体中的特异性免疫原性结核应答、预防或 者緩解结核疾病的严重程度的方法，该方法向个体施用一定量的 上述多肽分子或者核酸分子(例如，以载体形式)。在另一个方 面，本发明包4舌含有上述多肽分子或者核酸分子的组合物(例如， 疫苗组合物或者药物组合物)，所述多肽分子或者核酸分子存在 于生理可接受载体中。上述组合物还可以包括免疫应答增强剂 (例如，佐剂，另外一种结核抗原，免疫刺激性细胞因子或者趋 化因子)，或者可以与免疫应答增强剂一同施用。佐剂的例子包
括3D-MPL (3脱-O-酰化-单磷酰脂A)以及QS21。上述组合 物可以;故制成水包油乳剂的形式。
本发明进一步描述了在个体中治疗结核疾病的监控方法。该 方法包括在来自于所述个体的样品中探测上述一种或者一种以 上结核分枝杆菌抗原多肽的水平；并且与标准水平进行比较。高 于标准水平的结核抗原肽水平表明该治疗是无效的，而低于或者 等于标准水平的水平表明该治疗是有效的。监控治疗的方法也可 以包4舌在一个或者一个以上时间点上(例如，在治疗开始时的第 一时间点上或者初始时间点上，以及在治疗开始之后的第二时间 点上)#1测样品中的 一 种或者 一 种以上如上所述的结核抗原肽的 水平，并且将上述时间点上探测到的水平进行比较。肽水平的增 加表明该治疗是无效的，而肽水平的降l氐或者不变则表明该治疗 是有效的。
本发明包括在个体中诊断结核疾病的方法，该方法#罙测如上 所述的一种或者一种以上多肽分子是否存在，或者探测上述一种 或者一种以上多肽分子的水平。本发明的诊断检测也能够区别患 有活性结核疾病的个体以及对结核产生免疫的个体。该方法包 括在个体中探测如上所述的一种或者一种以上多肽分子是否存 在，或者探测如上所述的一种或者一种以上多肽分子的水平，并 且测定该个体中的结核特异性免疫应答刺激。如果来自于个体的 样品中不存在上述多肽分子，并且在个体中存在结核特异性免疫 应答，则表明该个体已经获得了针对结核疾病的一定程度的免 疫，而没患有该疾病。对结核特异性免疫应答刺激的测量包括测 量来自于个体样品中的细胞扩增，白细月包介素-12的生成，干扰 素-Y的水平，或者上述测量的组合。
在另外一种实施方式中，本发明包4舌探测生物才羊品中的结核 分枝杆菌感染的方法，通过检测该样品中是否存在如上所述的多
肽分子来实现该方法。存在上述一种或者一种以上多肽分子，则
表明存在结核分枝杆菌感染；不存在上述一种或者一种以上多肽 分子，则表明不存在结核分枝杆菌感染。特别的，该方法包括将 才羊品与结合于所述多肽分子的抗体(例如，可4罙测的标记抗体) 相4妄触，^吏样品与抗体充分接触形成复合体，从而得到抗原-抗 体复合体；然后探测所述抗原-抗体复合体。上述复合体的存在 则表明结核分枝杆菌感染的存在，上述复合体的不存在则表明结 核分枝杆菌感染的不存在。在一个方面，该方法进一步包括将样 品与另外一个抗体相接触的步骤，所述的另外一个抗体对上述抗
原或者抗原-抗体复合体具有特异性。上述多肽或者抗体可以结 合在固体载体上，上述生物才羊品可以是尿液，血液，唾液，脑脊 髓液，或者组织样品。
4果测生物样品中的结核分4支杆菌感染的方法也可以包4舌在 聚合酶链式反应中使该样品与至少两个寡核苷酸引物进行接触， 其中至少一个寡核苦酸引物(例如，至少大约IO个连续的石威基) 对于这里所迷的一种或者一种以上分离的核酸分子是具有特异 性的，能够充分允许该引物进行扩增；并且探测该样品中扩增的 核酸序列。如果存在任何一种扩增的核酸序列，则表明结核分枝 杆菌感染的存在，如果不存在任何一种扩增的核酸序列，则表明 结核分枝杆菌感染的不存在。探测生物样品中的结核分枝杆菌感 染的另外 一 种方法包括在高度严格的条件下使该样品与 一 种或 者一种以上寡核苷酸探针(例如，至少大约15个连续的碱基) 进行接触，所述寡核苷酸探针对这里所述的核酸分子具有特异 性，使样品与探针进行充分的杂交；然后探测样品中与寡核苷酸 探针杂交的核酸分子。如果存在探针的杂交，则表明存在结核分 枝杆菌感染，如果不存在探针的杂交，则表明不存在结核分枝杆 菌的感染。
进一步的，本发明包括用以诊断人体中是否存在结核分枝杆 菌感染的试剂盒。所述试剂盒包括一种或者一种以上用于探测这 里所述的一种或者一种以上多肽分子或者核酸分子的试剂。这类 试剂可以包括那些用来进行酶联免疫吸附测定、快速免疫色语测
定、流式细胞术分#斤、或者》文射性免疫4企测的试剂。所述的试剂 盒可以包括一种或者一种以上核酸分子，所述核酸分子具有序列 1、序列3、序列5、序列7、序列9、序歹'J 11、序歹'J 13、序列15、 序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列 29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、 序歹ij 43、序歹ij 45、序列47所示的序列、或者上述序列的组合所 形成的序列；或者具有上述序列的互补序列，以及与序列1、序 列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序 歹'J 17、序歹'J 19、序歹'J 21、序歹'J 23、序歹寸25、序歹'J 27、序列29、 序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列 43、序列45、序列47、或者上述序列的组合所形成的序列进4亍 杂交的核酸序列；所述试剂盒中还含有探测试剂。所述的试剂盒 可以包括其他试剂例如固体载体，以及探测剂(例如，信息基团， 如放射性同位素，荧光基团，发光基团，酶，生物素以及染色粒 子；与接合剂共轭连接的信息基团例如抗免疫球蛋白，蛋白G， 蛋白A以及外源凝集素)。
本发明的优点有通过提供一种有效的疫苗组合物，从而提 供了预防或者减轻结核疾病的严重程度的新方法。本发明的检测 4吏得对尿'液的检测变得筒单和容易，从而有效的辨别出患有活性 结核的患者与非患病患者。新的疫苗组合物以及更加有效的i貪断 检测将有助于緩解现存的世界范围内的结核困扰。
附
图1A-1G的示意图表示的是氨基酸序列(粗体部分)(序 列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列 15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、 序列29以及序列31)以及相应的结核分枝杆菌多肽序列(并且体 部分)(序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、序 歹'J 14、序歹'J 16、序歹'J 18、序列20、序列22、序列24、序列26、 序列28、序列30以及序列32),上述序列是乂人感染有结核分斗支 杆菌的小鼠的巨噬细胞中的主要组织相容性复合体1级分子中洗 提出来的。附图中还描述了来自于结核分斗支杆菌的类核酸序列以 及类多肽序列，它们与上述被分离的序列具有100%的同源性。
附图1H的图表表示的是结核分枝杆菌肽序列序列2、序 列6、序列10、序列14、序列18、序列22以及序列26，上述序 列是乂人感染有结核分枝杆菌的小鼠的巨噬细胞中的主要组织相 容性复合体1级分子中洗提出来的。该附图还表示出染色体组研 究学会(TIGR)的注释，Swiss-Prot数据库的命名，以及这些 蛋白的名称。
附图2的示意图表示的序列30的粗体部分部分是一种肽， 所述的肽是在患有肺结核的病人尿液中发现的，以及它的相应的 氨基酸序列序列29。该附图也表示了 DNA序列(序列31 )以 及它的相应的蛋白序列(序列32)，所述蛋白是发现于结核分枝 才干菌的类亚钼嘌呤生物合成蛋白，其与序列30具有100%的同源 性。
附图3的示意图表示的是主要组织相容性复合体1级分子相 关肽的纯化和测序方法，上述肽是从结核分枝杆菌感染型巨噬细 胞中分离得到的。
附图4表示的是用于在样品中探测本发明所述的结核抗原的 免疫色"i普测定方法的 一 个实施例。
附图5的图表表示的是结核分枝杆菌肽序列序列34，序列 38，序列42以及序列46,上述序列发现于肺结核患者的尿液中 以及结核分枝杆菌供体蛋白中。
附图6A-B的示意图表示的是核酸序列(净且体部分和下划线 部分)(序列33)以及相应的结核分枝杆菌多肽序列(粗体部分 和下划线部分)(序列34)，上述序列发现于肺结核患者的尿'液当 中。该附图还描述了来自于结核分枝杆菌的高丝氨酸氧乙酰转氨 酶核酸序列以及多肽序列(分別为序列35和序列36)，上述序列 与净皮分离的序列具有100%的同源性，该附图以表格的形式表示 了染色体组研究学会(TIGR)给出的位点名称，最初位点名称， Swiss-Prot数据库中的命名，推定的识别，基因符号，TIGR症会出 的细胞功能，坐标，DNA分子名称，基因长度，蛋白长度，分 子量，pl, GC百分含量，酶学委员会命名#，属以及种。
附图7A-C的示意图表示的是核酸序列(粗体部分和下划线 部分)(序列37)以及相应的结核分枝杆菌多肽序列(粗体部分 和下划线部分)(序列38)，上述序列发现于肺结核患者的尿液当 中。该附图还描述了来自于结核分4支杆菌的染色体隔离蛋白smc 核酸序列以及多肽序列(分别为序列39和序列40)，上述序列与 被分离的序列具有100%的同源性，该附图以表格的形式表示了 染色体组研究学会(TIGR)给出的位点名称，最初位点名称， Swiss-Prot数据库中的命名，推定的识别，基因符号，TIGR给出 的细胞功能，坐标，DNA分子名称，基因长度，蛋白长度，分 子量，pl, GC百分含量，酶学委员会命名#，属以及种。
附图8A-B的示意图表示的是核酸序列(粗体部分和下划线 部分)(序列41)以及相应的结核分4支杆菌多肽序列(粗体部分 和下划线部分)(序列42),上述序列发现于肺结核患者的尿液当 中。该附图还描述了来自于结核分枝杆菌的鸟氨酸氨基甲酰转移 酶核酸序列以及多肽序列(分别为序列43和序列44)，上述序列 与4皮分离的序列具有100%的同源性，该附图以表格的形式表示 了染色体组研究学会(TIGR)给出的位点名称，最初位点名称， Swiss-Prot数据库中的命名，推定的识别，基因符号，TIGR给出 的细胞功能，坐标，DNA分子名称，基因长度，蛋白长度，分 子量，pl, GC百分含量，酶学委员会命名#,属以及种。
附图9A-B的示意图表示的是核酸序列(4且体部分和下划线 部分)(序列45)以及相应的结核分枝杆菌多肽序列(粗体部分 和下划线部分)(序列46),上述序列发iE见于肺结核患者的尿液当 中。该附图还描述了来自于结核分枝杆菌的磷酸腺苷磷酸硫酸酐 还原酶核酸序列以及多肽序列(分另iJ为序歹'J 47和序列48)，上述 序列与^皮分离的序列具有100%的同源,1"生，该附图以表格的形式 表示了染色体组研究学会(TIGR)给出的位点名称，最初位点 名称，Swiss-Prot数据库中的命名，推定的识别，基因符号，TIGR 给出的细胞功能，坐标，DNA分子名称，基因长度，蛋白长度， 分子量，pl, GC百分含量，酶学委员会命名#，属以及种。
附图10是一个Western印迹图〗象，表示的是来自于大肠杆菌 裂解物的重组MT1694、 MT2462以及MT2990的过表达和纯化， 其中所述的大肠杆菌裂解物来自于非诱导培养(l号泳道)；来自 于异丙基-13 - D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的培养(2号泳 道)；以及纯化的重组蛋白(3号泳道)，以及分子量标记物 (MWM )。
附图11是一个Western印迹图4象，表示的是对结核分枝杆菌 完整细胞粗裂解物中的天然MTB1694以及MT2462的识别(1 号泳道)；培养滤液(CF)蛋白(2号泳道)；纯化的重组蛋白(3 号泳道)；以及分子量标记物(MWM),其中对抗原进行电泳分 析，并且将其转移至硝酸纤维素膜，之后使用兔类抗MTB1694 抗血清或者抗MT2462抗血清对其进行4罙测。
附图12A的柱形图表示的是扩增性应答对MT1694以及 MT2462的识别，用每分钟计数(CPM)来表示，该扩增性应答 来自于健康的纯蛋白衍生物H吏用纯蛋白衍生物对针对结核蛋白 的应答进行皮下测试)阴性(供体1)个体以及纯蛋白衍生物阳 性(供体2-5)个体，上述个体经过了重组抗原(5微克/毫升) 的刺激。
附图12B的柱形图表示的是外周血单个核细胞(PBMC)中 干扰素-Y的生成对MT1694以及MT2462的识别，所述的外周 血单个核细胞来自于健康的纯蛋白衍生物阴性(供体1)个体以 及纯蛋白衍生物阳性(供体2-5)个体，上述个体经过了重组抗 原(5微克/毫升)的刺激。
具体实施例方式
以下是关于本发明的优选实施方式的描述。
本发明涉及用于结核(TB )疾病的疫苗组合物以及免疫检测。 本发明部分基于下述发现当宿主被一种能够引起结核的细菌感 染时，在主要组织相容性复合体(MHC) 1级巨噬细胞中会出现 某些结核抗原肽，这种细菌净皮称为结核分枝杆菌。主要组织相容 性复合体(MHC) 1级巨噬细胞是在CD8+T细胞免疫应答途径 中起作用的细胞。构成本发明的基础的另外一个发现是在感染
了活性结核的人的尿液中识别出结核肽的存在。对存在于主要组 织相容性复合体1级细胞中的特异性抗原结核肽的识别，以及对 存在于^皮感染患者的尿液中的结核肽的识别，为生产有效的疫苗 和/或进行诊断试验提供了多肽序列。
本发明的结核疫苗组合物可以包4舌多肽序列或者核酸序列， 并且，^壬选的，包括其他免疫增强分子。因此，本发明的一部分 涉及发现的特异性抗原结核多肽序列，这些序列如附图1、附图
2、以及附图5-9中所示的序列2、序列4、序列6、序列8、序 列10、序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、 序列24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列 36、序列38、序列40、序列42、序列44、序列46、序列48以 及上述序列的组合。序列2、序列6、序列10、序列14、序列18、 序列22以及序列26是通过^f吏用大剂量的结核分枝杆菌对小鼠进 行感染的方法而分离的。在小鼠被感染后的大约两周，根据实施 例1中详细描述的方法，将小鼠的脾脏摘除，并且分离出含有 CD8+T细胞抗原的主要组织相容性复合体1级分子。在主要组织 相容性复合体1级分子中发现的大量的肽被鉴定为是结核分枝杆 菌的来源。序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、 序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列 25以及序列27,这些编码上述#:识别的多肽的核酸序列，在附 图1A-附图H中^皮表示出来。
序列30， MVIIELMRR，是在患有肺结核的患者的尿液中发 现的肽，该序列与结核分枝杆菌生物合成蛋白——序列32具有 100%的同源性，如附图2所示。编码上述蛋白的核酸序列—— 序列31也如图所示。除此之外，附图5-附图9中所示的序列 34、序列38、序列42以及序列46也是在患有肺结核的患者的尿 液中发工见的，这些序列分别与序列36、序列40、序列44以及序
列48具有100%的同源性。用来在感染了活性结核的患者的尿液 中识别这些结核蛋白的方法在实施例2中有所描述。
因此，本发明涉及序列1-序列48,这些序列被鉴定为能够 有效的引发针对结核的保护性免疫应答，并且能够有效的被用于 -珍断才企测当中，以识别患有活性结核的患者。
多肽及其功能
本发明涉及分离的多肽分子，所述的多肽分子包括存在于被 感染宿主的主要组织相容性复合体1级分子中的结核序列的抗原 性部分，也涉及从被感染患者的尿液中分离得到的结核序列。本 发明包4舌含有任意一种抗原性结核氨基酸序列(序列2、序列4、 序列6、序列8、序歹'J 10、序歹'J 12、序列14、序列16、序歹'J 18、 序列20、序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列
32、 序列34、序列36、序列38、序列40、序列42、序列44、 序列46、序列48、或者上述序列的组合)。参见附图1、附图2、 以及附图5-附图9。本发明还涉及由序列1、序列3、序列5、 序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、 序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列
33、 序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、 序列47所示的核酸序列或者由上述序列的组合所形成的核酸序 列编码的多肽分子。
这里4吏用的"多肽"包含任何长度的氨基酸链，包括全长蛋 白(即，抗原)，其中所述的氨基酸残基通过共价肽键相结合。 因此，包4舌结核分枝杆菌抗原的免疫原部分的多肽可以完全由所 述的免疫原部分组成，也可以含有其他序列。所述的其他序列可 以来自于自身的结核分枝杆菌抗原，也可以是异源的，并且这类 序列可以(但不必须)是免疫原性的。通常，这里所述的多肽在
本质上是纯化的。优选的，所述的多肽至少大约80%是纯化的， 更优选至少大约90%是纯化的，最优选至少大约99%是纯化的。
本发明所说的"分离的，，抗原性结核多肽指的是那些跟多肽 相同来源的其他蛋白及细胞材料进行分离了的多肽。分离的抗原 性结核多肽，这些由结核分枝杆菌的感染而形成的肽，包括本质 上纯的蛋白，化学合成得到的蛋白，生物合成和化学合成方法的 组合得到的蛋白，以及通过重组方法得到的蛋白。本发明所述的 蛋白可以使用实施例中描述的步骤进行分离，并且按照其物理性 质被定义，并使用实验室技术来完成蛋白的纯化。这些技术包括， 例如，盐析法，免疫沉淀法，柱层析，高效液相色谱法或者电泳 法。
本发明的组合物以及方法也包括上述多肽以及DNA分子的 变体。这里使用的多肽"变体"指的是与上述多肽的区别仅仅在 于发生了保守性替代和/或修饰而得到的多肽，这样一来，多肽的 治疗特性、抗原性特性和/或免疫原特性都被保留下来。特异性结 核分枝杆菌抗原的变体因此会刺激针对于上述抗原的细胞扩增 和/或Thl细J包中的干护C素-Y的上升。多肽变体优选的表玉见出 与被指定的多肽具有至少大约70 %的同源性，更优选具有至少大 约90%的同源性，最优选具有至少大约95%的同源性。对于具 有免疫反应特性的多肽来说，变体也可以通过如下方式进行识 别对一种多肽的氨基酸序列进行修饰，并且对修饰后的多肽的 免疫反应性进行评价。可以通过例如这里描述的代表性方法对这 类修饰后的多肽进行制备和检测。
这里使用的"保守性替代"指的是一种氨基酸被另外一种性 质相似的氨基酸所替代，这样一来，本领域技术人员能够预期， 多肽的二级结构以及亲水特性在本质上不发生变化。通常，下列 氨基酸基团表现为保守性改变(1)丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸， 谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，丝氨酸，苏氨酸；(2) 半胱氨酸，丝氨酸，酪氨酸，苏氨酸；(3)缬氨酸，异亮氨酸， 亮氨酸，曱硫氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸；(4)赖氨酸，精氨酸， 组氨酸；以及(5)苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，组氨酸。
变体还含有、或者只含有其他修饰，包括氨基酸的缺失和添 加，这类缺失和添加对多肽的抗原性、二级结构以及亲水特性产 生最小的影响。例如，可以在多肽的N末端蛋白上共轭结^^个 信号序列(或者前导序列)，上述序列能够与翻译一同(co-translationally )或者在翻译后(post — translationally )介导蛋白6々 转移。也可以将上述多肽共扼结合到 一个连接体或者其他序列 上，4吏所述多肽易于^皮合成、纯4匕或者识别(例如，聚组氨酸)， 或者加强该多肽与固体载体的结合。例如，可以将多肽共扼结合 于免疫球蛋白Fc片段上。
本发明也包括结核蛋白和多肽及其变体，或者包括那些具有 与这里描述的抗原性结核多肽的氨基酸序列相类似的氨基酸序 列的多肽。这样的多肽在这里净皮称为抗原性结核类似物(例如， 同系物)，或者诱变物或衍生物。"类似的"或者"同源的"氨基 酸序列指的是与任意 一 种结核氨基酸序列具有足够的同 一 性的 氨基酸序列，因而其具有任意一种天然结核多肽所具有的生物活 性(例如，引发针对结核细菌的保护性免疫应答的能力)。例如， 可以通过氨基酸序列的"沉默，，变化来生产类似的多肽，上述氨 基酸序列中的一个或者一个以上氨基酸残基不同于任意一种结 核蛋白中的氨基酸残基，但其仍然具有结核蛋白的功能或者生物 活性。这种差别的例子包括结核氨基酸序列残基的添加、缺失或 者取代。本发明还包括类似的多肽，与本发明所述的任意一种结 核蛋白相比，上述多肽表现出更强或者更弱的生物活性。这类多 肽可以通过在本发明所述的分离的结核分子上进行一个或者一
个以上氨基酸残基或者核酸残基的i秀变(例如，取代，缺失或者 添加)来获得。可以4吏用本发明描述的方法以及本领域已知的方
法来完成这些i秀变。4争别的，本发明涉及同源性多肽分子，所述 分子与序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、序 歹'J 14、序歹'J 16、序歹ij 18、序列20、序列22、序列24、序列26、 序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、序列38、序列 40、序歹'J42、序歹'J44、序歹'J46、序歹'J 48、或者上述序歹'J的纟且合 所形成的序列具有至少大约70% (例如，75%, 80%, 85%， 90 %或者95%)的序列同一性或者序列相似性。"同一性"百分数 指的是在两个核苷酸序列或者氨基酸序列之间存在的相同的核 苷酸或者氨基酸的数量。这里使用的"相似性百分数"指的是在 两个氨基酸序列之间存在的相似氨基酸或者保守氨基酸的数量。
本发明所述的多肽包4舌那些有助于刺激针对结核的免疫原 性特异性免疫应答或者保护性免疫应答的全长序列、部分序列、 功能性片段以及同系物。这里使用的"免疫原性"指的是能够引 发例如人类的患者体内、或者生物样品中的免疫应答(例如，细 ^ 的)的能力。特别的，具有免疫原性的抗原(以及抗原的免疫 原部分)能够刺激包4舌一种或者一种以上细胞(例如，t细月包， NK细胞，B细胞以及巨噬细胞)的生物样品中的细胞扩增，白 细月包介素-12的生成和/或干护C素-y的生成。这样的细月包来自 于结核分枝杆菌免疫型个体。如上所述的抗原的免疫原部分可以 《吏用这里描述的^t术进行制备和鉴定。其他技术，例如在Paul 于1993年在Fundamental Immunology, 3rd ed., Raven Press, pp.243-247 (《免疫学基础》，第3版，Raven出版社，243-247页) 中的文章以及该文章引用的参考文献中4既述的#支术，也可以祐J吏 用。这类4支术包4舌对天然抗原的多肽部分的免疫原性进4于篩选。 在这类检测中，多肽的免疫原部分产生的免疫应答(例如，扩增， 干才尤素-y的生成和/或白细力包介素-12的生成)与全长4元原产 生的免疫应答在本质上是相似的。换句话说，在这里描述的模型 扩增4企测中，抗原的免疫原部分产生的扩增占全长抗原产生的扩
增的至少大约20%,优选大约100%。在才莫型4佥测中，免疫原部 分也可以、或者可以刺激干护G素-Y和/或者白细月包介素-12的 生成，其生成量占全长抗原刺激产生的生成量的至少大约20 % , 优选大约100%。这里使用的"结核"或者"结核疾病"指的是 由结核分枝杆菌的感染而引起的疾病。
可以使用本领域技术人员已知的方法确定同源性多肽。可以 使用例如BLAST网络服务器在NCBI(美国国立生物技术信息中 心)针对GeneBank、 EMBL以及SwissProt tt据库进4亍初始的同 源性才全索。参见Altschuler, S.F.等人(于1990年)在J.Mol.Biol. (《分子生物学杂志》)215: 403中发表的文章；Altschuler， S.F. (于1998年)在Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)25: 3389- 3402 中发表的文章。可以4吏用Genetics Computing Group ( GCG, 8.0 片反本)软件的MOTIFS子程序和FindPattems子程序来完成核苦 酸序列的计算才几分4斤。根据Higgins和Sharp描述的方法来完成 蛋白和/或核苦酸的比对(参见Higgins, D.G以及Sharp, P.M. 于1998年在Gene《基因》73: 237 — 244中发表的文章，例:i口， 使用缺省参数)。
除此之外，本发明所述的各种分离的多肽是具有生物活性或 者功能性的，并且也在细菌中起到不同的作用。例如，如序列6 所示的分离的多肽是一种谷氨酰胺转运-争膜蛋白ABC转运蛋白。 同样的，序列22所示的是一种阳离子氨基酸转运膜本体蛋白， 而序列26所示的是一种阳离子转运P型腺苦三磷酸斷ATPase )。 序列32所示的是一种亚钼噪呤生物合成蛋白。本发明包4舌上述 分离的氨基酸序列的片段，这些片段仍然具有所述序列的功能或 者生物活性。例如，可以〗吏用熟知的实-验室方法来i殳计和表达包
括抗原性结核蛋白的缺失型变体的多肽片段。可以按照本发明的 描述对这些多肽片#炎、同源性多肽或者相似性多肽进行评价。
本发明也包括上述抗原性结核多肽的生物活性衍生物或者 类4以物，在这里^皮称为才莫拟肽。可以^吏用本领域^支术人员已知的
才支术i殳计并且制备才莫拟肽(例如参见美国专利Nos.4612132; 5643873以及5654276)。这些才莫拟肽可以以例如特异性结核氨基 酸序列为基础，并且保留了相应氨基酸序列上的相应位置。这些
且与相应的抗原性结核氨基酸序列相比李支而言，这些才莫拟肽还具 有一种或者一种以上下述特性的"生物进步性，，溶解性，稳定 性，以及水解和蛋白质水解灵敏性。
制备模拟肽的方法包括修饰N末端氨基，C末端羧基，和/ 或4夺肽中的一个或者一个以上酰胺键变为非酰胺4囊。可以在一种 模拟肽分子中进行两种或者多种这样的修饰。对肽进行修饰以获 得模拟肽的方法在美国专利Nos.5643873以及5654276中有所描 述。本发明包含的其他形式的抗原性结核多肽包括那些"功能性 等价物"。这里使用的术语"功能性等价物"指的是模拟结核多 肽的生物活性和/或结核多肽的功能性结构域的任何核酸序列及 其编码的氨基酸。
结核核酸序列，质粒，载体以及宿主细胞
本发明在一种实施方式中包括分离的核酸分子，所述的核酸 分子具有如序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、 序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列 25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、 序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的序列、或 者上述序列的组合所形成的序列。参见附图1、附图2、附图5
-附图9。本发明包括那些在附图1、附图2、附图5-附图9中 戶斤示的序列，以及这些序列的编石马区&戈。
这里使用的术语"DNA分子，，或者"核酸分子"包括正义链 和反义链，cDNA，染色体组DNA，重组DNA, RNA，以及全 部或者部分合成的核酸分子。核苷酸"变体，，是一种区别于上述 核苷酸序列的序列，这种区別在于发生了 一个或者一个以上核苷 酸的缺失、取代或者添加。可以使用标准的诱变技术很容易的导 入这些修饰，例如使用寡核苷酸指导的定点诱变4支术，该项纟支术 在例如Adelman等人(于1983年在DNA2: 183中)发表的文章 中有所教导。核苷酸变体可以是自然形成的等位基因变体，也可 以是非自然形成的变体。变体核苷酸序列优选的与正常序列具有 至少大约70%的同源性，更优选的具有至少大约80%的同源性， 最优选的具有至少大约90%的同源性。在严格条件下，这类变体 核苷酸序列通常会与正常的核苷酸序列发生杂交。在一种实施方 式中，"严格条件，，指的是在6倍的SSC和0.2%的SDS (十二 烷基磺酸钠)溶液中预清洗；在65。C时，在6倍的SSC和0.2。/。 的SDS (十二烷基磺酸钠)中杂交过夜；在65。C时，使用1倍 的SSC和0.1 %的SDS (十二烷基磺酸钠)洗涤两次，每次洗涤 30分钟，之后在65。C时，使用0.2倍的SSC和0,1 %的SDS (十 二烷基磺酸钠)洗涤两次，每次洗涤30分钟。
本发明也包4舌那些编码结核多肽的分离的核酸序列，特别 的，包4舌那些编石马具有序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、 序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、序列 24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、 序列38、序列40、序列42、序列44、序列46、序列48戶斤示的 氨基酸序列、或者具有上述序列的组合所形成的氨基酸序列的多 肽分子的分离的核酸序列。这里也进一步的描述了上述结4亥核酸
序列编码的多肽，所述的多肽能够刺激针对结核分枝杆菌的保护 性免疫应答，和/或在上述职能中发挥作用。
核苷酸序列通常(例如，在天然形式中)具有侧翼基因或者 侧翼核苷酸序列(例如，在染色体中序列中)，但这里4吏用的"分 离的"基因或者核苷酸序列不构成核苷酸序列的侧翼基因或者侧
翼核苷酸序列，和/或已经从其他转录序列(例如，在cDNA文 库或者RNA文库中)中^皮完全纯化或者部分纯化出来。因此， 分离的基因或者核苷酸序列可以包4舌通过4匕学方式或者重组方 式进4亍合成的基因或者核苷酸序列。存在于载体中的核酸构建体 也包4舌在本发明所述的"分离的"的定义之内。分离的核苷酸序 列还包括重组核酸分子和异源宿主细胞，以及存在于溶液中的部 分或者全部的或者纯化的核酸分子。本发明所述的体内RNA转 录体以及体外RNA转录体也包含在"分离的，，核苷酸序列之内。 这类分离的核苷酸序列能够作为4笨针#1有效的用于#1编码的4元 原性结核多肽的生产当中，用来分离同源序列(例如，从其他种 类的哺乳动物或者其他生物体中)，用于基因定位(例如，通过 原位杂交)，或者用来探测细胞或者组织中相关基因的存在(例 ^口，通过Southern印迹分才斤)或者表达(例j口，通过Northern 印迹分析)。
本发明所述的抗原性结核核酸序列包4舌同源的核酸序列。 "类似的"或者"同源的"核酸序列指的是与结核核酸序列中的 任意一种序列具有充分同一性的核酸序列，这样一来，当该序列 -故编码至多肽中时，它们具有上述抗原性结核多肽中的任意一种 所具有的生物活性。例如，可以对序列进行"沉默，，改变来制备 类似的核酸分子，改变后的序列与上述结核多肽中的4壬意一种具 有一个或者一个以上不相同的核苷酸，尽管如此，当将改变后的 序列编码至多肽中时，其仍然具有功能性或者生物活性。这类改
变的例子包括添加、缺失或者取代。本发明还包括编码类似多肽 的核酸序列，所述的多肽与本发明中的结核蛋白相比，表现出更 强或者更弱的生物活性。特别的，本发明涉及一类核酸分子，所
述的核酸分子与序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列 11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、 序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列 37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47或者上述序 列的组合所形成的序列具有至少大约70% (例如，75%, 80%， 85%, 90%或者95% )的序列同一'J"生。
本发明进一步描述的核酸分子包括全长序列、部分序列、功 能性片段以及同系物， 一旦被编码至多肽中时，它们将引发特异 性免疫原性结核应答，或者具有多肽的功能。可以使用本领域技 术人员已知的方法确定同源性核酸序列，也可以-使用本发明描述 的方法，包4舌那些用于确定同源性多肽序列的方法。然后，可以 4吏用例如Edman化学法之类的^支术对免疫抗原进行测序。参见
80: 116- 132中发表的文章。
本发明还包括与编码抗原性结核多肽的DNA序列在本质上 互补的核酸序列、DNA或者RNA,本领域技术人员已知，这些 核酸序列、DNA或者RNA能够在严格条件下与编码抗原性结核 多肽的DNA序列进行特异性杂交。这里定义的"本质上互补" 指的是该核酸不必要表现出与结核序列准确一致的序列，但必须 与结核核酸序列充分的相似，使其能够在高度严格的条件下与结 核核酸序列进行杂交。例如，非互补碱基可以交替分布于核香酸 序列中，或者核苷酸序列可以长于或者短于结核核酸序列，保证 上述序列与结核序列具有足够数量的互4卜碱基，以允许两者进行 杂交。严格条件在例如Ausubel, F.M.等人(于1994年，Current
Protocol)所著的文章Current Protocols in Molecular Biology (《分 子生物学当代规程》)，以及Brown等人(于1993年)在Nature (《自然》)366: 575发表的文章中有所描述；该条件也可以在某 些试-验中被进一步定义。
本发明也包括核酸分子，染色体组DNA, cDNA, RNA或者 它们的组合物，其中上述物质与本发明所述的DNA序列在本质 上互补，并且能够在充分严格的条件下(例如，高度严格)与抗 原性结核核酸序列进4亍特异性杂交，来识别具有足够的相同核酸 的DNA序列。
本发明也包括通过合成方法或者重组方法制备的结核分枝 杆菌抗原的部分或者其他变体。具有少于大约100个氨基酸的合 成多肽的制备方法，以及通常具有少于大约50个氨基酸的合成 多肽的制备方法是本领域技术人员熟知的技术。例如，可以使用 任意 一 种商业可获得的固相技术来合成这种多肽，例如使用 Merrifield (梅里菲尔德)固相合成方法，其中氨基酸神皮按顺序的 添加到增长的氨基酸链中。参见Merrifield于1963年在 J.Am.Chem.Soc.85: 2149 - 2146中发表的文章。自动合成多肽的 装置可以从才是供者处购买获得，例如从Applied BioSystems， Inc., Foster City, Calif.(应用生物系统公司，福斯特市，加利福尼亚) 处购买，并且可以根据使用说明书进行操作。可以使用标准的诱 变技术来制备天然抗原的变体，例如通过寡核苷酸指导的定点"i秀 变技术。还可以使用标准技术去除DNA序列的片段，来制备截 4豆型多肽。
在另外一种实施方式中，本发明包括在高度严格或者中度严 格条件下杂交于序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列 11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、 序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列
37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的结核 序列上的、或者上述序列的组合所形成的结核序列上的核酸分子 (例如，探针或者引物)。在一个方面，本发明包括那些具有至少 大约20个连续核普酸长度或者更长(例如，50, 100, 200, 300, 400， 500, 600， 700， 800， 900， 1000， 1100, 1200， 1300， 1400， 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700， 2800， 2900, 3000, 3100, 3200, 3300， 3400, 3500, 3600， 3700, 3800， 3900,或者4000)的分子，或者包括 那些杂交于至少大约20个连续核苷酸长度或者更长(例如，50， 100, 200， 300， 400， 500， 600， 700， 800, 900， 1000， 1100， 1200, 1300, 1400， 1500， 1600， 1700， 1800, 1900， 2000， 2100， 2200， 2300, 2400， 2500， 2600, 2700， 2800， 2900， 3000， 3100， 3200， 3300, 3400, 3500, 3600， 3700， 3800, 3900，或者4000) 的分子。这类分子能够在高度严格的条件下杂交于一种结核核酸 序列之上。本发明包"fe这类分子，以及编码具有这里所述的功能 或者生物活性的多肽的分子。
通常情况下，核酸探针包括一个核酸序列(序列1、序列3、 序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、 序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列 31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、 序列45、序列47,或者上述序列的组合序列)，并且具有足够的 长度和互补性，能够特异性的杂交于编码结核抗原多肽的核酸序 列之上。例如，核酸探针可以具有结核核酸序列长度的至少大约 5%, 10%, 20%, 30%， 40%, 50%, 60%， 70%, 80%或者 90 % 。本领域技术人员可以4艮容易的确定所需的足够长度和互补 性。本发明也描述了适当的杂交条件(例如，高度严格的条件)。 除此之外，本发明包括这里所述的多肽的片段或者编码多肽的核 酸序列，其中所述的多肽具有这里所述的结核多肽的生物活性。
这类片段能够作为探针或者作为试验工具被有效应用于本 发明描述的检测当中，如果是核酸片段的话，可以作为引物被应 用。 一种优选的实施方式包括引物和探针，它们能够特异性的杂 交于编码任意一种结核多肽的核酸构建体之上。例如，编码本发 明所述的任意一种结构域的核酸片段也包含在本发明的范围之 内。
杂交的严格条件指的是能够使一个核酸序列与另一个核酸 序列进4亍杂交的温度和緩冲组合物，这个条件取决于进行杂交的 两个序列之间的同一性程度。因此，"高度严格的条件，，指的是 只有非常相似的核酸序列之间才能进行杂交的条件。在中度严格 的条件下进行杂交的序列可以具有较小的相似性。如果在低度严 格的条件下进行杂交，进行杂交的两个序列之间可以具有更小的 相似性。通过改变杂交条件的严格程度，从没有杂交的水平到首 先观察到杂交的水平，可以确定一个给定序列跟与其最相似的序 列发生杂交所需的条件。确定一个特定的杂交反应的严格程度的 精确条件不仅仅包括离子强度、温度、以及去稳定剂例如甲酰胺
的浓度，还包括i者如核酸序列长度、碱基组合物、两个序列间配 错对的碱基对百分数、以及其他非同一性序列中出现该序列的子 集(例如，短的重复延伸)的频率之类的因素。设定杂交条件， 使用清洗这一步骤来确定两个发生杂交的序列之间具有的最小 水平的相似性。通常情况下，从《又仅能够发生同源性杂交的最^f氐 温度开始，对于^f壬意选定浓度的SSC来i兌，两个序列之间的1% 的错配比例会导致熔化温度(Tm)降低1°C。通常来讲，SSC浓 度增加一倍，将导致熔化温度(Tm)升高大约17°C。利用这些 指标，可以根据错配的水平凭借经验来确定清洗的温度。在 Current Portocols in Moecular Biology (《分子生物学当代规孝呈》) (Ausubel, F.M.等人编辑，John Wiley&Sons, Inc., 1995年，具
有补充的更新内容)第2.10.1至2.10.16页以及第6.3.1至6.3.6
页中解释了杂交条件以及清洗条件。
可以发生杂交的高度严格的条件包括(1 ) 1倍的SSC (10 倍的SSC = 3M氯化钠，0.3M 二水合柠檬酸钠(88克/升)，用1M 盐酸调PH至7.0), 1%SDS (十二烷基橫酸钠)，0.1-2毫克/毫 升变性的小牛胸腺DNA， 65°C; (2)1倍的SSC， 50%的甲酰胺， 1%SDS, 0.1-2毫克/毫升变性的小牛胸腺DNA, 42°C; (3)1 %牛血清白蛋白(片IS:V)， lmM乙二胺四乙酸二钠，0.5mM石粦 酸氢钠(pH7.2 ) ( 1M磷酸氢钠=每升含有134克七水合磷酸氬 二钠，4毫升85%的石粦酸)，7%SDS, 0.1 -2毫克/毫升变性的小 牛胸腺DNA， 65°C; ( 4 ) 500/0甲酰胺，5倍的SSC, 0.02M Tris -盐酸(pH7.6 )， 1倍的Denhardt，s溶液(100倍=10克Ficoll 400, 10克聚乙烯吡p各烷酮，IO克牛血清白蛋白(片革殳V)，加水至500毫升胸腺DNA, 42°C; (5)5倍的SSC, 5倍的Denhardt，s溶液，1 %SDS， 100微克/毫升变性的小牛胸腺DNA, 65°C;或者(6) 5 倍的SSC, 5倍的Denhardt，s溶液，50%曱酰胺，1%SDS， 100 微克/亳升变性的小牛胸腺DNA, 42°C,并且使用(1) 0.3-0.1 倍的SSC, 0.1%SDS在65。C时，或者(2) ImM乙二胺四乙酸 二钠，40mM磷酸氬钠(pH7.2)， 1 % SDS在65°C时进行高度严 格条件下的清洗。上述条件可以被用来进行具有50个碱基对或 者更长的DNA-DNA杂交物的杂交。当杂交物的长度被认为是少 于18个碱基对时，杂交温度和清洗温度应该比该杂交物计算得 到的熔化温度(Tm)低5-10°C，其中熔化温度(Tm) °C = (2 xA碱基和T碱基的数量)+ (4xG碱基和C碱基的数量)。如 果杂交物的长度被认为是在大约18到大约49个碱基对之间时， 熔化温度(丁111)°。= ( 81.5。C + 16.6 (log10M) +0.41 (%G+C) -0.61 (%曱酰胺)-500/L),其中"M，，代表单价阳离子(例 如，钠离子)的体积摩尔浓度，而"L"代表杂交物的碱基对长 度。
可以发生杂交的中度严格的条件包括(1)4倍的SSC (10 倍的SSC = 3M氯化钠，0.3M 二7K合种檬酸钠(88克/升)，用1M 盐酸调PH至7.0)， 1%SDS (十二烷基磺酸钠)，0.1-2毫克/亳 升变性的小牛胸腺DNA， 65°C; (2)4倍的SSC, 50%的曱酰胺， 1%SDS, 0.1-2亳克/毫升变'I"生的小牛胸腺DNA, 42°C; (3) 1 %牛血清白蛋白(片^:V)， lmM乙二胺四乙酸二钠，0.5mM4, 酸氢钠(pH7.2) (1M蜂酸氢钠-每升含有134克七水合磷酸氢 二钠，4毫升85%的石粦酸)，7%SDS, 0.1 -2毫克/毫升变性的小 牛胸腺DNA, 65°C; (4)50%甲酰胺，5倍的SSC, 0.02M Tris -盐酸(pH7.6 ), 1倍的Denhardt，s溶液(100倍=10克Ficoll 400, IO克聚乙烯吡咯烷酮，IO克牛血清白蛋白(片段V),加水至500 毫升)，10%硫酸葡聚糖，1%SDS， 0.1-2毫克/毫升变性的小牛 胸腺DNA， 42°C; ( 5 ) 5倍的SSC, 5倍的Denhardt，s溶'液，1 %SDS， 100微克/毫升变性的小牛胸腺DNA， 65°C;或者(6) 5 倍的SSC， 5倍的Denhardt，s溶液，50%甲酰胺，1%SDS, 100 孩t克/毫升变性的小牛胸腺DNA， 42°C,并且使用1倍的SSC， 0.1%SDS在65。C时进行中度严格条件下的清洗。上述条件可以 -波用来进行具有50个碱基对或者更长的DNA-DNA杂交物的杂 交。当杂交物的长度被认为是少于18个碱基对时，杂交温度和 清洗温度应该比该杂交物计算得到的熔化温度(Tm)低5-10 。C，其中熔化温度(Tm) 。C = (2xA碱基和T碱基的数量)+ (4xG碱基和C碱基的数量)。如果杂交物的长度被认为是在大 约18到大约49个碱基对之间时，熔化温度(Tm) 。C = (81.5 °C + 16.6(log10M) +0.4H %G + C) _0.61( %甲酰胺)-500/L), 其中"M"代表单价阳离子(例如，钠离子)的体积摩尔浓度， 而"L"代表杂交物的碱基对长度。
可以发生杂交的〗氐度严格的条件包^舌(1)4倍的SSC ( 10 倍的SSC = 3M氯化钠，0.3M 二水合柠檬酸钠(88克/升)，用1M 盐酸调PH至7.0), 1 % SDS (十二烷基磺酸钠)，0.1-2毫克/毫 升变性的小牛胸腺DNA， 50°C; (2)6倍的SSC， 50%的曱酰胺， 1%SDS， 0.1-2亳克/毫升变性的小牛胸腺DNA， 40°C; (3)1 %牛血清白蛋白(片段V)， lmM乙二胺四乙酸二钠，0.5mM磷 酸氢钠(pH7.2 ) ( 1M磷酸氢钠=每升含有134克七水合磷酸氢 二钠，4毫升85%的磷酸)，7%SDS, 0.1-2毫克/毫升变性的小 牛胸腺DNA， 50°C; (4)50%曱酰胺，5倍的SSC， 0.02M Tris -盐酸(pH7.6 ), 1倍的Denhardt，s溶液(100倍=10克Ficoll 400, IO克聚乙烯吡咯烷酮，IO克牛血清白蛋白(片段V),加水至500 毫升)，10%石危酸葡聚并唐，1%SDS， 0.1-2亳克/毫升变性的小牛 胸腺DNA， 40°C; (5)5倍的SSC， 5倍的Denhardt，s溶液，1 %SDS, 100微克/毫升变性的小牛胸腺DNA, 50°C;或者(6 ) 5 倍的SSC, 5倍的Denhardt，s溶液，50%曱酰胺，1%SDS, 100 -徵克/毫升变性的小牛胸腺0忖八，401:，并且使用(1 )2倍的SSC， 0.1。/。SDS在50。C时，或者(2) 0.5%牛血清白蛋白(片^殳V)， lmM乙二胺四乙酸二钠，40mM磷酸氢钠(pH7.2 ), 5 % SDS进 4亍低度严格条件下的清洗。上述条件可以被用来进行具有50个 碱基对或者更长的DNA-DNA杂交物的杂交。当杂交物的长度净皮 i人为是少于18个碱基对时，杂交温度和清洗温度应该比i亥杂交 物计算得到的熔化温度(Tm)低5-l(TC,其中熔化温度(Tm) °C = (2x A碱基和T碱基的数量)+ (4xG碱基和C碱基的数 量)。如果杂交物的长度被认为是在大约18到大约49个碱基对 之间时，熔4匕温度(Tm) °C = ( 81.5°C + 16.6 (log10M) +0.41 (%G + C) -0.61 (%甲酰胺)-500/L)，其中"M，，代表单价 阳离子(例如，钠离子)的体积摩尔浓度，而"L"代表杂交物 的碱基对长度。 本发明所述的结核核酸序列或者该序列的片^更也可以用来 分离其他的同系物。例如，可以使用标记过的结核核酸序列对来
自于适当生物体的cDNA文库或者染色体组DNA文库进行筛选， 以识别同源性基因，例如在Ausubel等人编辑的Current Protocols in Molecular Biology (《分子生物学当代j见程》)，John Wiley&Sons， New York (纽约)(于1997年)中有所描述。
可以Y吏用编-马抗原的DNA序列重组制备免疫抗原，所述 DNA序列可以^皮插入表达载体中并且在适当的宿主细胞中进行 表达。例如，可以利用患有结核分枝杆菌感染的患者的血清在适 当的结核分枝杆菌染色体组DNA或者cDNA表达文库中进行筛 选，以识别编码结核分枝杆菌抗原的DNA序列。可以利用本领 域技术人员熟知的技术来完成上述筛选，例如在Sambrook等人 于1989年在Cold Spring Harbor Laboratories ， N.Y.(纽约冷7良港 实验室)发表的Molecular Cloning: A Laboratory Mannual (《分 子克隆实验室手册》)中描述的方法。可以设计并且合成用于 上述筛选方法中的简并寡核苦酸序列，利用该序列完成上述筛 选。也可以利用聚合酶链式反应(PCR)，使用上述寡核苷酸， 通过本领域熟知的方法从cDNA文库或者染色体组文库中分离 核酸探4十。然后，可以4吏用分离的探针完成对文库的筛选。该方 法可以^壬选的包4舌标i己过的结核抗原探针。
或者，可以使用外周血单个核细胞(PBMCs)或者T细i包或 者来自于一个或者一个以上结核分枝杆菌免疫型个体的克隆物 直才妄对来自于结核分4支杆菌的染色体组文库或者cDNA文库进 行筛选。通常情况下，用来进行上述筛选的外周血单个核细胞 (PBMCs)和/或T细胞可以采用后面描述的方法进行制备。通常 可以对表达重组蛋白库i秀导T细万包内扩增和/或干4尤素-y生成
的能力进4亍检测，来实现对文库的直接筛选，其中所述的T细月包 来自于结核分枝杆菌免疫型个体。
本发明也提供了含有一种或者一种以上结核核酸分子的载 体、质粒或者病毒(例如，具有序列1、序列3、序列5、序列7、 序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、 序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列 35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所 示的序列，或者上述序列的组合序列)。用在真核细万包以及原才亥 细胞中的适当的栽体是本领域已知的，并且能够商业购买得到， 或者由4支术人员^艮容易的制备得到。其他的载体也可以在例如 Ausubel， RM.等人(于1994年，Current Protocol)所著的Current Protocols in Molecular Biology (《分子生物学当K》见禾呈》)，以及 Sambrook等人(于1989年)所著的"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(《分子克隆实验室手册》)第二版中找到。
可以使用本领域普通技术人员熟知的各种4支术通过编石马多 肽的DNA序列来容易的制备含有部分天然抗原和/或天然抗原变 体的重组多肽。例如，可以使用购买获得的过滤器首先对适当的 宿主/载体系统的上清液进行浓缩，其中所述宿主/载体系统将重 组蛋白分泌到培养介质中。浓缩之后，可以将浓缩物置于适当的 纯化基质例如亲和性基质或者离子交换树脂中。最后，进行一种 或者一种以上反相高效液相色^普(HPLC)步骤，进一步纯化重 组蛋白。
本领域普通4支术人员已知的各种表达载体中的任意一种都 可以用来表达本发明所述的重组多肽。表达可以在任4可适当的宿 主细胞中进4亍，所述的宿主细胞已经被含有编码重组多肽的DNA 分子的表达载体进行了转化或者转染。适当的宿主细胞包^会原核 细胞，酵母以及更高级的真核细胞。优选的，使用的宿主细胞是
大肠杆菌，酵母，或者哺乳细胞系例如cos (非洲青猴肾细胞)
或者CHO (中国仓鼠卵巢细胞)。通过这种方式表达的DNA序 列能够编码天然形成的抗原，天然形成的抗原的部分，或者它们 的变体。
含有克隆的结核受体或者受体片段的质粒、载体或者病毒的 用途包括下列中的一种或者一种以上(l)制备杂交探针，用以 在组织中^果测和测量结核的水平，或者分离结核同系物；(2)在 体内或者体外制备结核mRNA或者结核蛋白；以及(3)制备转 基因非人类动物宿主细万包或者重组宿主细月包。
在一种实施方式中，本发明包括经过上述质粒、载体或者病 毒转4匕的宿主细胞。核酸分子可以^皮插入到一个构建体中，所述 构建体可以任选的利用已知的方法;陂复制和/或整合到重组宿主 细胞中。所述的宿主细胞可以是真核细胞或者原核细胞，包4舌例 如酵母(例如毕赤酵母pastorius或者酿酒酵母)，细菌(例如大 肠杆菌，结核分枝杆菌，或者枯草芽孢杆菌)，动物细胞或者组 织，昆虫Sf9细胞(例如被杆状病毒感染的SF9细胞)或者哺乳 动物细胞(体细胞或者胚细胞，人胚肾(HEK)细胞，中国仓鼠 卵巢细胞，海拉细胞，人类293细胞以及猴子COS-7细胞)。适 用于本发明的宿主细胞还包括哺乳动物细胞，细菌细胞，酵母细 胞，昆虫细胞，以及才直物细胞。
可以通过已知的方法将核酸分子导入或者插入到宿主细万包 中。适当的转染或者转化细胞的方法的例子包括磷酸钾沉淀，电 泳，微注射，感染，脂质转染法，以及直接摄取法。这里使用的 "转化，，或者"转染"指的是通过导入其他的核酸来获得新的遗 传特性或者改变的遗传特性，其〗也的核酸例如DNA。宿主细胞^ 遗传信息的"表达"是一种技术术语，指的是指导DNA的转录 以生成RNA，所述RNA再被翻译成多肽。制备这类重组宿主细
胞并且导入核酸的方法在例如Sambrook等人(于1989年)所著 的"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(《分子克隆实 验室手册》)第二版，以及Ausubel等人(于1992年)所著的 "Current Protocols in Molecular Biology"(《分子生物学当K关见 程》)中有更加详细的描述。
之后，将宿主细胞保持在合适的条件下，使其表达并且再生 本发明所述的抗原性结核多肽。通常，将细胞保持在合适的緩冲 物和/或生长培养基中，或者保持在适合细胞生长以及基因产物表 达的营养源中。所述的生长培养基对于本发明而言不是至关重要 的，通常是本领域已知的，包括碳源，氮源以及硫源。培养基的 例子包括Luria肉汤培养基，Superbroth (超级肉汤)培养基，使 用Dulbecco，s <奮饰的Eagles培养基(DMEM )， RPMI國1640培养 基，M199培养基以及Grace，s昆虫培养基。所述的生长培养基可 以含有緩沖成分，对緩冲成分的选择对于本发明而言不是至关重 要的。可以对緩冲介质的pH值进行选择，通常是宿主细胞耐受 的，或者是适合宿主细胞生长的最佳pH值。
将宿主细胞在适当的温度以及大气中。或者，如果宿主细月包 是好氧的，将该宿主细胞保持在大气环境下或者其他适合生长的 环境下。对温度的选择应当是宿主细胞能够耐受的温度，并且可 以是例如在大约13'C到40。C之间。
4元体及其检测方法
技术领域：
本发明包4舌在样品中检测本发明所述的抗原性结核多肽是 否存在的方法。合适的检测包括免疫学方法，例如放射性免疫检 测，酶联免疫吸附测定(ELISA),化学发光检测，以及'tfe速免 疫色谱测定。任何现在已知的方法或者将来发展出的方法都可以 用来测定抗原性结4亥多肽。 可以4吏用与序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列 12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、 序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、序列 38、序歹'J 40、序歹'J 42、序歹'J 44、序歹'J 46、序歹'j 48、或者上述序 列的组合序列、或者上述序列的部分序列所示的抗原性结核多肽 中的4壬意一种相关的抗体。在一种优选的实施方式中，所述的抗 体与抗原性结核多肽或其部分进行特异性结合。所述抗体可以是 多克隆的或者单克隆的，因而术语抗体意在包括多克隆抗体和单 克隆抗体，以及它们的功能性片,殳。术语多克隆和单克隆指的是 抗体制备过程中的均一性程度，并不意在限定制备抗体的特定方 法。
在几种优选的实施方式中，4果测本发明所述的抗原性结核多 肽是否存在及其水平的免疫学技术是通过抗结核抗体(例如，一 种或者一种以上抗体)的方式来进行的。术语"抗结核抗体，，包 括单克隆抗体和/或多克隆抗体，以及它们的混合物，指的是对含 有序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、序列14、 序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、序列26、序列 28、序列30、序列32、序列34、序列36、序列38、序列40、 序列42、序列44、序列46、序列48、或者上述序列的纟且合序列、 或者上述序列的部分序列所示的序列的多肽具有特异性的抗体。
抗体可以作用于适当的免疫原，例如这里描述的分离的和/ 或重组的抗原性结核多肽，及其类似物或者一部分(包括合成分 子，例如合成肽)。在一种实施方式中，抗体作用于这里描述的 分离的和/或重组的抗原性结核多肽或其一部分(例如， 一种肽)， 或者作用于表达重组抗原性结核多肽的宿主细胞。除此之外，这 里所述的表达重组抗原性结核多肽的细l包例如转染细胞，可以作 为免疫原，或者用来筛选结合了受体的抗体。
抗体或者单克隆抗体。本领域存在各种不同的方法(例如参见
Kohler等人(于1975年)在Nature (《自然》)256: 495 -497 中发表的文章，以及(于1976年)在Eur丄Immunol.(《欧洲免 疫学杂志》)6: 511 - 519中发表的文章；Milstein等人(于1977 年)在Nature (《自然》)266: 550 — 552中发表的文章；Koprowski 等人申请的美国专利No.4172124; Harlow, E.和D丄ane于1988 年所著的Antibodies: A Laboratory Manual,(《抗体实验室手 册》)(Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor， N.Y. (冷泉港实验室冷泉港，纽约))；Ausubel, RM.等人(John Wiley&Sons:纽约，N.Y.)(于1991年)编写的Current Protocols in Molecular Biology (《分子生物学当代规程》)，第2巻(增刊 27, 1994年夏天)第11章)。通常，将适当的永生细胞系或者骨 髓瘤细月包系例如SP2/0与抗体生产细胞进行融合，能够产生杂交 瘤。使用感兴趣的抗原对动物进4于免疫，能够生成抗体生产细月包， 优选是来自脾脏或者淋巴结的细月包。选择性培养方法分离抗体生 成杂交瘤细胞，而有限稀释4支术生成这种杂交瘤细力包。研究者可 以使用适当的检测法例如酶联免疫吸附测定，来选择具有所期望 的特异性的抗体生成细胞。
其他合适的方法能够生成或者分离具有所需特异性的抗体。 这类方法的例子包括从文库中选择重组抗体，或者依靠转基因动 物例如小鼠的免疫。
方法与不存在活性结核的人体(例如，存在潜伏的结核，没有被 结核感染，或者已经对结核感染进行了免疫)进行比较。当人体 感染了结核分枝杆菌，并且该细菌是休眠的或者灭活的，则发生潜 伏性结核。活性结核感染指的是人体感染了结核分枝杆菌并且该
细菌快速侵染了肌体的某些部分，包括肺以及其他组织。本发明
基于下述发现在患有活性结核的患者的尿液中发现了某些结核 抗原的存在，因而本发明包4舌用来确定活性结核感染是否存在的 检观'J方法。
才艮才居上述方法，检测能够确定生物冲羊品中是否存在抗原性结 核多肽，以及抗原性结核多肽的水平。这类检测包括在适于使抗 体和抗原性结核多肽形成复合体的条件下，将待测样品与抗体进 4亍混合，所述的抗体对本发明所述的抗原性结核多肽具有特异 性，并且探测或者测定(直接的或者间接的)复合体的形成。所 述样品可以是直接获得的或者间4妄获得的(例如，由卫生保健机 构提供)，也可以通过适合于特定样品(例如，尿液，唾液，脑 脊髓液，全血，富含血小板的血浆，缺乏血小板的血浆，血清) 以及检测形式的方法进行制备。混合的方法以及探测复合体形成 的方法也可以与4企测形式相协调。
某些适当的标记物可以被直接探测，例如放射性标记物、荧 光标记物或者化学发光标记物。也可以4吏用标记物进4 亍间4妄探 测，例如酶标i己物以及其他抗原性结合配偶子或者特异性结合配 偶子例如生物素。这类标记物的例子包括荧光标记物例如荧光 素、若丹明，化学发光标记物例如荧光素酶，放射性同位素例如 32P， 1251, 1311,酶标记物例如辣根过氧化物酶，以及碱性磷酸酶， 牛乳糖苷酶，生物素，抗生物素蛋白，自旋标^己物以及类4以物。 也可以利用免疫学方法通过第二抗体来4笨测复合体中的抗体，之 后再对第二抗体进行探测(例如，使用标记物的形式)。常规方 法或者其他适当的方法能够直4妄的或者间接的标记抗体。可以商 业购买获得标记过的初级抗体以及次级抗体(第二抗体)，也可 以使用本领域技术人员已知的方法进行制备(参见Harlow, E. 和D.Lane于1988年戶斤著的Antibodies: A Laboratory Manual,
(《抗体实验室手册》)(Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y.(冷泉港实-验室冷泉港，纽约))。
在一种优选的实施方式中，使用酶联免疫吸附测定、夹心酶 联免疫吸附测定、或者免疫色谱测定来确定抗原性结核多肽是否 存在，或者探测抗原性结核多肽的水平。为了探测一个适当样品 中的抗原性结核多肽，需要先收集样品(例如，尿液)。可以使 用本4页&戈已知的方法处理样品。上述方法进一步包4舌将一个适当 的样品与一种组合物进行混合，所述的组合物含有作为探测剂的
抗结核多肽抗体(例如，生物素化抗结核多肽单克隆抗体以及辣 才艮过氧4匕物酶链霉抗生物素蛋白，或者辣才艮过氧化物酶共轭连4妻 的抗结冲亥多肽单克隆抗体)，以及固体载体，例如孩么量滴定才反或 者量油尺，抗结核多肽捕获抗体结合(例如，直接的或者间接的) 在固体载体之上。所述探测剂抗体结合在另 一个不同的抗原性结 核多肽抗原决定基上，并且在那里^皮捕获抗体识别，在适于复合 体形成的条件下。之后，该方法包括探测样品中的复合体的形成。 如果来自于个体的样品中存在一种或者一种以上抗原性结核多 肽，则表明该个体存在活性结核感染，而如果不存在结核多肽， 则表明该患者不存在活性结核感染。
可以将抗结核多肽抗体或者结核特异性抗原直4妄或者间接 的涂覆在固体载体例如微量滴定板，量油尺，珠，衬垫，带条， 或者其他适当载体上。例如，可以将抗结核多肽抗体涂覆在孩i量 滴定板上，或者向经过链霉抗生物素蛋白涂覆的载体上添加生物 素化抗结核多肽单克隆抗体。在免疫色i普测定方法中，可以把特 异于所述抗原的抗体涂覆于衬垫或者带条上，当含有一种或者一 种以上所述抗原的样品与抗体发生接触时，形成的复合体在探测 剂的帮助下会改变颜色，这将在本发明中有进一步描迷。参见附
图4。可供使用的固定化方法或者涂覆方法以及固体载体有很多， 可以才艮据所需要的形式进行选择。
在一个免疫色谱测定方法中，可以把含有本发明所述结核抗 原的才羊品加入到上述沉淀中，如附图4中所示。样品在金标i己抗 体(单克隆抗体#1)中扩散，所述金标记抗体对所述抗原的部分 具有特异性，样品中的抗原与上述抗体形成复合体。形成的复合 体进一步在含有第二抗体(单克隆抗体#2)的村垫中扩散，第二 抗体结合到抗原的其他部分上。当复合体接触到标记为"l号线" 的线时，被标记的复合体改变颜色，对照线("2号线")也会改 变颜色。如果上述样品中不含有本发明所述的结核抗原，则l号 线不会改变颜色，因为金标记抗体不会与样品发生结合，因此也 不会与1号线发生接触。
在另外一种实施方式中，将样品(或者抗原性结核多肽标准) 同时与固体载体以及探测剂抗体进行混合，并且任选的与一种或
者一种以上用于监控探测过程的试剂进行混合。例如，可以将样 品同时与固体载体以及(a)辣根过氧化物酶共轭连接的抗结核 多肽单克隆抗体，或者(b)生物素化抗结核多肽单克隆抗体以 及辣根过氧化物酶链霉抗生物素蛋白进行混合。
可以准备已知剂量的抗原性结核多肽标准，并且按照如上所 述的方法对其进行处理，作为一个适当的样品。这种抗原性结核 多肽标准能够帮助量化探测到的抗原性结核多肽的剂量，通过将 才羊品中的抗原性结核多肽水平与标准中的水平进4亍比对来完成。
内科医师、技术员、使用仪器或者有资格的人员能够将探测 到的复合体的剂量与适当的对照组进行比对，以确定样品中的水 平是否升高了。例如，可以将处理后的抗原性结核多肽的水平与 处理前的基线水平进4亍比对，或者与正常个体或适当的对照组中
的水平进行比对。与基线水平相比，如果尿液中一种或者一种以 上结核多肽的水平降低或者保持不变，则表明该处理是有效的， 而水平的增加则表明该处理是无效的。
通常用于检测抗原性结核多肽的方法是顺序检测法，在该方 法中，在一个平^反上涂覆第一抗体，加入样品，洗涤平^反，加入 另外一个标记抗体(第二抗体)，之后洗涤平板，并且量化其上 结合的第二抗体。在另外一种实施方式中，将抗体与样品同时加 入，形成竟争性酶联免疫吸附测定反应，能够获得更高的灵敏性。
许多方法都能够测定复合体中抗原性结核多肽的量。例如， 当4吏用辣才艮过氧4匕物酶作为标i己物时，可以加入适当的底物例如
OPD (邻苯二胺)，按照结合的抗结核多肽单克隆抗体的比例、 /人而按照样品中抗原性结核多肽的比例直接增加颜色的亮度(通 过例如光学密度来评价)。
技术员、内科医师、有资格的人员或者利用仪器可以将结果 与适当的对照组进行比对，对照组是例如标准或者是来自于相同 个体的样品中的抗原性结核多肽的基线水平。例如，可以使用已 知剂量的抗原性结核多肽标准代替样品来进行;险测，得到标准化 曲线。可以将形成的或者探测到的复合体的剂量与已知剂量的抗 原性结核多肽进行比较。
也可以4吏用杂交的方法检测编码抗原性结核多肽的核酸，例 如，将这里提供的结核序列中的一种(例如，序列1、序列3、 序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、 序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列 31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、 序列45、序列47所示的序列，或者上述序列的组合序列)或者 来自于上述序列之一的寡核苷酸与来自于人体的含有DNA或者RNA的组织样品进行杂交。这样的杂交序列可以连接一个可探 测的标i己，例如^t射性标i己或者荧光标i己等等，以〗吏杂交产物3皮 探测到。这类方法包括在高度严格的条件下，将样品与一种或者 一种以上寡核苷酸探针(例如，至少大约15个连续的碱基)相 接触，所述的探针特异于这里所述的核酸分子3使样品与探针进 行充分的杂交；然后，探测杂交于样品中的寡核苷酸探针的核酸 分子。如果探针发生了杂交，则表明存在结核分枝杆菌感染，如 果探针没有发生杂交，则表明不存在结核分枝杆菌感染。杂交的 方法是熟知的，并且这类方法在Jacobs等人申请的美国专利 No.5837490中有记载，该文献的全部教导在此引入作为参考。对 寡核苷酸探针的设计优选具有下列参数(a)所述探针应该被设 计在含有最少多义碱基("Ns")的序列区域内，如果存在的话， 并且(b )所述探针应该祐 没计为具有大约80°C的熔化温度(Tm ) (假定每个A碱基或者T碱基需要2"C，每个G碱基或者C碱基 需要4'C )。
本发明包括利用PCR (聚合酶链式反应)方法，使用本发明
中的结核多肽的方法。例如，可以4吏用序列1、序列3、序列5、 序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、 序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列 33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、 序列47、或者上述序列的组合序列通过PCR (聚合酶链式反应) 探测本发明所述的序列。PCR (聚合酶链式反应)是一种目标序 列的选择性扩增，利用序列特异性引物以及热稳定性聚合酶，通 过多轮重复的核酸复制来完成。PCR (聚合酶链式反应)使完整 的序列在其两端退火为已知序列。具体的，在一个PCR(聚合酶 链式反应)反应中，将样品与至少两个寡核苦酸引物进行接触， 所述寡核苷酸引物(例如，至少大约10个连续的碱基)中的至 少一个对本发明所述的分离的核酸分子中的一种或者一种以上 具有特异性。样品与引物充分4妄触，4吏引物发生扩增。探测样品 中扩增的核酸序列。如果存在任何一种扩增的核酸序列，则表明
存在结核分枝杆菌感染，如果不存在任何一种扩增的核酸序列，
则表明不存在结核分枝杆菌感染。PCR(聚合酶链式反应)的方 法在本发明中有卢斤描述，并且该方法是本领域已知的。
因此，本发明包括用来探测序列2、序列4、序列6、序列8、 序列10、序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列 22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、 序歹U 36、序歹'J 38、序歹'J 40、序歹'J 42、序歹'J 44、序歹'j 46、序歹'J 48、或者上述序列的组合序列的试剂盒，所述试剂盒也可以用来 量化这些序列，试剂盒中含有特异于这些序列的抗体，或者上述 抗体的一部分，或者含有能够杂交于编码这些序列的核酸的核酸 序列。
可以使用本领域已知的方法进行其他种免疫检测或者核酸 4企测。本领域已知的检测方法或者未来发展出的检测方法都可以 用来检测样品中的抗原性结核多肽。
除了测定样品中抗原性结核多肽的存在之外，这类检测还能 够测定结核疫苗的功效性(例如，对免疫应答的刺激程度)。可 以同时使用这些不同类型的检测，对人体内的结核状况进行全面 评价。例如，如果一个个体中存在结核特异性免疫应答，但其样 品中 一种或者一种以上抗原性结核多肽的检测结果呈阴性，则表 明该个体对结核疾病具有一定水平的免疫性。然而，如果一个个 体中存在结核特异性免疫应答，并且对本发明所述的抗原性结核 多肽的检测结果呈阳性，则表明该个体可能患有结核。
可以通过对注射过疫苗的人体内的免疫应答进4亍测定来"i平 Y介结核疫苗的功岁文性。这里所i兌的本发明的结核抗原(及其免疫 原性部分)具有诱导免疫应答的能力。更具体的，这种抗原具有 i秀发T细月包、NK细月包(肿瘤杀伤细月包)、B细月包和/或巨噬细胞^ 内的扩增和/或细胞因子的生成(即，干扰素-y和/或白细胞介 素-12的生成)的能力，其中所述的T细胞、NK细胞(肿瘤杀 伤细胞)、B细胞和/或巨噬细胞来自于结核分枝杆菌免疫型个体。 参见实施例3。
可以才艮才居所期望的应答来选择细月包类型，用于测定4十对抗原 的免疫应答。例如，使用含有B细胞和/或巨噬细胞的样品能够 最容易的测定白细胞介素-12的生成量。结核分枝杆菌免疫型个 体被i人为是通过激发针对结核分枝杆菌的有效的T细胞应答来 抵抗结4亥的形成(即，本质上不存在疾病症4犬)。这类个体可以 基于下列特征净皮识别利用纯蛋白^汙生物(PPD),得到针对结 核蛋白的强阳性(即，大于大约10毫米直径的硬结)皮下测试 应答，以及不存在有关结核疾病的任何迹象或者症状。可以使用 本领域普通技术人员已知的方法，制备来自于结核分枝杆菌免疫 型个体的T细胞、NK细胞(肿瘤杀伤细胞)、B细胞和巨噬细胞。 例如，可以通过制备PBMCs (即，夕卜周血单个核细胞)的方法 来制备，而不需要进一步分离成分细胞。通常，可以-使用例如 Ficoll (菲可)(Winthrop Laboratories, NY)密度离心法制备外 周血单个核细胞。也可以将本发明所述的检测方法中〗吏用的T细 月包从外周血单个核细l包中直接分离纯化出来。或者，可以4吏用对 分枝杆菌蛋白具有活性的强化T细胞系，或者对个体分枝杆菌蛋 白具有活性的T细J包克隆。这类T细力包克隆可以通过例如^f吏用分 枝杆菌蛋白对来自于结核分枝杆菌免疫型个体的外周血单个核 细胞进行2-4周的培养而获得。这种方法只允许分枝杆菌蛋白 特异性T细月包发生扩张，4寻到全部由该细胞组成的细月包系。然后，
可以4吏用本领域普通^支术人员已知的方法对上述细胞进行克隆，
并且使用个体蛋白进行检验，从而更准确的定义个体t细胞的特 异性。通常，在对来自于结核分枝杆菌免疫型个体的t细胞、 nk细胞(肺瘤杀伤细胞)、b细胞和/或巨嗟细胞中的扩增和/或 细胞因子的生成(即，干扰素_ y和/或白细胞介素- 12的生成) 进行检测时，呈阳性的抗原被认为是免疫原性的。可以使用例如 后面描述的代表性方法来进行上述检测。可以使用类似的检测方 法识别上述抗原的免疫原性部分，该部分可以存在于本发明所述 的多肽之内。
可以通过将细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)与多肽(例 如，免疫抗原或其部分，或者它们的变体)进行接触并且测定细 月包扩增的方法来评价上述多肽诱导细胞扩增的能力。通常，足够 用于评^f介大约105个细1包的扩增的多肽的量在大约10纳克/毫升 至大约100微克/亳升的范围内，并且优选为大约10樣t克/毫升。 4吏用细月包对多肽进行的培养通常是在37°C下培养大约6天。多肽 培养之后，4企验细胞的扩增性应答，可以〗吏用本领域普通^支术人 员已知的方法对其进4亍评价，例如将细胞暴露于一束;^文射性标记 的胸苦Ji^沖中，并且测量导入到细胞dna的标记物。通常情况 下，所导致的扩增比背景水平(即，不使用多肽进行培养的细胞 中观察到的扩增)增加至少3倍的多肽被认为是能够诱导扩增的 多肽。
一种多肽具有的刺'激细月包内干护O素-v和/或白细胞介素-12的生成的能力可以通过下述方式进行评〗介将细胞与多肽进行 才妄触，并且测定细胞生成的干4无素-y或者白细月包介素-12的水 平，如实施例3中所示范的。通常，足够用于评i^介大约105个细 胞的扩增的多肽的量在大约10纳克/毫升至大约100微克/毫升的 范围内，并且优选为大约10孩￡克/毫升。所述的多肽可以^f旦不必
须#皮固定于固体载体例如珠或者生物可降解孩O求体上，如美国专
利Nos.4897268和5075109中所述的载体。细胞对多肽的培养通 常是在37。C下培养大约6天。在多肽培养之后，对细胞中的干扰 素-Y和/或白细月包介素-12 (或者一种或多种上述物质的亚基) 进行检测，这可以通过本领域普通^支术人员已知的方法来进4亍， 例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，或者如果是对白细胞介素-12 P70亚基进行4企测，则使用例如测定T细胞扩增的生物检测方 法。通常，如果每毫升培养上清液(每毫升中含有104 - 105个丁 细胞)中生成至少50匹克的干扰素-Y,则产生该结果的多肽 被认为具有刺激干扰素-Y生成的能力。如果在多肽的刺激下， 每105个巨嗟细力包或者B细"包(或者每3 x 105个外周血单个核细 胞)能生成至少10匹克/毫升的白细胞介素-12 P70亚基，和/ 或至少100匹克/毫升的白细月包介素-12 P40亚基，则该多肽4皮 i人为具有刺激白细胞介素-12生成的能力。
通常，免疫抗原能够刺激T细胞、NK细胞(肿瘤杀伤细胞)、 B细胞和/或巨喧细胞中的扩增和/或细胞因子的生成(即，干扰 素-Y的生成和/或白细l包介素-12的生成)，所述T细月包、NK 细胞(肿瘤杀伤细胞)、B细胞和/或巨噬细胞来源的个体中有至 少大约25%的个体是结核分枝杆菌免疫型个体。在这类免疫抗原 中，可以根据在上述检测中得到的应答的量级以及才艮据观察到应 答的个体的百分数来甄別具有优异治疗特性的多肽。除此之外， 如果细胞来源的个体中有多于大约25 %的个体不属于结核分枝 杆菌免疫型，则具有优异治疗特性的抗原不能在体外刺激细胞内 的扩增和/或细胞因子的生成，从而消除了不是由结核分枝杆菌应 答细l包引起的特异性应答。当T细月包、NK细胞(肿瘤杀伤细胞)、 B细J包和/或巨噬细胞样品来源的个体中有高比例的结核分枝杆 菌免疫型个体时(来自于其他个体的细胞样品应答的发生率低)， 诱导上述细胞中的应答的抗原具有优异的治疗特性。
融合蛋白，疫苗组合物，给药形式
本发明所述的结4亥多肽可以以共扼蛋白或者融合蛋白的形 式存在，上述形式可以由本领域已知的方法进行制备。特別的，
序列2、序列4、序列6、序列8、序歹'J 10、序歹'J 12、序列14、 序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、序列26、序列 28、序歹'J 30、序歹'J 32、序歹'J 34、序歹ll 36、序歹'J 38、序歹'J 40、 序列42、序列44、序列46或者序列48中的两个或者多个序列 之间可以彼此融合，或者与其他蛋白进行融合，以提供更加有效 的疫苗组合物，刺激增强的免疫应答。用来制备上述融合蛋白的 其他蛋白包括刺激免疫应答的CD4+T细胞途径的结核抗原。这 类抗原的例子包括抗原85b， ESAT-6， MtB41, Mtb39。本发明 所述的抗原多肽是从主要组织相容性复合体(MHC) 1级分子中 分离得到的，已知该分子中存在针对CD8+T细胞的抗原。尽管 这些多肽也可能存在于CD4+T细胞途径中，将CD4+T细胞途径 抗原与本发明所述的多肽中的一种进行融合，可以增强结核疫苗 的功效。可以根据已知的重组DNA 4支术制备融合蛋白。例如， 可以从核酸分子中进行融合蛋白的表达，所述核酸分子包括编码 结核多肽的生物活性部分或者编码整个结核多肽的序列，々o序列 2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、序列14、序列 16、序列18、序列20、序列22、序列24、序列26、序列28、 序列30、序列32、序列34、序列36、序列38、序列40、序列 42、序列44、序列46、序列48所示，或者上述序列的《且合序列， 以及融合配偶子(fusion partner),例如本发明中的其他序列，编 码免疫5求蛋白分子的一部分、或者来自于CD4+T细胞途^5的其 他结核多肽的序列。例如，在某些实施方式中，将编码免疫^求蛋 白序列的核酸交叉入适当的表达载体，噬菌体载体，或者其他可 购买获得的载体中。将得到的构建体导入适当的宿主细胞中进行 表达。在表达中，通过亲和基质将融合蛋白从细胞中分离并纯化
出来。通过测定由重组结核蛋白的表达而引发的转染细胞的功能 的转变，可以将细月包本身或者由该细月包生产的结核蛋白应用于各 种筛选4企测方法中。
如上所述，在某些情况下，本发明的组合物包括融合蛋白或
者DNA融合分子。每个融合蛋白包括两个本发明所述的多肽(一 种第一多肽和一种第二多肽)，或者包4舌一个本发明所述的多肽 和一个已知的结^亥分坤支才干菌抗原，以及这类融合蛋白的一些变 体。本发明所述的融合蛋白也可以包括一个连接肽，存在于第一 多肽和第二多肽之间。本发明所述的DNA融合分子包括两个分 离的DNA分子，每个分离的DNA分子编码本发明所述的结核分 枝杆菌抗原或者编码已知的结核分枝杆菌抗原。
编码本发明所述的融合蛋白的DNA序列是通过已知的重组 DNA技术进行构建的，将单独编码第一多肽的DNA序列和单独 编码第二多肽的DNA序列聚集在一个适当的表达载体中，下文 中会有详细描述。编石马第一多肽的DNA序列的3，端通过或者不 通过肽连接体与编码第二多肽的DNA序列的5'端进行连接，因 而两个序列的阅读才医在同一相中，/人而将两个DNA序列中的 mRNA翻译为一个单独的融合蛋白，同时保留了第一多肽和第二 多肽的生物活性。
可以使用肽连接序列分离第一多肽和第二多肽，使分离的距 离足够确保每个多肽都能够折叠成各自的二级结构以及三级结
融合蛋白中。可以根据下列因素来选择适当的肽连接序列(1) 适应柔性伸展构型的能力；(2)无法形成二级结构的能力，因为 所述的二级结构能够与第一多肽以及第二多肽上的功能性抗原 决定基发生相互作用；以及(3)不存在疏水残基或者带电残基， 因为上述残基可能与多肽的功能性抗原决定基发生反应。优选的
肽连4妄序列包括甘氨酸残基、天冬酰胺残基以及丝氨酸残基。其 4也接近中性的氨基酸例如苏氨酸和丙氨酸也可以作为连接序列 被使用。可以被有效用来作为连接序列使用的氨基酸序列包括在
Maratea等人于1985年在Gene (《基因》)40: 39-46中发表的 文章、Murphy等人于1986年在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83: 8258
-8262中发表的文章、美国专利No.4935233以及美国专利 No.4751180中所述的氨基酸序列。这类连接序列可以具有1个到 大约50个氨基酸的长度。如果所述第一多肽和第二多肽具有非 必需N-末端氨基酸区域，则不需要使用肽序列，因为非必需N
-末端氨基酸区i或可以#皮用来分离功能性结构域，并且防止位阻 影响。
i皮连才妾的DNA序列可操作的连4妻于适当的转录控制元4牛或 者翻译控制元件上。应答于DNA表达的调控元件仅定位在编码 第一多肽的DNA序列的5，端。类似的，结束翻译终止信号和转 录终止^f言号所需的终止密码子仅存在于编码第二多肽的DNA序 列的3'端。
可以对含有本发明所述的分离序列的疫苗的功效性进行测 定，这种测定以抗原具有的下述能力为基准在进4于了试-睑性感 染的才兆战试^验之后，所述的抗原具有减少至少大约50% (例如， 大约60%，大约70%，大约80%,大约90%，或者大约100%) 细菌数量的能力，和/或降低至少大约40% (例如，大约50%， 大约60°/。，大约70%,大约80%，大约90%,或者大约100% ) 死亡率的能力。合适的试验性动物包括小鼠，豚鼠以及灵长类。
优选的爿夸本发明所述的组合物配置成药物组合物或者疫苗， 用来诱导患者体内针对结核杆菌的保护性免疫性。所述的患者可 以是受疾病4斤磨的患者，或者是不存在可4果测的疾病和/或感染的
患者。换句话说，保护性免疫性的诱发能够预防、减轻结核的严 重禾呈度、或者治疗结核。
在一种实施方式中，本发明所述的药物组合物包括一种或者 一种以上上述多肽，上述多肽可以以混合物的形式存在，或者以 融合蛋白的形式存在，该组合物中还包括生理可接受载体。类似 的，疫苗包4舌一种或者一种以上上述多肽，以及非特异性免疫应 答增强剂，例如佐剂或者脂质体(在其中导入所述多肽)。
在另外一种实施方式中，本发明所述的药物组合物和/或疫苗
可以含有本发明所述的一种或者一种以上DNA分子，上述DNA 分子以混合物的形式存在，或者以DNA融合分子的形式存在， 每个DNA分子编码如上所述的一种多肽，因而上述多肽是在原 位生成的。在这类疫苗中，所述DNA可以存在于本4页i戈普通4支 术人员已知的各种运送系统中的4壬意一种中，包4舌核酸表达系 统，细菌表达系统和真菌表达系统。适当的核酸表达系统含有在 患者体内进;f亍表达所必需的DNA序列(例如适当的启动子和终 止信号)。细菌运送系统包括细菌(例如卡介苗)的施用，该细 菌在其细胞表面表达多肽的免疫原性部分。在一种优选的实施方 式中，可以4吏用病毒表达系统(例如，牛痘或者其他痘病毒，逆 转录酶病毒，或者腺病毒)导入DNA,其中可以4吏用非致病性 (缺陷型)可复制型病毒。将DNA导入这类表达系统中的4支术是 本领域普通技术人员熟知的。所述的DNA也可以是"棵"DNA, 例如在Ulmer等人于1993年在Science (《科学》)259: 1745-1749中发表的文章中有所描述，并且在Cohen于1993年在 Science (《科学》)259: 1691 - 1692中发表的文章中有所评论。 通过将棵DNA涂覆于生物可降解的珠上来增加对棵DNA的掘_ 取，这样能够将其有效的转移到细胞内。
本发明所述的抗原性结核分子可以与载体或者不与栽体一 同施用。术语"药物可接受载体"或者"载体"指的是相对惰性 并且无毒性的常规可^妄受赋形剂或者药物运送组合物。范例性的 载体包括无菌水，盐溶液(例如罗格氏溶液)，酒4青，凝胶，滑 石，粘性石蜡，脂肪酸酯，羟曱基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，碳 酸钙，石友水化合物(例如乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露糖)，白蛋
白，淀粉，纤维素，硅胶，聚乙二醇(PEG)，干燥脱脂乳，米 粉，硬脂酸钠，以及类似物。合适的配比以及其他载体在 Remington's Pharmaceutical Sciences (《雷明顿制药矛牛学》)(17th Ed., MackPub. Co.， Eastern, PA)中有所描述。可以对这些成分 进《亍杀菌，如果需要的话，可以与助剂进4于混合，助剂是例3口润 滑剂，防腐剂，穂、定剂，润湿剂，乳化剂，影响渗透压的盐类， 緩沖剂，着色剂，防腐剂和/或芳香物质以及类似物，上述物质不 会与活性化合物产生有害的反应。常^L的防腐剂可以包括山梨酸 钾，偏亚硫酸氯钠，对羟基苯甲酸曱酯，对羟基苯曱酸丙酯，硫 柳汞钠等等。如果需要的话，也可以将上述组合物与其他活性物 质例如酶抑制剂进行混合，以减少代谢性降解。施用上述化合物 时优选使用载体(例如，药物可接受性载体)，但不是必须使用 的。
上述组合物可以是液体溶液，悬浮液，乳液，片剂，丸剂， 月交嚢，緩释配方，或者粉末。给药的方法能够决定该组合物^皮配 置成4可种形式。例如，可以将上述组合物与传统的粘合剂以及载 体例如甘油三酸酯配置成4全剂形式。口"良配方可以包纟舌标准的载 体例如药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素， 碳酸镁，等等。
本发明所〗吏用的抗原性结核分子可以通过吸入、才直入、注射、 或者栓剂的方式进行静脉内给药、非肠道给药、肌肉内给药、皮
下纟会药、口月艮给药、鼻内给药、局部给药。上述组合物可以以单 一剂量的形式或者以多于 一 种剂量的形式在 一 羊殳时间内进^亍施 用，以达到所期望的效果。
上述4匕合物或者药物的实际有效剂量可以4艮据^吏用的特定 纟且合物、给药形式以及患者的年龄、体重和情况而不同。例如， 正如这里所使用的,该药物的有效剂量指的是能够减少细菌数量 的剂量。对于一个特定的患者而言，给药剂量可以由本领域普通 4支术人员^f艮据常规的因素来确定(例如，依靠适当的、常规的药 理学方案)。
如果是用于肠道或者用于黏膜(包括用于口腔黏膜以及鼻黏 膜)，特別合适的形式是片剂，液体，滴剂，栓剂或者胶囊。如 果需要使用甜味溶媒，可以使用糖浆，酏剂或者类似物。脂质体， 樣t球体以及^f效胶嚢也是可以利用的和可以使用的。
可以4吏用例如本4页」或已知的各种运送装置中的4壬意 一种进
4亍肺部给药，例如使用吸入器。参见例如S.P.Newman (于1984 年)在Aerosols and the Lung (《气雾剂和肺脏》)，Clarke和Davis (编辑)，Butterworths, London (伦敦)，England (英国)，197
-224页发表的文章；PCT公开申请No.W092/16192; PCT公开
申请No.W091/08760。
如果是非肠道形式给药，特别合适的形式是注射剂，无菌溶 液，优选的是油溶液或者含水溶液，以及悬浮液，乳液，或者是 植入剂，包括栓剂。特别的，用于非肠道给药的载体包括葡萄糖 的含水溶液，盐水，纯净水，乙醇，甘油，丙二醇，花生油，芝 麻油，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以及类似物。安瓿是方 l吏的单位剂量。
生4勿可降解的樣史j求体(例如，polylactic galactide )也可以4皮 用来作为载体用于本发明所述的药物组合物中。适当的生物可降 解微球体在例如美国专利Nos.4897268以及5075109中被公开。
在本发明所述的疫苗中可以使用各种佐剂中的任意 一 种，以 增强免疫应答。大部分的佐剂含有能够保护抗原免受快速分解代 谢的物质，例如氢氧化铝或者矿物油，以及非特异性免疫应答刺 激剂，例3口油月旨A， Bortadella pertussis或者结4亥分才支杆菌。合适 的佐剂可以购买获得，并且包4舌例如弗氏不完全佐剂以及弗氏完 全佐剂(Difco实-验室)和Merck佐剂65 ( Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.)。其他合适的佐剂包括明巩，生物可降解的 微球体，单磷酰脂A，以及基质quilA。
在本发明的疫苗中，优选所述的佐剂i秀导包4舌Thl方面的免 疫应答。适当的佐剂系统包括，例如，单磷酰脂A与铝盐的组合 物，所述的单》粦酰脂A优选为3-脱氧-乙酰4匕单《,酰脂A (3D-MLP)。 一种增强的系统包括单-粦酰脂A和惠素书f生物的组 合物，特别是3-脱氧-乙酰化单磷酰脂A (3D-MLP)和皂素 QS21的组合物，例如在WO94/00153中7>开的，或者是具有寿交 弱反应原性的组合物，其中QS21净皮胆固醇进4亍了硬:化，例如在 W096/33739中公开的。先前的试验已经证明，3 -脱氧-乙酰化 单4,酰脂A (3D-MLP)和QS21的组合物在i秀导体液细月包以及 Thl型细J!包免疫应答时产生了明显的协同效应。 一种特别有效的 佐剂组合物包括存在于水包油乳液中的QS21, 3-脱氧-乙酰化 单磷酰脂A ( 3D-MLP),以及生育酚，例如在WO95/17210中乂> 开的，上述组合物是优选的佐剂组合物。
本发明所述的抗原性结核多肽分子可以与其他化合4勿同时 施用，或者按时间顺序分別施用。上述的DNA疫苗和/或药物组 合物可以与本发明所述的其他多肽同时施用，或者4要顺序施用，
已知的结核分枝杆菌抗原、免疫增强剂、或者本领域已知的其他 化合物也可以与上述疫苗 一 同施用。所述的化合物可以与抗原性 结核分子同时施用，也可以在它之前或者之后施用。因此，术语 "共同施用"在这里指的是按时施用抗原性结核分子和其他的化 合物(例如，免疫刺激化合物)以完成特异性结核免疫应答，如 本发明中所述。本发明所述的方法对化合物的施用顺序没有限 制，只要该化合物的施用足够及时，能产生所期望的效果即可。
本发明所述的药物组合物和疫苗的给药路径以及给药频率 和剂量可以才艮才居不同的个体而改变，并且可以与通常用于免疫接
种的卡介苗(BCG)并朽"使用。通常，上述药物组合物和疫苗可 以通过注射方式(例如，皮内注射，月几肉内注射，静月永内注射或 者皮下注射)、鼻内方式(例如，通过抽吸)、肺内方式、或者口 月良方式给药。可以施用一剂到三剂的剂量，持续1-36周时间。 优选的，每3-4个月时间施用三剂的剂量，之后周期性的进行 疫苗的接种。对不同的患者使用不同的方案是恰当的。当按照上 述方法进行施用时，能够在免疫型患者体内激发足以保护患者在 至少1-2年内不受结核分枝杆菌感染的免疫应答的剂量的多肽 或者DNA的量是合适的剂量。通常，每千克宿主体内存在的多 肽的剂量(或者通过DNA原位生成的剂量)是大约1匹克至大 约100毫克，典型的是大约10匹克至大约1亳克，优选的是大 约100匹克至大约1微克。合适的剂量会根据患者的体重而有所 不同，但是通常是在大约0.1毫升至0.5毫升之间。
实施例
实施例1:与主要组织相容性复合体(MHC) l级分子相关
的结核分^i干菌肽
探测体内感染型小鼠巨噬细胞中的主要组织相容性复合体1 级分子相关的结核分枝杆菌肽，来识别其感染的微生物制剂。
在被感染细胞中寻找与主要组织相容性复合体1级分子相关 的结核分枝杆菌抗原的理论依据是基于下述事实这些宿主细胞 分子是将抗原呈递至CD8+T细胞的至关重要的分子，CD8+T细 月包是T细胞的子集，能够抵抗结核。因此，这种探索抗原的方法对于抵抗这种疾病的疫苗的形成方法产生直直的影响。
上述主要组织相容性复合体1级分子相关的结核分枝杆菌肽 是从C57BL/6小鼠的粘着性脾细胞中分离得到的，所述的 C57BL/6小鼠是被107CFU (菌落形成单位)个结核分枝杆菌感 染过的。C57BL/6小鼠被认为是相对抵抗结核分枝杆菌感染的， 因此是用于该项研究的理想材料。4吏用高4妄种量进行感染是重要的，能够在试一验动物的脾细月包内形成高度细月包内感染。在感染之 后的10天至14天时，被感染小鼠的脾脏里含有的细胞比未经感 染的小鼠脾脏里的细胞多5倍。这些脾细胞中4艮大一部分是感染 了结核分枝杆菌的巨噬细胞。将小鼠处死并获得它们的脾粘连细 月包，使用CHAPS清洁剂(Boehringer Mannheim 公司，印第安纳 波利斯，IN)对其进4亍裂解，并使用G蛋白琼脂糖凝胶柱通过亲 和纯化分离主要组织相容性复合体1级分子，该分子与抗H-2 K/Db单克隆抗体(ATCC HB-ll)发生了连接。附图3中概述了这一过程。
将洗提得到的肽通过5kDa截流分子量的Millipore Ultrafree -CL进行超滤，其中所述的肽包括小于5 kDa的分子混合物， 超滤之后再通过樣史孑L反向高效液相色i普(Delta-Pak C18斗主， 300A孔隙，5微米粒子)进行分馏。得到的高效液相色谱曲线呈 现出几个峰值，使用毛细管液相色谱以及电喷雾质谱耦联的装置 (LC-MS)对每个峰值进行分析，从而测定分子量以及全部类型 的肽的分布量。之后，通过石並撞活化解离(CAD)串联质^普 (MS/MS)获得4美选肽的质量。
测定上述肽序列与结核分枝杆菌数据库以及鼠类染色体组 数才居库(The Institute for Genomic Research染色体纟且研究学会) 中的已知蛋白之间的同一性。其中几种肽与鼠类蛋白具有很高的 同源性。然而，有7种肽和核酸序列4皮鉴定为是来源于结核分^支 杆菌的(附图1 )。使用标准，技术将编码这些肽蛋白供体的相应基 因进行克隆并且被表达。除此之外，制备含有这些结核分枝杆菌 基因的细菌质粒DNA。这些重组蛋白以及质粒DNA都将净皮应用 于免疫学草案中，目的在于调查这些分子具有的保护小鼠4氐抗恶 性结核分枝杆菌的保护性潜能。这种蛋白配方可以被用来测试 CD4+应答，而DNA免疫将作用于CD8+T细胞应答。
实施例2:在感染型小鼠的尿液中发现的结核分枝杆菌抗原
在感染型小鼠的尿液中探测结核分#支杆菌抗原，来识别患有 活性结核的患者尿液中的微生物抗原。
抗原探测分析与常规的血清学相反，4果测的是疾病的'ft况， 而不是宿主抗体针对疾病发病原因的应答。因此，抗原探测分析 可以作为诊断和治疗的根据。在本方案中，使用在人类患者的尿 液中识别结核分枝杆菌抗原的抗原探测方式。此外，生产并且验 i正作为活性疾病的才示i己的重《且蛋白。
将各种尿液(15亳升)》文至容量为15毫升的Vivaspin 5K MWCO (截留分子量为5K的超滤浓缩离心管)中，在4C下， 3000G过滤并且离心，直至渗余物的体积小于2毫升。^吏用6M 的尿素以及100mM的碳酸氢铵进行漂洗，将浓缩物从膜上分离。 <吏用pH为8.5的6M尿素以及100mM碳酸氬铵将最终的浓缩物 补足至4毫升。向每个蛋白浓缩样品中加入20毫升2M的DTT (二硫苏糖醇)。对样品进行涡流搅拌，并且在37。C下培养1小时。 通过向每个样品中添加200毫升0.5M的碘乙酰胺，使还原的半 胱氨酸发生烷基化。对样品进行涡流搅拌，并且在室温环境下避 光反应1小时。4吏用15毫升的2M的DTT (二辟b苏糖醇)4中制 残余的橫乙酰胺。从4毫升原料样品中取出300微升用来进行胶 体分析。
使用装配有IO倍微距镜头的Kodak DC280数码相机拍才聂凝 月交的照片。使用Adobe Photoshop对该照片进行处理并且将照片 打印出来。4吏用干净的刀片将凝胶切成33个凝胶薄片，同时标 记每个薄片上的切点位置。之后，将薄片放置于2毫升的离心管 中。在双重隔离的生物安全拒中完成对所有样品的进一步处理。 使用50%的甲醇和5°/。的乙酸将装有凝胶薄片的管填充至2毫 升，并且再使用等量的50%的甲醇和5%的乙酸漂洗三次。倒出 褪色的溶液，并且在管中填充2毫升的乙腈。振荡30分4中后， 倒出乙腈，取而代之的是100mM的碳酸氢铵。30分钟之后，倒 出碳酸氢钠溶液，并且在管中装满乙腈。将这种乙腈、碳酸氢铵 漂洗步骤重复进行一次。在消化反应之前倒出最后的乙腈洗液， 并且在真空离心浓缩系统(speedvac)中将凝胶薄片干燥30分钟。 将装有干燥的凝月交薄片的管置于冰上进4亍冷却。在冰冻的50mM 碳酸氢铵中溶解Promega测序级胰蛋白酶，达到13.3毫克/毫升 的浓度。利用可重复^f吏用的移液器将125毫升的力夷蛋白酶溶液加 入到每个管的底部。使凝胶薄片在冰上溶胀15分钟，在此之后
再向每个管中加入125毫升50mM的碳酸氢铵。然后将管密封， 并且在37。C下培养16小时。消化反应之后，向每个管中加入650 毫升50mM的碳酸氳铵。之后，在37。C下对样品进行培养1小 时。取出第一批提取物，将其置于Axygen商标的1.5毫升的管 中，使用650毫升的碳酸氬铵进行第二次提取，并将得到的提取 物与第一批提取物混合。之后，把这些提取物冻干，同时使用650 毫升50%的乙腈以及0.1%的蚁酸进行两次酸式提取。将所有提 取物冷冻至-80°C ,并且在ThermoSavant SC280真空离心浓缩 系统中在小于10mTorr(毫托)的压力下冻干至千燥。将得到的 冻干物重新溶解于200毫升5%的乙腈以及0.1 %的蚁酸中。将适 当体积的每种提取物(1-6, 10毫升)(7-12, 20毫升)(13 -18, 35毫升)(19-33， 50毫升)加入到96孔i咅养斧反中，4吏其 接近蛋白体积摩尔浓度以及来自于每个凝胶分子量区域的蛋白， 将培养纟反冷冻至-80°C,并且再次冻干。将所有样品重新溶解于 12毫升5%的乙腈以及O.l %的蚁酸中。
然后，对样品进行质谱分析，〗吏用来自于Thermofinnigan (菲 尼根)蛋白质组X工作站的LCQ DECA XP plus (液相质谱联用 4义)。每运行一次分析，都使用Famos自动进样器注入每种重新 构建的样品IO毫升，而分离的过程是在装填有C18介质的75毫 米内径xl8厘米高的柱中完成的，分离过程中的流速为每分钟 235纳升(nL)，这种流速是由带有液体分流器的Surveyor液相 色谱输液泵提供的，在90分钟(2.5小时的运行)、180分钟(4 小时的运行)、或者400分钟(8小时的运行)中以梯度形式逐渐 供给5-60%的水，0.1%的蚁酸，乙腈，0.1%的蚁酸。
在对每组样品进行分析之前，使用两种标准的5 Angio混合 肽(Michrom Bio Resources )来确定柱的性能，并且》见察可能发 生的任《可潜在的转移。在LCQ中对前五种构型进4亍一次质i普
(MS )扫描和五次串联质i普(MS/MS )扫描。将动态排阻(Dynamic exclusion) i殳置为1,时限为30秒。在Bioworks 3.1搜索软件中 使用Suquest进行肽的识另'J 。在NCBI (美国国立生物4支术信息中 心)RefSeqHuman数据库中，使用差式脲曱基半胱氨酸和氧化型 甲硫氨酸进行Sequential数据库的检索，在此之后使用差式修饰 4勿(differential modifications)进4亍进一步的检索。4吏用Sequest 软件在RefSeqHuman Gnomon predicted protein数据库中进行二 级检索。这一次，已知蛋白(实验蛋白)和理论蛋白相吻合，不 需要将全部数据的统计学显著性进行折衷。当单电荷离子的 Xcorr (互相关系数)为1.8，双电荷离子的Xcorr为2.5,以及三 电荷离子的Xcorr为3.0时，并且delta CN ( ACN)值等于0.1， RSP值等于1时，选定肽打分临界值。每种肽的互相关值确保其 在不同电荷的情况下《呆持高置^f言度的匹配，而delta CN ( ACN) 临界值确保了相吻合的肽的唯一性。RSP值为l确保了肽在初级 打分时与最接近的肽相吻合，从而肽碎片文件只能与一种蛋白相 匹配。使用这种方法，识别出几种人类的肽，但最重要的是，迄 今为止，我们能够从六种被研究的尿液样品中的三种中识别至少 五种结核分4支杆菌肽。上述被识别的肽序列中的 一 种 (MVIIELMRR-序列30)与结核分枝杆菌蛋白的推导序列具有 相同的同源性(附图2 )[The Institute for Genomic Research( TIGR ) (染色体组研究学会)，以及SWISS-PROT/TrEMBL AC #033183]。 还识别到了其〗也四个序列，序列34，序列38,序列42，序列46， 分别表示于附图5-附图9中。这些肽序列是从6个结核患者的 尿液样品中的3个样品中发现的。从结核分枝杆菌染色体组DNA 中设计并合成PCR引物，并将其用来扩增编码该蛋白的全长基 因。得到一个DNA片段(大约lkb)，在其5，端具有一个Nde I <立点，并且在其3，端具有一个Bam HI位点，并普遍用其来克隆 和表达上述基因。 实施例3:结核分枝杆菌重组蛋白的生产、纯化以及定义
已经做了大量的努力来生产、纯化并且定义复制品重组蛋 白，这些重组蛋白是在肺结核患者尿液中发现的5种结核分枝杆 菌蛋白的复制品，如本发明所述。已经获得了这些蛋白中的三种 (MTP1694(序歹'j 42 ), MTP2462 (序歹'J 46 )),以及(MT2990(序 列38)),并且定义了它们的生化特性和生物特性。这三种蛋白是 从内含体中纯化出来的，其产量是每升诱导培养液中产生10到 15毫克的纯化蛋白。附图10描述了三种重组分子MT1694， MT2462以及MT2990在大肠杆菌中的过表达，并且表示出它们 在凝月史中发生迁移，迁移到与它们所预计的分子量(MW)相对 应的位置上。重组蛋白在含有6个组氨酸标签的氨基末端残基的 大肠杆菌BL-21(DE3)/pLysS宿主细胞中表达。使用Ni-NTA琼脂 糖介质通过亲和层析对蛋白进行纯化。使用SDS-PAGE (聚丙烯 酰胺凝胶电泳)(4 - 20 %的梯度聚丙烯酰胺凝胶)对纯度进行评 价，并进行考马斯亮蓝染色。由于MT2990基因编码一个分子量 为130.6 kDa的蛋白，作为重组蛋白，这是一个难以表达的分子 大小，因而克隆并且表达该分子的重叠形式/截短形式。附图10 中描述的经过克隆和表达的蛋白代表全长基因的一个片段，其跨 越了 100个氨基酸，结核分枝杆菌蛋白(MT2990)的上游氨基 酸序列以及下游氨基酸序列与在结核患者的尿液中发现的肽具 有相同的同源性。这个分子的片段被选定，因为这一部分蛋白是 稳定的并且能够4氐抗宿主的蛋白水解酶机制，因此是疫苗目标 物。
已经生产出MTP1694以及MTP2462重组蛋白的兔类抗血 清，因此MT2990的抗血清可以-故生产并且已经被生产出来。 MTP1694以及MTP2462的抗血清被用来验证识別的蛋白是否是 真正的结核分枝杆菌分子，这个过程可以通过Western印迹分析
来完成，使用结核分枝杆菌抗原的粗抗原性样品(全细菌细胞提
取物)以及培养滤液(CF )或者培养滤液抗原(由Dept. Microbiol. Immunol. Pathol.， Colorado State University, Fort Collins CO提 供)。在还原条件下，在4-20%的梯度凝胶中对抗原进行电泳分 析，将抗原转移到硝酸纤维素膜上，之后使用兔类抗MTB1694 抗血清或者抗MT2462抗血清进《亍探测。 <吏用过氧化物酶标i己的 山羊4元兔类(goat - anti - rabbit)免疫^求蛋白对抗原的反应原性 进行探测，并且4吏用化学发光试剂(ECL)对其进行显影。附图 11表明，抗MTP1694抗血清在分4支杆菌裂解物以及培养滤液才羊 品中识别出一段大约37kDa的抗原(1号泳道和2号泳道)以及 所期望的重组蛋白(3号泳道)。与此相反，抗MTP2462抗血清 仅仅在细菌裂解物中识别出一段大约27kDa的抗原，并没有在培 养滤液中识别出蛋白。两个抗原的分子量区域都与预测的分子量 相匹配。除此之外，重组分子的分子量稍樣i:高于天然分子，这种 结果是可以预计的，因为除了含有天然分子所具有的序列之外， 重组分子还具有一段16个氨基酸的延伸(6个组氨酸形成的标 签，^使其易于纯化，以及一个凝血酶位点，由10个氨基酸组成， 用来清除组氨酸标签)，来自于克隆载体。因此这些结果证明了 MTP1694以及MTP2462都是真正的结核分枝杆菌蛋白，是在细 菌生长的过程中净皮积^ L的生产出来的。除此之外，由于抗原 MTP2694存在于培养滤液样品中("结核分枝杆菌分泌蛋白")， 这个结果表明该分子作为疫苗是有效的。
为了对识别出的抗原作为作用于人类的疫苗所产生的作用 进行评价，分析外周血单个核细胞(PBMC)对这些抗原的应答， 其中所述外周血单个核细胞来自于健康的纯蛋白衍生物(^吏用纯 蛋白衍生物对针对结核蛋白的应答进行皮下测试)阳性供体。迄 今为止，已经使用MTP1694抗原和MTP2462抗原对四种^:康的 纯蛋白衍生物阳性供体和一种纯蛋白衍生物阴性供体进行了测
试。在这些测试进4亍的时候还无法获得上面提及的重组蛋白
(MT29卯)。为了对抗原的识别进行测试，在使用重组抗原(5 微克/毫升)进行刺激之后，既要利用诱导扩增应答的抗原，也要 利用诱导生成干扰素-Y的抗原。通过[3H]TdR (氚-胸腺嘧啶 核苷)渗入法来测量扩增情况，测量结果使用每分钟计婆t(CPM) 来表示。通过在培养上清液中进行夹心酶联免疫吸附测定来测量 干扰素-Y。测量结果表示在附图12A和12B中，上述结果表 明，在四个纯蛋白衍生物阳性供体中，有三个阳性供体的外周血
单个核细胞能够容易的识别上述两种抗原。在来自于纯蛋白衍生 物阴性供体的外周血单个核细胞中观察不到应答。这些结果提示
了上述抗原能够被含有高百分含量的健康的纯蛋白衍生物的阳 性个体所识別H叚定的有抵抗力的)。除此之外，由于干扰素-
Y的生成伴随着扩增应答的发生，MT1649和MT2462与针对结 核的保护相关，因此这些分子都是疫苗目标物。
这里引用的全部文献、专利和/或专利申请的相关教导的全部 内容在此引入作为参考。
下述专利文件中教导的全部内容在此引入作为参考名称为 "Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis antigens and their uses (结核分枝杆菌抗原的融合蛋白及其应用)"的美国专利 No.6627198;名称为"Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use(用于进行结核诊断和免疫 治疗的化合物及其使用方法)"的美国专利No.6613881;名称为 "Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis (用于进4亍结核的it断和免疫治疗的化合物及方法)" 的美国专利No.6592877;名称为"Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods of their uses (用于进4亍结^ti貪断的4t合 物及其4吏用方法)"的美国专利No.6555653;名称为"Fusion
proteins of Mycobacterium tuberculosis antigens and their uses (结 核分4支杆菌抗原的融合蛋白及其应用)"的美国专利No.6544522; 名称为 "Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis (诊 断结核的化合物及方法)"的美国专利No.6458366;名称为 "Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis (诊断结核 的化合物及方法)"的美国专利No.6338852;以及名称为 "Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis (用于进行结核的"^断和免疫治疗的化合物及方法)" 的美国专利No.6290969。
尽管本发明参照优选的实施方式进行了详细的公开和描述， 本领域r汰术人员应该理解，在其基础之上对细节和形式上进4亍的 任何改变都不会背离由随后的权利要求所限定的本发明的范围。
权利要求
1.一种分离的多肽分子，包括结核分枝杆菌抗原的免疫原部分，或者所述抗原的变体的免疫原部分，该变体的区别仅仅在于发生了保守性替代和/或修饰，其中所述抗原具有选自下面组中的氨基酸序列a)由核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述核酸分子具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的序列、或者上述序列的组合所形成的序列；b)由核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述核酸分子具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的编码区域、或者上述序列的组合所形成的编码区域；c)由序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的互补序列、或者上述序列的组合所形成的序列的互补序列编码的氨基酸序列；d)由核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述核酸分子与序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的序列、或者上述序列的组合所形成的序列进行了杂交；以及e)序列2、序列4、序列6、序列8、序列1O、序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、序列38、序列40、序列42、序列44、序列46、序列48所示的氨基酸序列、或者具有上述序列的组合所形成的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的分离的多肽分子，其中所述的分离的 多肽分子在宿主体内刺激免疫原特异性结核细菌(TB )应答。
3. —种分离的多肽分子，包括结核分枝杆菌抗原的免疫原部 分，其中所述抗原具有选自下面组中的氨基酸序列a)由 核酸编码的氨基酸序列，其中所述4t酸与序列1、序列3、 序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列 17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列 29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列 41、序歹'J43、序列45、序列47所示的序列、或者上述序列 的组合所形成的序列具有大于或者等于大约70 %的序列同 一性；b)由核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述核酸分 子与序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序 列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序 列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序 歹'J 37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47/斤示 序列的编码区域、或者上述序列的组合所形成的序列的编码 区i或具有大于或者等于大约70%的序列同一性；c)由互补 序列编码的氨基酸序列，其中所述互补序列与序列1、序列 3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、 序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、 序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、 序歹'J41、序歹ij 43、序歹寸45、序歹'J 47戶斤示的序歹'J、或者上述 序列的组合所形成的序列具有大于或者等于大约70%的序 列同一性；d)由核酸分子编码的氨基酸序列，其中所述核 酸分子与杂交于序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、 序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、 序歹'J 23、序列25、序歹'J 27、序列29、序歹'J 31、序列33、 序歹'J 35、序歹'J 37、序列39、序列41、序列43、序列45、大约70%的同一性；以及e)与序列2、序列4、序列6、序 列8、序列10、序列12、序列14、序列16、序列18、序列 20、序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列 32、序列34、序列36、序列38、序列40、序列42、序列 44、序列46、序列48声斤示的序列、或者具有上述序列的纟且 合所形成的序列具有大于或者等于大约7 0 %相似性的氨基 卧复序列。
4. 根据权利要求3所述的分离的多肽分子，其中所述的分离的 多肽分子在宿主体内剌激免疫原特异性结核细菌应答。
5. 根据权利要求3所述的分离的多肽分子，其中所述的核酸分 子分别与所述的序列具有大于或者等于大约80%的同一性 或者相似性。
6. 根据权利要求5所述的分离的多肽分子，其中所述的核酸分 子分别与所述的序列具有大于或者等于大约90%的同一性 或者相4以小生。
7.—种编码多肽分子的分离的核酸分子，其中所述的多肽分子 包4舌结核分枝杆菌抗原的免疫原部分，或者所述抗原的变体 的免疫原部分，该变体的区别仅仅在于发生了保守性替代和 /或4务饰，其中编码所述抗原的核酸分子具有选自下面组中的 序列a)序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、 序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、 序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、 序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所 示的序列，或者上述序列的组合序列；b)序列l、序列3、 序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列 17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列 29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列 41、序歹'J43、序列45、序列47所示序列的编石马区i或、或者 上述序列的组合所形成的序列的编码区域；c)序列1、序列 3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、 序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、 序歹ij 29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、 序列41、序列43、序列45、序列47所示序列的互补序列、 或者上述序列的组合所形成的序列的互补序列；d)与序列1、 序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列 15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列 27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列 39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的序列、或者 上述序列的组合所形成的序列进行杂交的序列；以及e)编 石马序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、序 列14、序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、序 列26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、序 歹'J 38、序列40、序列42、序列44、序列46、序列48所示 的序列、或者编码上述序列的组合序列的序列。
8. 才艮据权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述的分离的 核酸分子编码的多肽分子在宿主体内刺激免疫原特异性结 核应答。
9. 根据权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述的核酸分 子是RNA分子。
10. —种编码多肽分子的分离的核酸分子，其中所述的多肽分子 包括结核分枝杆菌抗原的免疫原部分，其中编码所述抗原的%的同一性a)序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、 序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、 序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、 序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、 序列47所示的序列，或者上述序列的组合序列；b)序列1、 序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列 15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列 27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列 39、序列41、序列43、序列45、序列47所示序列的编石马区 域、或者上述序列的组合所形成的序列的编码区域；c)序 列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、 序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、 序列27、序歹ij 29、序歹'J 31、序列33、序列35、序列37、 序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示序列的 互补序列、或者上述序列的组合所形成的序列的互补序列； d)与序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、 序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、 序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、 序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所 示的序列、或者上述序列的组合所形成的序列进4亍杂交的序 歹'J;以及e)编石马序列2、序列4、序列6、序列8、序歹'J 10、 序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、 序歹'J 24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、 序列36、序列38、序列40、序列42、序列44、序列46、 序列48所示的序列、或者编码上述序列的组合序列的序列。
11. 根据权利要求15所述的分离的核酸分子，其中所述的核酸 分子与所述序列具有大于或者等于大约80%的同一性。
12. 才艮据权利要求16所述的分离的核酸分子，其中所述的核酸 分子与所述序列具有大于或者等于大约90%的同一性。
13. —种载体或者质粒，其中包括权利要求7所述的核酸分子。
14. 一种宿主细月包，其<吏用权利要求7所述的核酸序列进行转染。
15. —种抗体，其与权利要求1所述的多肽相结合。
16. —种融合蛋白，包4舌选自下面组中的多肽a)斥又利要求1 中所述的多肽中的至少一种；b)权利要求1中所述的多肽 中的至少两种；c)权利要求1中所述的多肽中的至少一种， 和一种已知的结核分枝杆菌抗原；以及d)权利要求1中所 述的多肽中的至少一种，和一种存在于主要组织相容性复合 体2级分子中的结核分枝杆菌抗原。
17. 刺激个体中的特异性免疫原性结核应答、或者预防或缓解结 核疾病的严重禾呈度的方法，该方法包4舌施用 一定量4又利要求 1中所述的一种或者一种以上多肽分子。
18. 才艮据权利要求17所述的方法，其中所述的多肽分子或者核 酸分子通过载体进4亍施用。
19. 剌激个体中的特异性免疫原性结核应答、或者预防或緩解结 核疾病的严重程度的方法，该方法包括施用一定量权利要求 7中所述的一种或者一种以上核酸分子。
20. 对个体的结核疾病的治疗进行监控的方法，该方法包括a) 在来自于所述个体的样品中探测权利要求1中所述的一种或 者一种以上多肽分子的水平；并且b)将上述一种或者一种 以上分子的水平与标准水平进行比较；其中高于标准水平的 分子水平表明该治疗是无效的，而低于或者等于标准水平的 水平表明该治疗是有效的。
21. 对个体的结核疾病的治疗进行监控的方法，该方法包括a) 在不止一个时间点上探测样品中存在的权利要求1中所述的 一种或者一种以上多肽分子的水平；并且b)将上述一个或 者一个以上时间点上探测到的水平进行比较，其中分子水平 的增加表明该治疗是无效的，而分子水平的降低或者不变则 表明该治疗是有效的。
22. 在个体中诊断结核疾病的方法，该方法包括探测权利要求1 中所述的一种或者一种以上多肽分子是否存在。
23. 区分个体内结核疾病以及对结核疾病的免疫性的方法，该方 法包括a)探测权利要求1中所述的一种或者一种以上多 肽分子的存在或缺失；以及b)测定个体中结核特异性免疫 应答的刺激作用。
24. 才艮据权利要求23所述的方法，其中测定个体中结核特异性 免疫应答的剌激作用包4舌测定来自于所述个体的^f羊品中的 细胞扩增，白细胞介素-12的生成，干扰素-Y的水平，或 者上述因素的组合。
25. 在生物才羊品中探测结核分^支杆菌感染的方法，该方法包4舌测 定所述样品中是否存在4又利要求1所述的一种或者一种以上 多肽分子，该分子的存在表明存在结核分枝杆菌感染；而该 分子的不存在则表明不存在结核分^U干菌感染。
26. 在生物样品中纟果测结核分枝杆菌感染的方法，该方法包括 a)爿夸才羊品与一种抗体相接触，所述抗体与^又利要求1所述 的多肽分子相结合，使样品与抗体充分接触形成复合体，从 而得到抗原-抗体复合体；并且b )纟采测所述抗原-抗体复 合体；其中，上述复合体的存在则表明结核分枝杆菌感染的 存在，上述复合体的不存在则表明结核分枝杆菌感染的不存 在。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述抗体是经过可探测 寸生才示i己的。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中该方法进一步包括将样 品与第二抗体相^妄触，所述第二抗体对所述抗原或者抗原-抗体复合体具有特异性。
29. 才艮据权利要求28所述的方法，其中所述的多肽或者抗体结 合于固体载体之上。
30. 才艮据权利要求26所述的方法，其中所述的生物样品是尿液。
31. 在生物样品中探测结核分枝杆菌感染的方法，该方法包括 a)在聚合酶链式反应中使该样品与至少两个寡核苷酸引物 进4亍接触，其中至少一个寡核苷酸引物对于权利要求7中的 一种或者一种以上分离的核酸分子是具有特异性的，能够充 分允i午该引物进4亍扩增；并且b)探测该才羊品中扩增的核酸 序列；其中，存在扩增的核酸序列，则表明结核分枝杆菌感 染的存在，不存在扩增的核酸序列，则表明结核分枝杆菌感 染的不存在。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述的至少一个寡核苷 酸引物包括至少大约IO个连续的碱基。
33. 在生物才羊品中纟笨测结一亥分4支才干菌感染的方法，该方法包4舌 a)使该样品与一种或者一种以上寡核苦酸探针进行接触， 所述寡核苷酸探针在高度严格的条件下特异于权利要求7中 的核酸分子，充分允许样品与4果针发生杂交；并且b)在样 品中探测与所述寡核苷酸探针进行杂交的核酸分子；其中， 存在探针的杂交则表明结核分枝杆菌感染的存在，不存在探 针的杂交则表明结核分枝杆菌的不存在。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述的探针包括至少大 约15个连续的碱基。
35. —种组合物，包括权利要求1所述的多肽序列和生理可接受 性载体。
36. 才艮据权利要求35所述的组合物，其进一步包括免疫应答增 强剂。
37. 根据权利要求36所述的组合物，其中所述的免疫应答增强 剂是佐剂或者其他的结核抗原。
38. 根据权利要求37所述的组合物，其中所述的组合物是疫苗 组合物。
39. 根据权利要求35所述的组合物，其中所述的佐剂包括选自 3D-MPL和QS21中的至少一种纟且分。
40. 根据权利要求35所述的组合物，其中所述的组合物被制成 7jc包油乳液的形式。
41. 才艮据权利要求36所述的组合物，其中所述的免疫应答增强 剂是免疫刺激性细胞因子或者趋化因子。
42. —种用于诊断人体是否患有结核分枝杆菌感染的试剂盒，所 述试剂盒包括用来探测权利要求1所述的多肽分子的一种或 者一种以上试剂。
43. —种试剂盒，包4舌a) —种或者一种以上核酸分子，所述 核酸分子具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序 列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序 歹'J 23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序 歹'J 35、序歹'J 37、序歹'J 39、序列41、序列43、序歹'J 45、序 列47所示的序列，或者上述序列的组合序列；上述序列的 互4卜序列，以及与序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、 序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、 序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、 序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、 序列47所示的序列、或者上述序列的组合序列进4于杂交的 才亥酸序列；以及b)探测-试剂。
44. 一种药物组合物，包括权利要求1所述的多肽，以及载体。
全文摘要
本发明涉及分离的结核(TB)抗原，所述的结核抗原能够被有效应用于刺激结核(TB)特异性免疫应答的治疗组合物和疫苗组合物中。上述被鉴定的抗原同样可以有效的应用于诊断检测中，用以确定个体中的活性结核的存在。因此，本发明包括多肽分子，核酸分子，疫苗组合物，诊断检测，以及对这些结核(TB)抗原的诊断方法，和对于针对这些结核(TB)抗原的治疗方法的监控。
文档编号G01N33/569GK101365714SQ200680026910
公开日2009年2月11日 申请日期2006年6月29日 优先权日2005年7月1日
发明者安东尼奥·坎波斯-尼托, 苏利·S·凯什诺 申请人:福赛特儿童口腔医院